CN114878537A - 一种25羟基维生素d化学发光测定试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种25羟基维生素D化学发光测定试剂盒，包括免疫磁珠组分、酶工作液组分和解离剂，所述酶组分包括碱性磷酸酶标记的25‑OH‑VD衍生物，所述碱性磷酸酶标记的25‑OH‑VD衍生物，是由生物素标记的碱性磷酸酶与链霉亲和素标记的25‑OH‑VD衍生物通过生物素‑链霉亲和素亲和放大连接构成。本发明利于提高25‑OH‑VD衍生物和ALP的连接效率，从而利于进一步提高试剂灵敏度。

Description

一种25羟基维生素D化学发光测定试剂盒
技术领域
本发明涉及小分子抗原化学发光法检测技术领域，具体涉及一种25羟基维生素D化学发光测定试剂盒。
背景技术
目前，25羟基维生素D(25-OH-VD)体外测定试剂多采用化学发光法，是基于小分子竞争法检测的项目。采用化学发光法检测25羟基维生素D主要包括以下步骤：(1)单克隆抗体包被链霉亲和素磁珠，抗体上连上生物素，通过亲合素-生物素特异性结合，致使抗体包被于磁珠上；(2)25-OH-VD抗原标记碱性磷酸酶(ALP)，25-OH-VD小分子抗原多为衍生物有羧基基团的衍生物，将其羧基进行活化，再与ALP的氨基结合，从而完成25-OH-VD抗原标记ALP的过程；(3)酸性解离剂解离样本，解离剂多为酸性物质加还原剂的成份，可实现结合蛋白的解离。现有的用化学发光法检测25-OH-VD存在以下问题：
(1)现有技术25-OH-VD抗原标记碱性磷酸酶，单位抗原上连接ALP的个数由小分子上羧基的个数决定，小分子衍生物其反应功能团多为一个羧基，则ALP的标记效率也较低。
(2)现有技术多选择链霉亲和素磁珠制备免疫磁珠，则在酸性解离剂作用下，免疫磁珠的效价会大大被抑制，降低试剂灵敏度。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：25羟基维生素D(25-OH-VD)体外测定试剂多采用化学发光法，由于待测物分子量小、检测灵敏度较低，本发明提供了解决上述问题的一种25羟基维生素D化学发光测定试剂盒。
本发明通过下述技术方案实现：
一种25羟基维生素D化学发光测定试剂盒，包括免疫磁珠组分、酶工作液组分和解离剂，所述酶组分包括碱性磷酸酶标记的25-OH-VD衍生物，所述碱性磷酸酶标记的25-OH-VD衍生物，是由生物素标记的碱性磷酸酶与链霉亲和素标记的25-OH-VD衍生物通过生物素-链霉亲和素亲和放大连接构成。
进一步可选地，所述生物素包括(+)-生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯。
进一步可选地，所述生物素标记的碱性磷酸酶与链霉亲和素标记的25-OH-VD衍生物的质量比为2:1。
进一步可选地，所述碱性磷酸酶标记的25-OH-VD衍生物：
先通过碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺对25-OH-VD抗原小分子的羧基进行活化，活化后的25-OH-VD抗原小分子和链霉亲和素连接；碱性磷酸酶与生物素酯链接，通过链霉亲和素和生物素酯放大亲和系统形成最终的复合物。
进一步可选地，所述生物素酯与碱性磷酸酶的摩尔比为20:1。
进一步可选地，免疫磁珠为羧基磁珠。
进一步可选地，25-OH-VD单克隆抗体的包被量为1μg/mg。
进一步可选地，所述酶工作液组分还包括牛血清白蛋白、Tris、NaCl、PC950、tween20、MgCl2缓冲液、ZnCl2缓冲液。
进一步可选地，所述免疫磁珠组分包括羧基磁珠、25-OH-VD单克隆抗体、牛血清白蛋白、Tris、NaCl、PC950、tween20。
进一步可选地，25-OH-VD单克隆抗体的包被量为1μg/mg。
进一步可选地，所述解离剂采用摩尔浓度为0.2M的醋酸钠溶液。
进一步可选地，还包括AMPPD底物。
本发明具有如下的优点和有益效果：
1.本发明提供的一种25羟基维生素D化学发光测定试剂盒，是将25-OH-VD衍生物和碱性磷酸酶连接放大，提高25-OH-VD衍生物和ALP的连接效率，1个抗原小分子可连接4个碱性磷酸酶氨基分子，从而利于进一步提高试剂灵敏度。
2.本发明提供的一种25羟基维生素D化学发光测定试剂盒，选择的解离液为酸性解离液，能有效的解离25-OH-VD结合蛋白。此时相应的选择免疫磁珠为羧基磁珠，羧基磁珠制备的免疫磁珠几乎不受酸性解离剂的影响，相对于现有技术的霉亲和素磁珠，本发明的试剂灵敏度得到进一步提升。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为实施例2的对照组和索灵的临床一致性图。
图2为实施例2的实验组和索灵的临床一致性图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
在以下描述中，为了提供对本发明的透彻理解阐述了大量特定细节。然而，对于本领域普通技术人员显而易见的是：不必采用这些特定细节来实行本发明。在其他实施例中，为了避免混淆本发明，未具体描述公知的结构、电路、材料或方法。
实施例1
本实施例提供了一种25羟基维生素D化学发光测定试剂盒，主要由免疫磁珠组分、酶工作液组分、解离剂和AMPPD底物组成，具体介绍如下所示：
(一)免疫磁珠组分：0.2mg/ml羧基磁珠、0.2μg/ml 25-OH-VD单克隆抗体、1％牛血清白蛋白、0.01M Tris、0.9％NaCl、0.3％PC950、0.05％tween20。
备注：25-OH-VD单克隆抗体和羧基磁珠的比例即抗体包被量为1μg/mg。免疫磁珠组分的pH为7.4。
免疫磁珠组分由如下方法制备获得：
1、羧基磁珠活化：采用20mg/ml碳二亚胺(EDC)室温条件活化羧基磁珠(浓度1.0mg/ml)30min，EDC和磁珠质量比1:5。
2、羧基磁珠包被25-OH-VD单克隆抗体：在室温条件，将活化后的羧基磁珠和25-OH-VD单克隆抗体混匀，每毫克磁珠加1μg 25-OH-VD单克隆抗体，反应1小时。
3、磁珠封闭：采用20％BSA加入到包被抗体的磁珠中，每毫克磁珠加50μl 20％BSA，室温混匀，孵育1小时。
4、磁珠清洗定容。
(二)酶工作液组分：10mg/μg碱性磷酸酶标记的25-OH-VD衍生物、1％牛血清白蛋白、0.01M Tris、0.9％NaCl、PH7.4、0.3％PC950、0.05％tween20、1mM MgCl2缓冲液、0.1mMZnCl2缓冲液。
酶工作液组分由如下方法制备获得：
1、25-OH-VD衍生物活化：将20mg/ml的N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)和20mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)各50ul混合加入到1mg25-OH-VD衍生物中，此时DCC：NHS：25-OH-VD衍生物的质量比为1:1:1，室温条件下混匀，反应24h。
2、25-OH-VD衍生物偶连SA：活化后的25-OH-VD衍生物和链霉亲和素(SA)摩尔比为4:1，室温条件下混匀反应1小时，PBS透析过夜。
3、ALP偶连生物素酯：碱性磷酸酶(ALP)和(+)-生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯(BNHS)室温混匀30min，BNHSA和LP的摩尔比为20:1，PBS透析掉多于的生物素酯。
4、将标记生物素的ALP和偶连SA的VD衍生物，以2:1的质量比混合，室温条件下，混匀反应30min。
5、工作液稀释定容。
(三)解离剂：摩尔浓度为0.2M的醋酸钠溶液。
(四)AMPPD底物。
实施例2
本实施例提供25-OH-VD的检测试验方法，具体如下所示：
(一)试验方法
对照组：VD衍生物活化后不连接SA，而是一样的方法和ALP连接，稀释定容。
对照组试剂：
1、免疫磁珠组分：和实施例1组分和制备方法相同；
2、酶工作液组分：2mg/μg碱性磷酸酶标记的25-OH-VD衍生物、1％牛血清白蛋白、0.01M Tris、0.9％NaCl、PH7.4、0.3％PC950、0.05％tween20、1mM MgCl2缓冲液、0.1mMZnCl2缓冲液。
3、解离剂：和实施例1组分和制备方法相同。
4、AMPPD底物。
实验组：采用实施例1制备的25羟基维生素D化学发光测定试剂盒。
(二)试验方案
对照组和实验组分别检测相同的6点校准曲线(0、7.5、15、30、75、150ng/ml)和有值的临床样本，比较灵敏度、线性和发光值，计算临床的浓度值和标示值的一致性。
具体地：
解离剂、待测物、免疫磁珠等体积各50ul混匀，37℃反应8min，再加入50ul体积的酶标衍生物37℃反应8min，吸附免疫复合物磁珠到450ul的清洗液中清洗磁珠，重复两次清洗，然后吸附免疫复合物磁珠到150ulAMPPD底物液中，检测读数。通过浓度-相对发光值(RLU)的校准曲线，计算出待测物的含量。
试验检测设备：新健康成CEL1600全自动化学发光免疫分析仪。
(三)试验结果
检测结果如表1、表2、图1和图2所示。如表1所示，通过信噪比可得出实验组的灵敏度远远高于对照组的灵敏度；且实验组的发光值要远远高于对照组的发光值。如表2、图1、图2所示，实验组的临床测值更接近比对厂家索灵的结果值，二者相关性R2达0.96，对照组的测值较差，相关性较差。
表1
Figure BDA0003703589100000041
Figure BDA0003703589100000051
表2
Figure BDA0003703589100000052
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种25羟基维生素D化学发光测定试剂盒，包括免疫磁珠组分、酶工作液组分和解离剂，所述酶组分包括碱性磷酸酶标记的25-OH-VD衍生物，其特征在于，
所述碱性磷酸酶标记的25-OH-VD衍生物，是由生物素标记的碱性磷酸酶与链霉亲和素标记的25-OH-VD衍生物通过生物素-链霉亲和素亲和放大连接构成。
2.根据权利要求1所述的一种25羟基维生素D化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述生物素包括(+)-生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯。
3.根据权利要求1所述的一种25羟基维生素D化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的碱性磷酸酶与链霉亲和素标记的25-OH-VD衍生物的质量比为2:1。
4.根据权利要求1所述的一种25羟基维生素D化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记的25-OH-VD衍生物：
先通过碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺对25-OH-VD抗原小分子的羧基进行活化，活化后的25-OH-VD抗原小分子和链霉亲和素连接；碱性磷酸酶与生物素酯链接，通过链霉亲和素和生物素酯放大亲和系统形成最终的复合物。
5.根据权利要求3所述的一种25羟基维生素D化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述生物素酯与碱性磷酸酶的摩尔比为20:1。
6.根据权利要求1所述的一种25羟基维生素D化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述酶工作液组分还包括牛血清白蛋白、Tris、NaCl、PC950、tween20、MgCl2缓冲液、ZnCl2缓冲液。
7.根据权利要求1所述的一种25羟基维生素D化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述免疫磁珠组分包括羧基磁珠、25-OH-VD单克隆抗体、牛血清白蛋白、Tris、NaCl、PC950、tween20。
8.根据权利要求7所述的一种25羟基维生素D化学发光测定试剂盒，其特征在于，25-OH-VD单克隆抗体的包被量为1μg/mg。
9.根据权利要求1至8任一项所述的一种25羟基维生素D化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述解离剂采用摩尔浓度为0.2M的醋酸钠溶液。
10.根据权利要求1所述的一种25羟基维生素D化学发光测定试剂盒，其特征在于，还包括AMPPD底物。
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