CN114740194A - 一种试剂盒、以及胃蛋白酶原ii的检测方法 - Google Patents

一种试剂盒、以及胃蛋白酶原ii的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114740194A
CN114740194A CN202210357344.2A CN202210357344A CN114740194A CN 114740194 A CN114740194 A CN 114740194A CN 202210357344 A CN202210357344 A CN 202210357344A CN 114740194 A CN114740194 A CN 114740194A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pepsinogen
reagent
kit
monoclonal antibody
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210357344.2A
Other languages
English (en)
Inventor
罗晓梅
黄金浪
唐灿
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Tianchen Medical Technology Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Tianchen Medical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Tianchen Medical Technology Co ltd filed Critical Shenzhen Tianchen Medical Technology Co ltd
Priority to CN202210357344.2A priority Critical patent/CN114740194A/zh
Publication of CN114740194A publication Critical patent/CN114740194A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57446—Specifically defined cancers of stomach or intestine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96472—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
    • G01N2333/96475—Aspartic endopeptidases (3.4.23) with definite EC number
    • G01N2333/96477—Pepsin (3.4.23.1; 3.4.23.2; 3.4.23.3)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种试剂盒、以及胃蛋白酶原II的检测方法，涉及检测试剂盒技术领域。所述试剂盒包括第一试剂、第二试剂、发光底物液以及胃蛋白酶原II校准品，其中，所述第一试剂包括包被有胃蛋白酶原II单克隆抗体的疏水性羧基磁珠和第一缓冲液；所述第二试剂包括酶标记的胃蛋白酶原II单克隆抗体和第二缓冲液。本发明通过采用酶促化学发光技术、以及选用疏水性羧基磁珠，使得到的试剂盒的稳定性好、灵敏度高、线性范围宽，且不需要任何光源照射，分析结果稳定可靠，反应速度快，操作简单，自动化程序高，可同时进行大批量的测试，在临床应用中更快捷、高效。

Description

一种试剂盒、以及胃蛋白酶原II的检测方法
技术领域
本发明涉及检测试剂盒技术领域，特别涉及一种试剂盒、以及胃蛋白酶原II的检测方法。
背景技术
胃蛋白酶原(PG)即胃蛋白酶的无活性前体，由375个氨基酸组成的蛋白多肽链构成，相对分子质量约为42×103，Samloff根据其生化性质和免疫原性，分为2个亚群，1～5组免疫原性近似，称为胃蛋白酶原Ⅰ(PGI)，主要由胃黏膜细胞及颈黏液细胞分泌；6～7组被称为胃蛋白酶原Ⅱ(PGII)，主要分泌于全胃腺体及十二指肠Brunner腺，胰腺和前列腺也可少量表达。
幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori，HP)感染和萎缩性胃炎是与胃癌密切相关的两种病变，HP感染是萎缩性胃炎的主要病因之一，而萎缩性胃炎已被普遍认为是胃癌的癌前病变。在由HP感染-萎缩性胃炎-胃癌的发展连锁中，均伴随着胃蛋白酶原(PG)的变化。而且后者已成为前面三种病变的良好诊断指标，以及治疗和预防干预过程中的监测指标。鉴别性功能分析显示，血清学判断胃底粘膜组织学状态的最佳指标是PGI/PGII比值和PGII绝对值相结合，它对胃底粘膜状态判断的总灵敏度与阳性预示值为70％，有胃底腺粘膜"血清学活检”的美称。2009年8月，由卫生部疾控局颁布的《中国癌症筛查及早诊早治技术方案》一书中，明确将PGI和PGII作为胃镜前检测和胃癌筛查的判断标准。
目前，检测胃蛋白酶原Ⅱ的方法包括酶联免疫吸附法、免疫比浊法、荧光免疫层析法、化学发光免疫反应法等。其中，酶联免疫吸附法在实际应用中，敏感度相对较低，且只能定性或半定量检测，不能动态观察PG II的变化，且检测时间长，不能实现自动化操作；免疫比浊法是指直接检测和记录分析物的浓度，该方法通过检测光密度值的变化来检测分析物的物理浓度，其检测灵敏度较低，很难满足临床需要；荧光免疫层析法包括直接法和间接法，直接法的敏感性偏低，且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体，若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体，间接法的敏感性较高，比直接法高10倍左右，制备一种荧光标记抗体可应用于多种一抗，但其参加反应的因子较多，使产生非特异性染色的机会增多，且试剂与仪器成本较高；化学免疫发光法的稳定性差，无法普及中基层医院及医疗机构。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种试剂盒、以及胃蛋白酶原II的检测方法，旨在提供一种稳定性好的用于检测胃蛋白酶原II的试剂盒。
为实现上述目的，本发明提出一种试剂盒，所述试剂盒包括第一试剂、第二试剂、发光底物液以及胃蛋白酶原II校准品，
其中，所述第一试剂包括包被有胃蛋白酶原II单克隆抗体的疏水性羧基磁珠和第一缓冲液；
所述第二试剂包括酶标记的胃蛋白酶原II单克隆抗体和第二缓冲液。
可选地，所述包被有胃蛋白酶原II单克隆抗体的疏水性羧基磁珠中，每1mg疏水性羧基磁珠对应包被5～40μg胃蛋白酶原II单克隆抗体；和/或，
所述酶标记的胃蛋白酶原II单克隆抗体中，所述胃蛋白酶原II单克隆抗体与所述酶的质量比为5：6～10。
可选地，所述第一缓冲液包括MES、吐温-20、Proclin300、NaCl和BSA，且pH值为5.8～6.2。
可选地，所述第一缓冲液包括：50mM MES、0.1％吐温-20(v/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)和1.2％BSA(w/v)。
可选地，所述包被有胃蛋白酶原II单克隆抗体的疏水性羧基磁珠的浓度为0.05mg/mL～0.1mg/mL。
可选地，所述第二缓冲液包括Tris、吐温-20、甘氨酸、Proclin300、NaCl、BSA、MgCl2和ZnCl2，且pH值为7.1～7.3。
可选地，所述第二缓冲液包括：50mM Tris、0.1％吐温-20(v/v)、1％甘氨酸(w/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)、1.2％BSA(w/v)、0.6mol/L MgCl2和0.1mol/LZnCl2。
可选地，所述发光底物液包括AMPPD；和/或，
所述第二试剂中，所述酶标记的胃蛋白酶原II单克隆抗体和第二缓冲液的体积比为1：480～520。
进一步地，本发明还提出一种胃蛋白酶原II的检测方法包括以下步骤：
提供如上所述的试剂盒；
将第一试剂、第二试剂和待测样品孵育后，进行磁分离清洗，再加入发光底物液，得到待测液；
检测所述待测液的发光值，根据发光值计算出胃蛋白酶原II的含量。
可选地，所述第一试剂、第二试剂和待测样品的体积比为5：10：2。
本发明提供的试剂盒，采用酶促化学发光技术的夹心免疫测试法，待测样品中的PGII抗原和顺磁性微粒上包被的PGII抗体及酶标记的PGII抗体结合物反应，形成夹心(抗体-抗原-抗体)复合物，在磁场作用下，夹心复合物吸附到反应管壁，未结合的物质被清洗液洗去，向夹心复合物中加入发光底物液，通过发光值即可计算出PGII的含量；以疏水性羧基磁珠超顺磁性微粒，疏水性羧基磁珠表面的羧基可以与含有氨基的抗体直接进行化学结合形成酰胺键，使包被有PGII单克隆抗体的疏水性羧基磁珠的稳定性好。通过采用酶促化学发光技术、以及选用疏水性羧基磁珠，使本发明提供的试剂盒的稳定性好、灵敏度高、线性范围宽，且不需要任何光源照射，分析结果稳定可靠，反应速度快，操作简单，自动化程序高，可同时进行大批量的测试，在临床应用中更快捷、高效。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中的试剂盒的线性范围测试结果图；
图2为本发明实施例1中的试剂盒的临床样本测试对比图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提出一种试剂盒，用于检测胃蛋白酶原II的含量，在一实施例中，所述试剂盒包括第一试剂、第二试剂、发光底物液以及胃蛋白酶原II校准品，其中，所述第一试剂包括包被有胃蛋白酶原II单克隆抗体的疏水性羧基磁珠和第一缓冲液；所述第二试剂包括酶标记的胃蛋白酶原II单克隆抗体和第二缓冲液。
本发明提供的试剂盒，采用酶促化学发光技术的夹心免疫测试法，待测样品中的PGII抗原和顺磁性微粒上包被的PGII抗体及酶标记的PGII抗体结合物反应，形成夹心(抗体-抗原-抗体)复合物，在磁场作用下，夹心复合物吸附到反应管壁，未结合的物质被清洗液洗去，向夹心复合物中加入发光底物液，通过发光值即可计算出PGII的含量；以疏水性羧基磁珠超顺磁性微粒，疏水性羧基磁珠表面的羧基可以与含有氨基的抗体直接进行化学结合形成酰胺键，使包被有PGII单克隆抗体的疏水性羧基磁珠的稳定性好。通过采用酶促化学发光技术、以及选用疏水性羧基磁珠，使本发明提供的试剂盒的稳定性好、灵敏度高、线性范围宽，且不需要任何光源照射，分析结果稳定可靠，反应速度快，操作简单，自动化程序高，可同时进行大批量的测试，在临床应用中更快捷，高效。
较优地，所述包被有胃蛋白酶原II单克隆抗体的疏水性羧基磁珠中，每1mg疏水性羧基磁珠对应包被5～40μg胃蛋白酶原II单克隆抗体，如此，能充分利用疏水性羧基磁珠和胃蛋白酶原II单克隆抗体，且疏水性羧基磁珠与胃蛋白酶原II单克隆抗体的结合稳定。
对于第一缓冲液的具体组分，本发明不做限制，在本实施例中，所述第一缓冲液包括MES(吗啉乙磺酸)、吐温-20、Proclin300、NaCl和BSA(牛血清白蛋白)，且pH值为5.8～6.2，优选地，pH值为6.0。其中，Proclin300作为防腐剂。
进一步地，所述第一缓冲液包括：50mM MES、0.1％吐温-20(v/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)和1.2％BSA(w/v)，在上述配比下，第一试剂的稳定性、灵敏度最佳，反应效率最快。
需要说明的是，本文中的w/v指的是质量体积比，单位为g/mL，例如BSA的浓度为1.2％，即每100mL第一缓冲液中，BSA对应的质量为1.2g；v/v指的是体积比，例如吐温-20的浓度为0.1％，表示100mL的第一稀释液中包括0.1mL的吐温-20。此外，mM指的是mmol/L，例如MES的浓度为50mM，指的是第一缓冲液中，MES的浓度为50mmol/L。
在本实施例中，所述酶标记的胃蛋白酶原II单克隆抗体中，所述胃蛋白酶原II单克隆抗体与所述酶的质量比为5：6～10，也即，质量比可以为5:6、5:7、5:7.6、5:7.9、5:9、5:10等。进一步地，所述酶包括碱性磷酸酶。
优选地，所述第一试剂中，所述包被有胃蛋白酶原II单克隆抗体的疏水性羧基磁珠的浓度为0.05mg/mL～0.1mg/mL，在该浓度下，有利于胃蛋白酶原II单克隆抗体与待测样品中的PG II抗原进行反应，反应速率快。
为了使第二试剂的稳定性较好，在本实施例中，所述第二缓冲液包括Tris、吐温-20、甘氨酸、Proclin300、NaCl、BSA、MgCl2和ZnCl2，且pH值为7.1～7.3，较优地，其pH值为7.2。
甘氨酸是一种含有氨基和羧基的两性离子，具有很强的缓冲性，可以与Tris-HCl形成一个缓冲系统，维持第二缓冲液在一个相对稳定的pH范围内，使得酶标记的胃蛋白酶原II单克隆抗体始终处于一个稳定的pH范围内，从而保持其生物活性。本发明通过在第二缓冲液中加入甘氨酸，大大提高了第二试剂的稳定性。
较优地，所述第二缓冲液包括：50mM Tris、0.1％吐温-20(v/v)、1％甘氨酸(w/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)、1.2％BSA(w/v)、0.6mol/L MgCl2和0.1mol/LZnCl2，在上述配比下，第二试剂的稳定性最佳。其中，mol/L可以简写为M。
进一步地，所述第二试剂中，所述酶标记的胃蛋白酶原II单克隆抗体和第二缓冲液的体积比为1：480～520，也即，可以为1:480、1:485、1:490、1:500、1:505、1:520等，优选为1:500。
其中，所述胃蛋白酶原II校准品包括稀释液和胃蛋白酶原II。在本实施例中，提供的胃蛋白酶原II校准品浓度分别为15ng/mL、50ng/mL。
较优地，所述发光底物液包括AMPPD，AMPPD为1,2-二氧环乙烷衍生物，它是一种生物化学领域中最新的超灵敏的碱性磷酸酶底物，其特点：反应速度快，在很短时间内提供正确可靠的结果。
本发明不限制所述试剂盒具体的制备方法，只要制得的试剂盒满足上述条件即可。在一具体实施例中，所述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
(1)第一试剂的制备：取10mg疏水性羧基磁珠，重复清洗3次，每次清洗步骤为：加入1mL50mM pH为6.2的MES缓冲液，混匀之后于磁力架上静置1分钟左右之后，除去上清液；再添加1mL的50mM pH为6.2的MES缓冲液，混匀之后添加100ug的胃蛋白酶原II单克隆抗体，在室温条件下混匀1～3个小时；反应结束后加入1％、pH值为6.5的BSA缓冲液进行封闭，于磁力架上静置1分钟左右之后，除去上清液，得到包被有胃蛋白酶原II单克隆抗体的疏水性羧基磁珠；将包被有胃蛋白酶原II单克隆抗体的疏水性羧基磁珠重复清洗3次，每次清洗步骤为：添加1mL 0.1M、pH值为7.0的PBS缓冲液，混匀之后于磁力架上静置1分钟左右之后，除去上清液；清洗完成后，重悬于第一缓冲液中，得到第一试剂。
(2)第二试剂的制备：取100uL的胃蛋白酶原II单克隆抗体，加入250uL浓度为0.1M，pH值为7.0的PBS缓冲液，混匀，加入20ul新配置的10.0mg/ml EDC水溶液，活化30分钟，然后加入200ul浓度为5mg/ml的碱性磷酸酶溶液混匀，室温避光保存2小时后取出，用含1％BSA的0.1M，pH值为7.4的Tris缓冲液室温封闭反应30min，再加入0.5％磷酸二乙脂于室温下继续反应30min，用30KD的超滤柱除盐纯化，得到酶标记的胃蛋白酶原II单克隆抗体，收集的剩余体积溶液加一半甘油，保存于-20℃备用；将制得的酶标记的胃蛋白酶原II单克隆抗体重悬于第二缓冲液中，得到第二试剂。
本发明还提出一种胃蛋白酶原II的检测方法，在一实施例中，所述检测方法包括以下步骤：
步骤S10、提供如上所述的试剂盒；
步骤S20、将第一试剂、第二试剂和待测样品孵育后，进行磁分离清洗，再加入发光底物液，得到待测液；
其中，所述第一试剂、第二试剂和待测样品的体积比为5：10：2。
步骤S30、检测所述待测液的发光值，根据发光值计算出胃蛋白酶原II的含量。
在一具体实施例中，所述检测方法包括以下步骤：以全自动化学发光仪(CL-2000)为检测工具，加入100μL R2试剂与20μL的待测样品孵育5min、再加入50μL R1试剂孵育5min，得到混合液，将混合液进行磁分离清洗，清洗完后仪器自动加入300μL底物液后，得到待测溶液，将待测溶液自动移到光电模块中检测发光值，然后仪器自动转换为待测溶液中的胃蛋白酶原II浓度，并显示测试结果。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1试剂盒
所述试剂盒包括：
第一试剂：包被有胃蛋白酶原II单克隆抗体的疏水性羧基磁珠和第一缓冲液，其中，每1mg疏水性羧基磁珠对应包被10μg胃蛋白酶原II单克隆抗体，包被有胃蛋白酶原II单克隆抗体的疏水性羧基磁珠的浓度为0.07mg/mL，第一缓冲液包括：50mM MES、0.1％吐温-20(v/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)和1.2％BSA(w/v)，pH值为6.0。
第二试剂：碱性磷酸酶标记的胃蛋白酶原II单克隆抗体和第二缓冲液，其中，所述胃蛋白酶原II单克隆抗体与所述碱性磷酸酶的质量比为5：8，所述酶标记的胃蛋白酶原II单克隆抗体和第二缓冲液的体积比为1：500，所述第二缓冲液包括：50mM Tris、0.1％吐温-20(v/v)、1％甘氨酸(w/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)、1.2％BSA(w/v)、0.6mol/L MgCl2和0.1mol/L ZnCl2，且pH值为7.2；
发光底物液(AMPPD)；
胃蛋白酶原II校准品(胃蛋白酶原II校准品的浓度分别为15ng/mL、50ng/mL)。
实施例2试剂盒
所述试剂盒包括：
第一试剂：包被有胃蛋白酶原II单克隆抗体的疏水性羧基磁珠和第一缓冲液，其中，每1mg疏水性羧基磁珠对应包被5μg胃蛋白酶原II单克隆抗体，包被有胃蛋白酶原II单克隆抗体的疏水性羧基磁珠的浓度为0.05mg/mL，第一缓冲液包括：50mM MES、0.1％吐温-20(v/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)和1.2％BSA(w/v)，pH值为6.2。
第二试剂：碱性磷酸酶标记的胃蛋白酶原II单克隆抗体和第二缓冲液，其中，所述胃蛋白酶原II单克隆抗体与所述碱性磷酸酶的质量比为5：7，所述酶标记的胃蛋白酶原II单克隆抗体和第二缓冲液的体积比为1：480，所述第二缓冲液包括：50mM Tris、0.1％吐温-20(v/v)、1％甘氨酸(w/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)、1.2％BSA(w/v)、0.6mol/L MgCl2和0.1mol/L ZnCl2，且pH值为7.3；
发光底物液(AMPPD)；
胃蛋白酶原II校准品(胃蛋白酶原II校准品的浓度分别为15ng/mL、50ng/mL)。
实施例3试剂盒
所述试剂盒包括：
第一试剂：包被有胃蛋白酶原II单克隆抗体的疏水性羧基磁珠和第一缓冲液，其中，每1mg疏水性羧基磁珠对应包被20μg胃蛋白酶原II单克隆抗体，包被有胃蛋白酶原II单克隆抗体的疏水性羧基磁珠的浓度为0.1mg/mL，第一缓冲液包括：50mM MES、0.1％吐温-20(v/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)和1.2％BSA(w/v)，pH值为5.8。
第二试剂：碱性磷酸酶标记的胃蛋白酶原II单克隆抗体和第二缓冲液，其中，所述胃蛋白酶原II单克隆抗体与所述碱性磷酸酶的质量比为5：6，所述酶标记的胃蛋白酶原II单克隆抗体和第二缓冲液的体积比为1：520，所述第二缓冲液包括：50mM Tris、0.1％吐温-20(v/v)、1％甘氨酸(w/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)、1.2％BSA(w/v)、0.6mol/L MgCl2和0.1mol/L ZnCl2，且pH值为7.2；
发光底物液(AMPPD)；
胃蛋白酶原II校准品(胃蛋白酶原II校准品的浓度分别为15ng/mL、50ng/mL)。
实施例4试剂盒
所述试剂盒包括：
第一试剂：包被有胃蛋白酶原II单克隆抗体的疏水性羧基磁珠和第一缓冲液，其中，每1mg疏水性羧基磁珠对应包被40μg胃蛋白酶原II单克隆抗体，包被有胃蛋白酶原II单克隆抗体的疏水性羧基磁珠的浓度为0.1％(w/v)，第一缓冲液包括：50mM MES、0.1％吐温-20(v/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)和1.2％BSA(w/v)，pH值为6.1。
第二试剂：碱性磷酸酶标记的胃蛋白酶原II单克隆抗体和第二缓冲液，其中，所述胃蛋白酶原II单克隆抗体与所述碱性磷酸酶的质量比为5：10，所述酶标记的胃蛋白酶原II单克隆抗体和第二缓冲液的体积比为1：520，所述第二缓冲液包括：50mM Tris、0.1％吐温-20(v/v)、1％甘氨酸(w/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)、1.2％BSA(w/v)、0.6mol/L MgCl2和0.1mol/L ZnCl2，且pH值为7.1；
发光底物液(AMPPD)；
胃蛋白酶原II校准品(胃蛋白酶原II的浓度分别为15ng/mL、50ng/mL)。
实施例5胃蛋白酶原II的检测方法
以全自动化学发光仪(CL-2000)为检测工具，加入100μL R2试剂与20μL的待测样品孵育5min、再加入50μL R1试剂孵育5min，得到混合液，将混合液进行磁分离清洗，清洗完后仪器自动加入300μL底物液后，得到待测溶液，将待测溶液自动移到光电模块中检测发光值，然后仪器自动转换为待测溶液中的胃蛋白酶原Ⅰ浓度，并显示测试结果。
试剂盒的性能测试：
1、灵敏度的检测
参照CLSI EP17-A文件推荐的实验方案，计算实施例1中的试剂盒的灵敏度，得出用于检测胃蛋白酶原II的试剂盒的灵敏度为＜0.5ng/mL。
2、线性范围
使用实施例1中的试剂盒对浓度为1ng/mL、6ng/mL、30ng/mL、75ng/mL、100ng/mL的胃蛋白酶原II参考品做线性分析，其结果如下表1所示。
表1线性测试结果
浓度(ng/mL) 发光值(RLU值)
0 2981
1 229993
6 1584619
30 6010613
75 13607390
100 17942399
根据表1所示的测试结果，得到图1所示的线性曲线，图1中，横坐标为浓度(ng/mL)，纵坐标为发光值(RLU值)。由图1可以看出，线性相关系数r≥0.99，说明该试剂盒的线性范围为1-100ng/mL的线性好，能够准确测量胃蛋白酶原II浓度为1-100ng/mL的待测样品。
3、临床样本测试比对
用实施例1中试剂盒与雅培公司试剂盒同时检测临床血清中的胃蛋白酶原II含量，以雅培试剂盒测得的结果为横坐标X，浓度为ng/mL，以本发明测定的结果作为纵坐标y，浓度单位为ng/mL，其结果如图2所示。
由图2可以看出，其回归方程为：y＝1.0008x+0.0181，相关系数为0.9959，K值为1.0008，说明其相关性很好。
4、准确度
取实施例1中的试剂盒测定其中的胃蛋白酶原II校准品(浓度为15ng/mL和50ng/mL)，平行测定3次，取均值，回收率在85.0％-115.0％范围内，测试结果如下表2所示。
表2准确度测试结果
测定校准品的浓度(ng/mL) 测定结果均值(ng/mL) 回收率(％)
15 15.1 99.3％
50 49.8 100.4％
由表2可以看出，实施例1提供的用于检测胃蛋白酶原II的试剂盒的准确度高，且回收率满足要求。
5、批间差
取三个批次的实施例1中的试剂盒分别测试其中的胃蛋白酶原II校准品(浓度为15ng/mL和50ng/mL)，各重复10次，计算其变异系数CV，其结果如下表3所示。
表3批间差测试结果
Figure BDA0003580209520000111
由表3可以看出，变异系数CV<8％，满足试剂盒的变异系数CV需<15％的要求。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种试剂盒，用于检测胃蛋白酶原II的含量，其特征在于，所述试剂盒包括第一试剂、第二试剂、发光底物液以及胃蛋白酶原II校准品，
其中，所述第一试剂包括包被有胃蛋白酶原II单克隆抗体的疏水性羧基磁珠和第一缓冲液；
所述第二试剂包括酶标记的胃蛋白酶原II单克隆抗体和第二缓冲液。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述包被有胃蛋白酶原II单克隆抗体的疏水性羧基磁珠中，每1mg疏水性羧基磁珠对应包被5～40μg胃蛋白酶原II单克隆抗体；和/或，
所述酶标记的胃蛋白酶原II单克隆抗体中，所述胃蛋白酶原II单克隆抗体与所述酶的质量比为5：6～10。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一缓冲液包括MES、吐温-20、Proclin300、NaCl和BSA，且pH值为5.8～6.2。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述第一缓冲液包括：50mM MES、0.1％吐温-20(v/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)和1.2％BSA(w/v)。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一试剂中，所述包被有胃蛋白酶原II单克隆抗体的疏水性羧基磁珠的浓度为0.05mg/mL～0.1mg/mL。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二缓冲液包括Tris、吐温-20、甘氨酸、Proclin300、NaCl、BSA、MgCl2和ZnCl2，且pH值为7.1～7.3。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述第二缓冲液包括：50mM Tris、0.1％吐温-20(v/v)、1％甘氨酸(w/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)、1.2％BSA(w/v)、0.6mol/L MgCl2和0.1mol/L ZnCl2。
8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述发光底物液包括AMPPD；和/或，
所述第二试剂中，所述酶标记的胃蛋白酶原II单克隆抗体和第二缓冲液的体积比为1：480～520。
9.一种胃蛋白酶原II的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供如权利要求1至8任意一项所述的试剂盒；
将第一试剂、第二试剂和待测样品孵育后，进行磁分离清洗，再加入发光底物液，得到待测液；
检测所述待测液的发光值，根据发光值计算出胃蛋白酶原II的含量。
10.如权利要求9所述的胃蛋白酶原II的检测方法，其特征在于，所述第一试剂、第二试剂和待测样品的体积比为5：10：2。
CN202210357344.2A 2022-04-02 2022-04-02 一种试剂盒、以及胃蛋白酶原ii的检测方法 Pending CN114740194A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210357344.2A CN114740194A (zh) 2022-04-02 2022-04-02 一种试剂盒、以及胃蛋白酶原ii的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210357344.2A CN114740194A (zh) 2022-04-02 2022-04-02 一种试剂盒、以及胃蛋白酶原ii的检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114740194A true CN114740194A (zh) 2022-07-12

Family

ID=82279736

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210357344.2A Pending CN114740194A (zh) 2022-04-02 2022-04-02 一种试剂盒、以及胃蛋白酶原ii的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114740194A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102426236A (zh) * 2011-08-31 2012-04-25 内蒙古科慧生物科技有限责任公司 胃蛋白酶原ii(pgii)定量测定试剂盒及其检测方法
CN107677809A (zh) * 2017-08-24 2018-02-09 菲鹏生物股份有限公司 急性肾损伤的检测试剂盒
CN112098654A (zh) * 2020-09-15 2020-12-18 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种胃蛋白酶原i/ii测定试剂盒及其制备方法
CN112710825A (zh) * 2020-12-15 2021-04-27 深圳天辰医疗科技有限公司 碱性磷酸酶酶标缓冲液和碱性磷酸酶酶标试剂

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102426236A (zh) * 2011-08-31 2012-04-25 内蒙古科慧生物科技有限责任公司 胃蛋白酶原ii(pgii)定量测定试剂盒及其检测方法
CN107677809A (zh) * 2017-08-24 2018-02-09 菲鹏生物股份有限公司 急性肾损伤的检测试剂盒
CN112098654A (zh) * 2020-09-15 2020-12-18 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种胃蛋白酶原i/ii测定试剂盒及其制备方法
CN112710825A (zh) * 2020-12-15 2021-04-27 深圳天辰医疗科技有限公司 碱性磷酸酶酶标缓冲液和碱性磷酸酶酶标试剂

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8236555B2 (en) Multiplexed assay methods
CN108956989B (zh) 一种幽门螺杆菌分型检测用检测试剂卡及其制备方法
CN112014575B (zh) 一种cyfra21-1测定试剂盒及其制备方法
CN111175491A (zh) 一种sBCMA磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和应用
CN112684166A (zh) 测定人体胃泌素g17含量的磁微粒化学发光检测试剂盒
CN112034170A (zh) 荧光层析定量检测幽门螺杆菌抗体试剂卡及检测方法
CN109239326A (zh) 基于磁颗粒纳米酶的微流控免疫芯片分析方法及应用
CN109142753A (zh) 鳞状上皮细胞癌抗原化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN109085343B (zh) 一种测定抗Jo-1抗体的试剂盒及检测方法
CN111650369A (zh) 一种幽门螺旋杆菌磁微粒化学发光检测试剂盒及其制备方法
JP2005513504A (ja) 診断方法
WO2023017817A1 (ja) 免疫測定方法、検体希釈液、及びイムノクロマトグラフィーキット
JP2010091308A (ja) レクチン吸収法による前立腺がんの診断方法及び判定キット
KR20010025027A (ko) 면역측정시약 및 면역측정법
CN114740194A (zh) 一种试剂盒、以及胃蛋白酶原ii的检测方法
CN115980339A (zh) 一种基于彩色微球的定量检测降钙素原免疫层析试纸条及其制备方法
CN115436632A (zh) 一种胃蛋白酶原ii检测试剂盒及其应用
JP6867529B1 (ja) ヘリコバクター・ピロリ検出用抗体
CN114441779A (zh) 一种针对胃泌素17的双模态免疫层析试剂盒及其检测方法
CN114280311A (zh) 一种氨基末端b型利钠肽前体的纳米磁微粒化学发光检测试剂盒制备方法及检测应用
CN116413445A (zh) 一种检测总甲状腺素含量的检测卡、试剂盒及其检测方法
CN114924065A (zh) 胃蛋白酶原ⅰ的检测试剂盒及其制备方法与应用
CN112505319A (zh) 一种待检标志物免疫定量检测装置、检测方法及用途
JPH03170058A (ja) イムノアッセイ用試薬複合体
CN113588960A (zh) 一种比率荧光法免疫层析检测试条及其检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination