CN115436632A - 一种胃蛋白酶原ii检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测试剂盒技术领域,具体涉及一种胃蛋白酶原II检测试剂盒及其应用;本发明的胃蛋白酶原II检测试剂盒包括试剂A、试剂B、磁微粒试剂和发光底物液,检测原理为双抗体夹心法,试剂A包括酶标链霉亲和素抗体,试剂B包括生物素标记的胃蛋白酶原II抗体,所述磁微粒试剂包括包被有胃蛋白酶原II抗体的磁微粒;利用磁微粒分离化学发光免疫检测,酶标记技术,磁分离技术和化学发光技术相结合,解决其他方法检测灵敏度低、线性范围窄、准确性和稳定性差的问题,与进口试剂盒的相关性达0.99以上,同时降低了成本,适用于全自动化学发光仪,操作简单。
Description
技术领域
本发明涉及检测试剂盒技术领域,具体涉及一种胃蛋白酶原II检测试剂盒及其应用。
背景技术
胃蛋白酶原(PG)是胃蛋白酶的无活性前体,由胃黏膜组织分泌并转化成有分解蛋白能力的胃蛋白酶(pepsin),依据其生化性质和免疫原性将其分成PGI和PGII两个亚群。PGI主要由胃底腺的主细胞和颈黏液细胞分泌;PGII由胃底腺、胃贲门腺、胃窦幽门腺和十二指肠Brunner腺细胞分泌。PG合成后,大部分释放并进入胃腔,仅1%左右进入血液循环。因此血清PGI和PGII水平可以反映不同部位胃粘膜的形态和功能,联合测定PGI和PGI/II比值可起到胃体粘膜“血清学活检”的作用。血清PGI浓度升高可见于胃溃疡、十二指肠溃疡、糜烂性胃炎等;血清PGI浓度降低可见于萎缩性胃炎等。因此PGI、PGII和PGI,PGII(PGR)的变化可反映胃黏膜不同部位的病变及其严重程度。
目前市场上常用检测胃蛋白酶原II(PGII)方法主要是采用胶体金免疫层析技术、酶联免疫技术等,具有检测时间长,稳定性差,灵敏度差,通量小,易污染以及成本高等缺点。
因此寻找一种检测灵敏度高,快捷高效的胃蛋白酶原II检测试剂盒是目前亟待解决的问题。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供一种胃蛋白酶原II检测试剂盒,本发明采用夹心法原理,制备碱性磷酸酶酶标记链霉亲和素抗体和生物素标记的胃蛋白酶原II抗体,使用包被有胃蛋白酶原II抗体的磁微粒,显著放大了检测信号,综合利用磁微粒分离化学发光免疫检测,酶标记技术,磁分离技术和化学发光技术相结合,解决其他方法检测灵敏度低、线性范围窄、准确性和稳定性差的问题,与进口试剂盒的相关性达0.99以上,同时降低了成本,适用于全自动化学发光仪,操作简单。
具体的,本发明的技术方案如下:
一种胃蛋白酶原II检测试剂盒,包括试剂A、试剂B、磁微粒试剂、发光底物液和校准品;
所述试剂A包括酶标链霉亲和素抗体;
优选的,酶标链霉亲和素抗体为碱性磷酸酶标记的链霉亲和素抗体。
所述试剂B包括生物素标记的胃蛋白酶原II抗体;
所述磁微粒试剂包括包被有胃蛋白酶原II抗体的磁微粒;
所述试剂A的浓度为0.01~0.2μg/mL;
所述试剂B的浓度为0.2~0.8μg/mL;
所述磁微粒的粒径为1μm~3μm;所述磁微粒试剂的浓度为0.1~1.0ug/mL;
所述发光底物液为金刚烷胺衍生物;
所述校准品为0.00ng/mL、5.00ng/mL、15.00ng/mL、25.00ng/mL、50.00ng/mL、150.00ng/mL的胃蛋白酶原II溶液。
进一步的,所述试剂A的制备步骤为:将链霉亲和素抗体、碱性磷酸酶活化,混合活化后的碱性磷酸酶和活化后的链霉亲和素抗体,静置反应,凝胶纯化柱进行纯化,缓冲液A稀释至0.2~1.0μg/mL,得到酶标链霉亲和素抗体溶液;
优选的,所述缓冲液A的为含1%牛血清白蛋白、10%新生牛血清、1%酪蛋白、0.5%Proclin300防腐剂,pH为8.0~9.0的Tris缓冲液,Tris缓冲液的浓度为0.1mol/L;
优选的,所述链霉亲和素抗体、碱性磷酸酶活化的活化剂为5~10mg/mL的2-IT溶液。
进一步的,所述试剂B的制备步骤为:用超滤管将胃蛋白酶原II抗体和生物素进行混合,37℃恒温避光温育,得到生物标记的抗体溶液。
进一步的,所述磁微粒试剂的制备步骤为:用MES缓冲液洗涤磁微粒3~5次后,活化30~40min,用MES缓冲液洗涤磁微粒1次,加入胃蛋白酶原II抗体进行偶联,用MES缓冲液洗涤磁微粒3~5次,加入封闭剂进行封闭,用Tris缓冲液洗涤3~5次后,得到包被有胃蛋白酶原II抗体的磁微粒溶液,即磁微粒试剂;
优选的,所述封闭剂为0.1~0.5moL/L的甘氨酸溶液;
优选的,所述封闭剂与磁微粒的用量比为0.1~0.2mL:8~10mg。
本发明还提供一种胃蛋白酶原II检测试剂盒在检测胃蛋白酶原II中的应用;所述应用包括但不限于将试剂A、试剂B和待测样品孵育后,进行磁分离清洗,再加入发光底物液,得到待测液;检测所述待测液的发光值,根据发光值计算出胃蛋白酶原II的含量。
本发明的有益效果在于:
本发明特有的链霉亲和素-生物素发光体系,实现了抗体直接标记磁微粒,极大地减少抗体标记失活现象;在抗体标记量上,抗体直接标记磁微粒明显比链霉亲和素偶联磁微粒模式结合更多抗体,标记端活性明显提高,具有检测灵敏度高,线性范围宽,检测平台期长等优点,无需进行繁琐的底物使用前的混合操作,可配合仪器检测,使用简单,检测速度快,检测周期短,降低了检测成本与人力花费。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例2中胃蛋白酶原II检测试剂盒在线性测试中的标准曲线图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明,本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外,实施方案应理解为说明性的,而非限制本发明的范围,本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言,在不背离本发明实质和范围的前提下,对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
胃蛋白酶原II(PGII)、碱性磷酸酶(ALP)、链霉亲和素(SA)、生物素(BIO)为方便叙述,使用括号内的简称表示。
在本发明的一些实施例中,一种PGII检测试剂盒包括:试剂A、试剂B、磁微粒试剂、发光底物液和校准品。
进一步地,所述的试剂A包括ALP标记的SA抗体,即酶标SA抗体,所述试剂A的浓度为0.01~0.2μg/mL。
进一步地,所述的试剂B包括BIO标记的PGII抗体,所述试剂B的浓度为0.2~0.8μg/mL。
进一步地,所述的磁微粒试剂为标记有PGII包被抗体与磁性微球粒的结合物,即包被有PGII抗体的磁微粒;所述磁微粒的直径1μm~3μm;所述磁微粒试剂的浓度为0.1~1.0ug/mL。包被有PGII抗体的磁微粒的制备步骤为:清洗,活化连接,清洗,封闭,清洗,稀释工作浓度得到。
进一步地,所述发光底物液包括但不限于金刚烷胺衍生物。
优选的,发光底物液的发光底物为CSPD、AMPPD、ADP-Star、CDP-Star中的一种;
更优选的,发光底物液的发光底物为CSPD。
所述校准品为浓度0.00ng/mL、5.00ng/mL、15.00ng/mL、25.00ng/mL、50.00ng/mL、150.00ng/mL的胃蛋白酶原II(PGII)溶液。
本发明提供的又一具体实施方式中,胃蛋白酶原II的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法,包括如下步骤:
(1)试剂A的制备:
将活化后的碱性磷酸酶(ALP)和活化后的SA抗体进行混合,静置反应,通过Supperdex200凝胶纯化柱进行纯化,得到含有ALP-SA抗体连接物(即酶标SA抗体)的溶液;
(2)试剂B的制备:
BIO加入助溶剂;标记缓冲液稀释胃蛋白酶原II抗体,加入标记物保存液,用超滤管将胃蛋白酶原II抗体和助溶的BIO进行混合,37℃恒温避光温育,得到生物素标记的胃蛋白酶原II抗体溶液;
(3)磁微粒试剂的制备:
用MES缓冲液洗涤磁微粒3次后,进行30-40min活化,用MES缓冲液进行1次洗涤,然后加入PGII包被抗体,进行偶联,然后用MES缓冲液洗涤磁微粒3次后加入封闭剂,进行封闭,用Tris缓冲液洗涤3次后,得到包被有胃蛋白酶原II抗体的磁微粒溶液;
进一步地,步骤(1)所述的ALP和SA抗体的活化剂为5~10mg/mL的2-IT溶液;所述的2-IT溶液的pH值为8.0-9.0;所述的静置反应时间为16~20h;所述的Supperdex200凝胶纯化柱为GE公司产品;
所述酶标SA抗体用含1%牛血清白蛋白(BSA)、10%新生牛血清、1%酪蛋白、0.5%Proclin300防腐剂、pH为8.0~9.0的0.1moL/L的Tris缓冲液稀释,稀释至酶标SA抗体浓度为0.2~1.0μg/mL。
优选地,步骤(1)所述的活化剂2-IT溶液的浓度为8~10mg/mL;
优选地,步骤(1)所述的活化剂2-IT溶液的pH为8.5~9.0;
优选地,步骤(1)所述的静置反应时间为18~20h;
优选地,步骤(1)所述的抗体ALP-SA连接物Tris稀释液的pH为8.5;
优选地,步骤(1)所述的酶标SA抗体浓度为0.4μg/mL。
进一步地,步骤(2)所述的BIO助溶剂为DMSO溶液;所述的标记缓冲液为TSE缓冲液,所述的标记物保存液为TSMZA缓冲液,所述的TSE缓冲液的pH值为8.0~9.0,所述的TSMZA缓冲液pH值为6.0~8.0;所述的避光恒温温育温度为30~40℃,反应时间为20~40min;所述的超滤管为Millipore公司产品;
所述生物素标记的胃蛋白酶原II抗体溶液用缓冲液B(含1.8%NaCl、2%蔗糖、2%丙三醇、1%牛血清白蛋白(BSA)、0.5%Proclin300防腐剂、pH为6.0~7.0的0.1moL/L的MES缓冲液)稀释,稀释至生物素标记的胃蛋白酶原II抗体浓度为0.01-0.2μg/mL。
优选地,步骤(2)所述的标记缓冲液TSE缓冲液的pH为8.5;
优选地,步骤(2)所述的标记物保存液TSMZA缓冲液的pH为7.0;
优选地,步骤(2)所述的恒温避光温育反应温度为37℃;
优选地,步骤(2)所述的恒温避光温育反应时间为30min;
优选地,步骤(2)所述的生物素标记的胃蛋白酶原II抗体浓度为0.1μg/mL。
进一步地,步骤(3)所述磁微粒为羧基磁珠,粒径1.0~2.0μm,所述MES缓冲液的pH值为4.5~5.5,所述的Tris缓冲液的pH值为7.0~8.0;活化剂的浓度9~11mg/mL,封闭剂的量与磁微粒的量比为(0.1~0.2)mL:(8~10)mg;得到的磁微粒试剂的浓度为8~11mg/mL。
步骤(3)所述封闭剂为0.1~0.5moL/L的甘氨酸溶液。
优选地,步骤(3)所述的封闭剂甘氨酸溶液的浓度为0.2mg/mL;
优选地,步骤(3)所述的封闭剂甘氨酸溶液的pH为7.5;
优选地,步骤(3)所述的磁微粒的粒径为1.0μm;
优选地,步骤(3)所述的MES缓冲液pH值为5.0;
优选地,步骤(3)所述的Tris缓冲液pH值为7.4;
优选地,步骤(3)所述的封闭剂的量与磁微粒的量比为0.2mL:10mg;
进一步地,步骤(3)中所述的偶联的时间为18~24h,温度为20~30℃;封闭的时间为18~24h,温度为20~30℃。
优选地,步骤(3)所述偶联时间为20h,温度为25℃。
优选地,步骤(3)所述封闭时间为20h,温度为25℃。
进一步地,步骤(3)中包被有胃蛋白酶原II抗体的磁微粒可以用Tris缓冲液进行洗涤,该缓冲液为含3.03g/L Tris,8.77gl/L NaCl,0.5mL/L Tween20,1g/L BSA,5mL/L10%NaN3的缓冲液(pH为7.0~8.0)。
进一步地,步骤(3)中包被有胃蛋白酶原II抗体的磁微粒可以用Tris缓冲液进行稀释。该缓冲液为含6.02g/L Tris、4.97gl/L甲基纤维醚、0.9946mL/L Tween20、4.97g/LBSA、0.99g/L NaN3、0.99g/L硫酸新霉素、0.03g/L四环素的缓冲液(pH为8.0~8.5)。
本发明提供的胃蛋白酶原II(PGII)测定试剂盒的检测流程,包括如下步骤:加入样本,加入试剂A、试剂B、磁微粒试剂,孵育,加入发光底物,清洗,测定发光值。
进一步地,待测样本量:试剂A:试剂B:磁微粒试剂:发光底物液的体积比为:(15-100):(30-60):(30-60):(30-50):200;孵育时间为15~30min。
包被有胃蛋白酶原II抗体的磁微粒,实现了抗体直接标记磁微粒,极大地减少抗体标记失活现象;在抗体标记量上,抗体直接标记磁微粒明显比SA磁珠模式结合更多抗体,标记端活性明显提高,其次ALP标记SA抗体改变了空间结构,空间位阻变小,有利于检测过程结合抗原。
实施例1
一种胃蛋白酶原检测试剂盒,包括试剂A、试剂B、磁微粒试剂、发光底物液和校准品。
试剂A为ALP标记SA抗体溶液,其浓度为0.4μg/mL;
试剂B为BIO标记的PGII抗体溶液,其浓度为0.1μg/mL。
磁微粒试剂为包被有胃蛋白酶原II抗体的磁微粒溶液,其浓度为0.5mg/mL;磁微粒的直径为1μm。
发光底物液为金刚烷胺衍生物CSPD。
制备方法如下:
(1)试剂A的制备:
pH为8.5的8mg/mL 2-IT溶液活化碱性磷酸酶和SA抗体,将两者混合,静置反应18h,通过Supperdex200凝胶纯化柱进行纯化,用含1%牛血清白蛋白、10%新生牛血清、1%酪蛋白、0.5%Proclin300防腐剂,pH为8.5 0.1mol/L的Tris稀释液稀释至0.4μg/mL,得到含有ALP-SA抗体连接物(即酶标SA抗体)的溶液;
(2)试剂B的制备:
BIO加入DMSO助溶剂;pH值为8.5的TSE缓冲液稀释胃蛋白酶原II抗体,加入pH值为7.0的TSMZA缓冲液,用Millipore公司超滤管将胃蛋白酶原II抗体和助溶的BIO进行混合,37℃恒温避光温育30min,得到生物素标记的胃蛋白酶原II抗体溶液,用缓冲液B(含1.8%NaCl、2%蔗糖、2%丙三醇、1%牛血清白蛋白(BSA)、0.5%Proclin300防腐剂、pH为6.0的0.1moL/L的MES缓冲液)稀释,稀释至生物素标记的胃蛋白酶原II抗体的浓度为0.1μg/mL;
(3)磁微粒试剂的制备:
用MES缓冲液洗涤粒径1.0μm的羧基磁珠3次后,使用MES缓冲液进行30min活化,用pH值为4.5的MES缓冲液进行洗涤1次,然后加入PGII包被抗体,25℃进行偶联20h,然后用MES缓冲液洗涤磁微粒3次后加入封闭剂0.2mol/L甘氨酸溶液,25℃进行封闭20h,用含3.03g/L Tris,8.77gl/L NaCl,0.5mL/L Tween20,1g/L BSA,5mL/L 10%NaN3的缓冲液洗涤3次后,用Tris缓冲液进行稀释至0.5mg/mL(该缓冲液为含6.02g/L Tris、4.97gl/L甲基纤维醚、0.9946mL/L Tween20、4.97g/L BSA、0.99g/L NaN3、0.99g/L硫酸新霉素、0.03g/L四环素),得到包被有胃蛋白酶原II抗体的磁微粒溶液,即磁微粒试剂。
PGII抗原经含有0.5mol/LNa+、6%蛋白类保护剂,5‰的防腐剂,5‰的蛋白酶抑制剂的Tris-HCl缓冲液稀释制备校准品,其浓度分别为0.00ng/mL、5.00ng/mL、15.00ng/mL、25.00ng/mL、50.00ng/mL、150.00ng/mL。
实施例2
本发明提供一种PGII试剂盒的制备方法,包括试剂A、试剂B、磁微粒试剂和发光底物液;
试剂A的制备步骤如下:
取SA抗体溶液,加入10mg/mL的2-IT溶液2~4μL,室温静置30min,加入0.1moL/L的甘氨酸溶液10μL,室温静置5min;用G-25凝胶柱除盐,收集活化的SA抗体,于2~8℃保存备用;取ALP溶液,加入5mg/mL的SMCC溶液20μL,室温静置30min,用G-25凝胶柱除盐,收集活化的ALP抗体,于2~8℃保存备用;
将活化的SA抗体与活化的ALP抗体混合,于2~8℃条件下静置反应18h,通过Supperdex200凝胶纯化柱进行纯化,获得含有抗体SA-ALP连接物(即ALP标记的PGII抗体)的溶液,于2~8℃保存备用;将所得ALP标记SA抗体溶液用含1%牛血清白蛋白(BSA)、10%新生牛血清、1%酪蛋白、0.5%Proclin300防腐剂、pH为8.0的0.1moL/L的Tris缓冲液稀释,稀释至ALP标记SA抗体溶液的浓度为0.5μg/mL,pH为8.0,于2~8℃保存备用;
试剂B的制备步骤如下:
取1mg PGII标记抗体于10KD超滤管中,并加入适量体积的TES标记缓冲液,使抗体终浓度为1mg/mL,12000g离心10min;加入13.3uL生物素溶液和适量的TES标记缓冲液至上述超滤管中,使终体积为0.5mL,并轻轻吹打混匀,放入37℃恒温箱中避光温育30min;然后12000g离心10min;加入适量TES标记缓冲液至上述超滤管中,使终体积为0.5mL,并轻轻混匀,12000g离心10min,重复三次;收集超滤管中的溶液(即BIO标记的PGII抗体),加入等体积的TSMZA的保存液,置于-20℃保存备用;将所得BIO标记的PGII抗体的溶液用含1.8%NaCl、2%蔗糖、2%丙三醇、1%牛血清白蛋白(BSA)、0.5%Proclin300防腐剂、pH为6.0~7.0的0.1moL/L的MES缓冲液稀释,稀释至BIO标记的PGII抗体溶液浓度为0.2μg/mL,于2~8℃保存备用;
磁微粒试剂的制备步骤如下:
用0.1mol/L的pH为5.0MES缓冲液将1mL的羧基磁微粒清洗3次后定容至15.625mg/mL,进行活化,将活化后的用MES缓冲液清洗1次,定容至20mg/mL,然后加入0.1mL的1mg/mLPGII包被抗体溶液,在25℃摇床孵育20h,结束后用MES溶液清洗3次,加入封闭剂0.2mL,在25℃摇床孵育20h,反应结束后用含8.77gl/L NaCl,0.5mL/L Tween20,1g/L BSA,5mL/L10%NaN3的Tris缓冲液,pH为7.4,清洗3次,最后用pH为8.0含有6.02g/L Tris,4.97gl/L甲基纤维醚,0.9946mL/L Tween20,4.97g/L BSA,0.99g/L NaN3,0.99g/L硫酸新霉素,0.03g/L四环素的缓冲液将包被有胃蛋白酶原II抗体的磁微粒溶液进行定容至10.0mg/mL,稀释至1.0mg/mL,并保存在2~8℃下以备后用。
校准品制备:用pH7.5含有0.5mol/L Na+、6%蛋白类保护剂,5‰的防腐剂,5‰的蛋白酶抑制剂的Tris-HCl缓冲液将PGII抗原进行稀释,浓度分别为0.00ng/mL、5.00ng/mL、15.00ng/mL、25.00ng/mL、50.00ng/mL、150.00ng/mL,放置2~8℃备用。
发光底物液为金刚烷胺衍生物CSPD。
实施例3
本发明实施例2的试剂盒的性能评价,如下:
1.标准曲线
用标准品稀释液将PGII抗原稀释配置成不同浓度的校准品溶液A-F,浓度分别为0.00ng/mL、5.00ng/mL、15.00ng/mL、25.00ng/mL、50.00ng/mL、150.00ng/mL,保存于-20℃备用。然后使用本发明实施例2提供的试剂盒对校准品进行检测,分别读取各校准品对应的发光强度值。以浓度为横坐标,发光强度为纵坐标进行拟合得到标准曲线,如图1所示。
2.线性评价:
将接近线性范围上限高值样本按1,1/4,1/8,1/16,1/64,1/128比例稀释为六种浓度,其中低值浓度的样本须接近线性区间的下限。按照实施例2试剂盒说明书进行操作,将每一浓度的样本重复检测3次,计算平均值,将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合,并计算线性相关系数r,结果显示大于0.999。结果如表1。
表1实施例2试剂盒对样本的检测结果
3.最低检测限
用零浓度校准品作为样品进行检测,实施例2试剂盒重复测定20次,得出20次测量结果的相对发光值,计算琦平均值(M)和标准差(SD),得出M+2SD,根据A点校准品和相邻B点校准品质检的浓度发光值结果进行两点回归拟合得出一次方程,将M+2SD的发光值代入上述方程中,求出对应的浓度值,即为最低检测限,结果显示本发明的检测试剂盒小于0.05ng/mL。
表2校准品的相对发光值
4.准确度
样品A:10μL浓度为100ng/mL±20%准确度;
样品B:90μL浓度为5ng/mL±20%的准确度;
将样品A添加到样品B中,所加入A的体积宜不超过总体积(A+B)的10%,按照实施例2试剂盒说明书进行操作,重复检测3次,计算平均值,按公式(1)计算添加回收率,结果显示,回收率为105.7%。
式中:
R:回收率
V:样品A液的体积
V0:样品B液的体积
C:样品B液加入A液后的检测浓度的平均值
C0:样品B液的浓度的平均值
Cs:样品A液的浓度的平均值
表3样本A+样本B的准确度结果
发光值 | CV | 测试浓度(ng/mL) | 理论浓度(ng/mL) | R(回收率)% | |
样本A+样本B | 202721 | 1.61% | 15.323 | 14.5 | 105.7 |
由表2可以看出,实施例2提供的胃蛋白酶原II的检测试剂盒的准确度高,且回收率满足要求。
5.重复性
取精密度样本1(15ng/mL±20%),取精密度样本2(60ng/mL±20%)作为待测样品。按说明书的操作方法,使用实施例2的检测试剂盒,对待测样品进行10次重复测定,计算10次测定结果的平均值和标准差,结果如下:
表4实施例2试剂盒的重复性测试结果
由表4可以看出,变异系数CV≤5%,满足试剂盒的变异系数CV需<15%的要求。
6.特异性
参照CLSI EP17-A文件推荐的实验方案,计算实施例1中的试剂盒的灵敏度,使用实施例2的试剂盒重复测定浓度为500ng/mL的PGII抗原的样本2次,其测定结果≤0.05ng/mL。
表5实施例2试剂盒的特异性测试结果
发光值1 | 发光值2 | 均值 | CV | 浓度(ng/mL) | |
PGI样本(500ng/mL) | 1584 | 1524 | 1554 | 3% | 0.036 |
Claims (10)
1.一种胃蛋白酶原II检测试剂盒,其特征在于,包括试剂A、试剂B、磁微粒试剂和发光底物液;
所述试剂A包括酶标链霉亲和素抗体;
所述试剂B包括生物素标记的胃蛋白酶原II抗体;
所述磁微粒试剂包括包被有胃蛋白酶原II抗体的磁微粒;
所述试剂A的浓度为0.01~0.2μg/mL;
所述试剂B的浓度为0.2~0.8μg/mL;
所述磁微粒的粒径为1μm~3μm;所述磁微粒试剂的浓度为0.1~1.0ug/mL;
所述发光底物液为金刚烷胺衍生物。
2.如权利要求1所述的一种胃蛋白酶原II检测试剂盒,其特征在于,胃蛋白酶原II检测试剂盒还包括校准品,所述校准品为0.00ng/mL、5.00ng/mL、15.00ng/mL、25.00ng/mL、50.00ng/mL、150.00ng/mL的胃蛋白酶原II溶液。
3.如权利要求1所述的一种胃蛋白酶原II检测试剂盒,其特征在于,所述试剂A的制备步骤包括:
将链霉亲和素抗体、碱性磷酸酶活化,混合活化后的碱性磷酸酶和活化后的链霉亲和素抗体,静置反应,凝胶纯化柱进行纯化,缓冲液A稀释至0.2~1.0μg/mL,得到试剂A。
4.如权利要求1所述的一种胃蛋白酶原II检测试剂盒,其特征在于,所述试剂B的制备步骤包括:
将胃蛋白酶原II抗体和生物素进行混合,恒温避光温育,缓冲液B稀释,得到试剂B。
5.如权利要求1所述的一种胃蛋白酶原II检测试剂盒,其特征在于,所述磁微粒试剂的制备步骤包括:
用MES缓冲液洗涤磁微粒3~5次后,活化30~40min,用MES缓冲液洗涤磁微粒1次,加入胃蛋白酶原II抗体进行偶联,用MES缓冲液洗涤磁微粒3~5次,加入封闭剂进行封闭,用Tris缓冲液洗涤3~5次后,得到磁微粒试剂。
6.如权利要求3所述的一种胃蛋白酶原II检测试剂盒,其特征在于,所述链霉亲和素抗体、碱性磷酸酶活化的活化剂为5~10mg/mL的2-IT溶液。
7.如权利要求3所述的一种胃蛋白酶原II检测试剂盒,其特征在于,所述缓冲液A为含1%牛血清白蛋白、10%新生牛血清、1%酪蛋白、0.5%Proclin300防腐剂,pH为8.0~9.0的Tris缓冲液。
8.如权利要求5所述的一种胃蛋白酶原II检测试剂盒,其特征在于,所述封闭剂为0.1~0.5moL/L的甘氨酸溶液。
9.如权利要求5所述的一种胃蛋白酶原II检测试剂盒,其特征在于,所述封闭剂与磁微粒的用量比为0.1~0.2mL:8~10mg。
10.如权利要求1~9任一项所述的一种胃蛋白酶原II检测试剂盒在检测胃蛋白酶原II中的应用。
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