CN111751546A - 基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于免疫传感器领域，具体涉及一种基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法及其应用。首先将氧化石墨烯分散液滴涂到经清洁后的传感器电极上，再将壳聚糖乙酸溶液滴涂到电极表面，经电化学还原将氧化石墨烯转化为石墨烯，利用石墨烯生物相容性及表面的羧基使钙卫蛋白抗体易于富集并固定在电极表面。上述电极经活化、固定钙卫蛋白抗体、封闭活性点位，最后通过抗原抗体的免疫反应将钙卫蛋白固定在电极上。由于石墨烯优良的导电性能电极在电化学探针铁氰化钾溶液中的峰电流明显增大，可显著提高该免疫传感器的灵敏度。石墨烯优异的生物相容性可有效提高电极表面钙卫蛋白抗体的修饰量，进而增大电极对钙卫蛋白浓度的检测范围。
Description
技术领域
本发明属于免疫传感器领域，具体涉及一种基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法及其应用。
背景技术
结直肠癌是临床常见的恶性肿瘤之一，在消化系统肿瘤疾病中具有较高的发病率。随着环境污染与食品安全问题的日益严峻和人们生活节奏的加快，饮食结构发生不同程度的改变，加之人口老龄化的发展和身体机能的减弱，使得老年人成为结直肠癌的高发人群。近年来，该病的发病率呈现出明显增加的趋势，严重影响着公众身体的健康，早期发现、早期诊断、早期治疗对于延长患者生存时间、改善患者预后和降低死亡率具有非常重要的意义。钙卫蛋白是一种中性粒细胞与巨噬细胞胞质来源的含钙蛋白，可以在粪便中稳定存在的炎性标记物。研究显示在结直肠癌患者粪便中，钙卫蛋白的含量较正常值明显升高，因此检测粪便中的钙卫蛋白浓度可作为筛查早期大肠癌患者的重要手段之一。
钙卫蛋白(Calprotectin,CP)是一种钙结合蛋白，属于S100蛋白家族，最早在1980年从中性粒细胞中分离而被发现。钙卫蛋白由两条S100A9重链和一条S100A8轻链非共价结合形成异二聚体，每条链可结合两个钙离子。钙卫蛋白是一种杂合性的钙结合蛋白，在钙离子存在的情况下具有抗蛋白酶活性，在肠腔和外界环境中长期保持稳定，不被各种酶和细菌破坏，是中性粒细胞和活化的巨噬细胞胞质中重要的蛋白质，可以作为急性炎性细胞活化的标志物。钙卫蛋白在粪便中非常稳定，可以在室温下保存7天而不会引起损失且不随温度变化而变化。通过检测钙卫蛋白浓度能够鉴别大肠癌和炎症性肠病(IBD)。研究表明钙卫蛋白对腺瘤的敏感性为55％，而粪便隐血实验(FOBT)对腺瘤的敏感性仅为10％。钙卫蛋白的检测对于早期发现腺瘤具有更高的价值，这是因为腺瘤的恶变期为5～7年，腺瘤是唯一可以在恶变前可以检查到的肿瘤，检测钙卫蛋白对肿瘤早期排查具有极其重要的意义。电化学生物传感器检测钙卫蛋白的方法同结肠镜检查相比，具有简便、经济、无创性等优点，一定程度上可以避免结肠镜检查给患者造成的痛苦，且弥补不能随时复查的不足。同粪便潜血检验相比较，粪便钙卫蛋白可以定量检测，能发现早期不出血病灶，而且结果不受全身情况、饮食成分、一般药物及营养支持治疗的影响。还可以用于对已经确诊的病例的病情监测，对评价药物疗效也具有重要指导意义。目前国内外研究结果均表明结直肠癌患者粪便中钙卫蛋白水平高于正常人。Poullis[1]等研究证明粪便钙卫蛋白与大肠癌的相关危险因素呈高度正相关。郭汉斌等[2]研究发现粪便钙卫蛋白浓度对大肠癌的检测有较高的敏感性，且不受肿瘤部位的影响。Tibble等[3]研究发现粪钙卫蛋白检测比粪便潜血试验灵敏度高。
目前，临床常用的对于钙卫蛋白的检测方法主要有酶联免疫法(ELISA)和胶体金等方法，但这些方法都有各自的特点及不足。ELISA法由于定量准确，广泛应用于医院检验，但该法存在检测步骤多、时间长和不便捷的缺点；胶体金法虽然方便、快捷，但只是一种定性方法，灵敏度较低。因此，临床检测上迫切需求建立一种快速、便捷、经济的钙卫蛋白定量检测方法。电化学免疫传感器测定法可以满足上述要求并且具有分析速度快、分析方法简便、灵敏度高等优点。
近年来出现的新兴纳米碳材料石墨烯具有独特的结构和优异的性能，它具有非常高的机械强度、大的比表面积以及极强的电子传输能力，且成本低廉，可加工性好；石墨烯大的比表面积对钙卫蛋白抗体具有富集作用，而石墨烯的生物相容性使钙卫蛋白抗体易于在其表面吸附并保持其生物活性，利于后续的与钙卫蛋白发生免疫反应，实现对钙卫蛋白浓度的检测。综上所述，石墨烯的生物相容性保证其表面吸附的钙卫蛋白抗体保持生物活性；石墨烯的高导电性和高电子传导速率可以实现对电极吸附不同浓度的钙卫蛋白给出不同的电化学检测峰电流。综上，石墨烯修饰电极有望用于钙卫蛋白的临床检验。
参考文献：
[1]Poullis A,Foster R,Shetty A,et al.Cancer Epidemiol BiomarkersPrev.,2004,13(2):279-284.
[2]郭汉斌,曹建彪,王志红等,胃肠病学和肝病学杂志,2009,18(8):744-747.
[3]Tibble J,Sigthorsson G,Foster R,et al.Gut,2001,49(3):402-408.
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法及其应用，采用石墨烯修饰电极既利于钙卫蛋白及其抗体的吸附又能提高电极的导电性，因此该免疫传感器具有灵敏度高、稳定性好、快速定量检测、抗干扰能力强、成本低、使用方便且制备过程简单的特点，可广泛地用于疑似结直肠癌患者的粪便钙卫蛋白检查。
本发明的技术方案是：
一种基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)石墨烯修饰电极的制备
将化学氧化法制备的氧化石墨烯分散于磷酸盐缓冲溶液中形成稳定的分散液，将该分散液滴涂到经清洁后的玻碳电极上，氧化石墨烯修饰过的电极在室温下干燥；
(2)为了提高修饰电极的稳定性，将步骤(1)制得的修饰电极继续滴涂壳聚糖乙酸溶液；
(3)电极上氧化石墨烯的电化学还原
将步骤(2)制得的修饰电极作为工作电极放入摩尔浓度为0.05～0.2M磷酸盐缓冲溶液中，与饱和甘汞参比电极和铂片对电极构成三电极体系，在-1.5～0V电压范围内做循环伏安扫描，使氧化石墨烯还原成石墨烯，从而进一步提高电极的导电性及对钙卫蛋白抗体的吸附性能，增大钙卫蛋白抗体在电极上的吸附量；
(4)用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N羟基琥珀酰亚胺活化电极表面的羧基
将4～6μL的含有50～600mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲溶液滴涂到步骤(3)制得的修饰电极上，并在室温下活化1～3小时；
(5)修饰钙卫蛋白抗体
将5～7μL浓度为25～300μg/mL的钙卫蛋白抗体溶液滴加到步骤(4)制得的电极表面，于25～35℃恒温箱中孵化0.5～2小时，用8～12mM的磷酸盐缓冲溶液洗去未与电极结合牢固的钙卫蛋白抗体；
(6)封闭电极非特异性活性位点
用4～6μL浓度为0.5～3wt％的牛血清白蛋白溶液封闭步骤(5)制得电极的表面非特异性活性位点，于25～35℃恒温箱中孵化0.5～2小时，用8～12mM的磷酸盐缓冲溶液清洗掉未与电极结合牢固的牛血清白蛋白；
(7)修饰钙卫蛋白
将5～7μL浓度为10～200ng/mL的一系列不同浓度的钙卫蛋白用于和电极上抗体特异性识别，于25～35℃恒温箱中孵化0.5～2小时，用8～12mM的磷酸盐缓冲溶液清洗掉未与电极上抗体结合牢固的钙卫蛋白，于4℃冰箱中储存备用。
所述的基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法，步骤(1)中，氧化石墨烯在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为0.05mg/ml～5mg/ml，修饰电极所用氧化石墨烯分散液用量为0.5～20μL。
所述的基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法，步骤(1)中，氧化石墨烯在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为0.5～3mg/ml，修饰电极所用氧化石墨烯分散液用量为2～15μL。
所述的基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法，步骤(2)中，壳聚糖乙酸溶液采用浓度为0.1～0.5wt％的壳聚糖乙酸溶液。
所述的基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法，步骤(4)中，N羟基琥珀酰亚胺在磷酸盐缓冲溶液中的摩尔浓度为100～200mM，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在磷酸盐缓冲溶液中的摩尔浓度为200～500mM。
所述方法制备的基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的应用，钙卫蛋白生物传感器用于检测钙卫蛋白，包括检测粪便中的钙卫蛋白、血清中的钙卫蛋白或尿中的钙卫蛋白。
所述的基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的应用，石墨烯修饰电极传感器对钙卫蛋白溶液浓度的检测过程如下：
将修饰有钙卫蛋白的电极与银/氯化银电极和铂片电极构成三电极体系，以溶解于磷酸盐缓冲溶液的摩尔浓度为1～3mM的铁氰化钾溶液为电解液，在电化学工作站上在-0.2～0.6V电压范围内做循环伏安扫描或差分脉冲伏安扫描，在循环伏安扫描或差分脉冲伏安扫描曲线上的峰电流随钙卫蛋白浓度呈规律性变化，从而实现对钙卫蛋白浓度的检验。
本发明的设计思想是：
本发明将石墨烯与壳聚糖复合作为电极的修饰层，石墨烯优异的生物相容性有助于实现生物大分子在电极上的吸附。石墨烯上丰富的含氧官能团有助于钙卫蛋白抗体分子在电极表面结合，通过钙卫蛋白抗体与钙卫蛋白的免疫反应，实现钙卫蛋白与电极的结合，进而实现钙卫蛋白的直接检测。以上述的修饰电极为工作电极，银/氯化银为参比电极，铂片电极为对电极构成的传感器，可实现钙卫蛋白的定量、简便、快速、灵敏地检测。
与现有的粪便钙卫蛋白测试方法相比较，本发明具有如下优势：
1、本发明所述的新型石墨烯修饰电极使用化学氧化法制备的氧化石墨烯，该氧化石墨烯通常含有较丰富的含氧官能团，即使经电化学还原后，仍保留一定量的含氧官能团(包括羧基等)，这些官能团有助于石墨烯与钙卫蛋白抗体的相互作用，二者之间较强的作用使钙卫蛋白抗体易于结合在石墨烯表面。钙卫蛋白通过与电极上的钙卫蛋白抗体发生免疫反应而固定在电极表面，从而实现钙卫蛋白的电化学检测。
2、本发明所述的新型石墨烯修饰电极上由于使用壳聚糖，壳聚糖的优良生物相容性对钙卫蛋白抗体在电极上的结合和生物活性的保持也具有促进作用。同时，壳聚糖在电极上形成的保护膜对其他杂质给电极造成的污染有阻隔作用。钙卫蛋白在电极上的修饰采用抗原抗体的免疫结合，因此该修饰电极具有较强的专一性，保证构建的钙卫蛋白生物传感器的稳定性和专一性。
3、本发明所述的新型钙卫蛋白免疫传感器电极上仅修饰石墨烯作为电化学活性物质，没有使用其它电活性染料作为电子媒介体，因此简化制备工艺，降低制备成本，同时还提高电极的稳定性。
4、本发明提供的新型钙卫蛋白免疫传感器与酶联免疫法相比具有方法简单、检测快速的优点，与胶体金法相比可克服其只能做到定性检测的弊端，可实现定量检测。本发明的钙卫蛋白免疫传感器制备方法简单易行，易于实现规模化生产。因此，本发明具有重要的实用价值。
附图说明
图1.修饰不同浓度钙卫蛋白的电极的DPV曲线。图中，横坐标E step代表由电压扫描产生的步进电压值(V)，纵坐标I delta代表脉冲前后电流的变化(μA)。
图2.检测钙卫蛋白浓度的I-C工作曲线。图中，横坐标C代表电极上修饰的钙卫蛋白浓度(ng/mL)，纵坐标I delta代表脉冲前后电流的变化(μA)，Calprotectinconcentration curve代表钙卫蛋白浓度的工作曲线，Linear Fit of Calprotectinconcentration curve代表检测钙卫蛋白浓度的工作曲线的线性拟合。
具体实施方式
在具体实施过程中，本发明提出基于石墨烯的钙卫蛋白免疫传感器的制备方法，首先是将氧化石墨烯分散液滴涂到经清洁后的传感器电极上，再将壳聚糖乙酸溶液滴涂到电极表面，经电化学还原将氧化石墨烯转化为石墨烯，以提高电极的导电性和利用石墨烯生物相容性及表面的羧基使钙卫蛋白抗体易于富集并固定在电极表面。上述电极经活化、固定钙卫蛋白抗体、封闭活性点位，最后通过抗原抗体的免疫反应将钙卫蛋白固定在电极上，通过电极上修饰不同浓度钙卫蛋白所对应的循环伏安曲线或差分脉冲曲线峰电流的变化实现对钙卫蛋白浓度的检验。
为了使本发明的内容更容易理解，下面结合具体实施方法对本发明做进一步的说明。
实施例1
本实施例中，基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法及其应用如下：
1.钙卫蛋白免疫传感器电极的修饰
(1)分别配制浓度为1mg/ml氧化石墨烯的磷酸盐(PBS)分散液和浓度为0.2wt％的壳聚糖乙酸溶液。
(2)对经抛光处理的电极表面进行修饰
首先在电极上滴加1μL的上述氧化石墨烯分散液，待电极室温干燥后，再滴加5μL浓度为0.2wt％的壳聚糖乙酸溶液。待电极干燥后，将上述的修饰电极放入浓度为0.lmol/L的PBS中，在0～-1.5V电压范围做循环伏安扫描10周，使电极上的氧化石墨烯还原成石墨烯。配制含有200mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和400mM N羟基琥珀酰亚胺(NHS)的PBS溶液，将5μL上述溶液滴涂到修饰有石墨烯的电极上，并在室温下活化2小时。
(3)在电极上修饰钙卫蛋白抗体
将6μL浓度为50μg/mL的钙卫蛋白抗体溶液(该钙卫蛋白抗体溶液的组成和制作过程如下：将购买的浓度为4.53mg/mL钙卫蛋白抗体溶液用浓度为5mM的PBS溶液稀释成50μg/mL的溶液)，滴加到经活化的电极表面，修饰后的电极于30℃恒温箱中孵化l小时。进一步封闭电极非特异性活性位点，用5μL浓度为1wt％的牛血清白蛋白溶液封闭修饰有钙卫蛋白抗体的电极表面的非特异性活性位点。进一步在上述修饰电极上修饰钙卫蛋白：将6μL浓度为20ng/mL的钙卫蛋白滴涂到经封闭的电极表面，使钙卫蛋白和电极上的钙卫蛋白抗体发生特异性识别，然后将修饰有钙卫蛋白的电极于30℃恒温箱中孵化l小时。
2.钙卫蛋白免疫传感器检测方法
将修饰有钙卫蛋白的电极与银/氯化银电极和铂片电极构成三电极体系，以溶解于PBS的摩尔浓度为2mM的铁氰化钾溶液为电解液，在电化学工作站上在-0.2～0.6V电压范围内做差分脉冲伏安(DPV)扫描，在DPV曲线上对应的峰电流48μA。
实施例2
钙卫蛋白免疫传感器电极的修饰方法同实施例1，只是电极上钙卫蛋白的修饰量为40ng/mL，测试方法也同实施例1，在DPV曲线上对应的峰电流38.3μA。
如图1所示，从修饰不同浓度钙卫蛋白的电极的DPV曲线可以看出，随着修饰的钙卫蛋白的浓度升高，对应的DPV曲线上峰电流明显降低。这是因为钙卫蛋白作为生物活性物质是没有电活性的，电极上修饰的钙卫蛋白的浓度越高，对应电极的阻抗就越大，使得DPV曲线上峰电流越低。DPV曲线上峰电流随钙卫蛋白浓度变化而有规律的变化，是钙卫蛋白实现电化学检测的先决条件。
如图2所示，从检测钙卫蛋白浓度的I-C工作曲线可以看出，钙卫蛋白浓度与对应的DPV曲线上峰电流有良好的线性相关性，在该工作曲线用未知浓度的钙卫蛋白对应的峰电流就可给出相应的浓度，即可实现钙卫蛋白浓度的检测。
对比例1
钙卫蛋白免疫传感器电极的修饰方法同实施例1，只是电极上无钙卫蛋白的修饰，测试方法也同实施例1，在DPV曲线上对应的峰电流57.8μA。
实施例结果表明，免疫传感器电极表面修饰的石墨烯可以加快电子传递，增强检测信号。用石墨烯作为电极的修饰层，由于其优良的导电性能电极在电化学探针铁氰化钾溶液中的峰电流明显增大，可显著提高该免疫传感器的灵敏度。石墨烯优异的生物相容性可有效提高电极表面钙卫蛋白抗体的修饰量，进而增大电极对钙卫蛋白浓度的检测范围。本发明提出的用免疫传感传感器方法检测钙卫蛋白与其它方法相比具有检测方法简便、检测速度快和检测成本低的特点，且该传感器具有较强的专一性，可广泛地用于疑似节直肠道恶性肿瘤病人的粪便钙卫蛋白检验。
Claims (7)
1.一种基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法，其特征是，包括如下步骤：
(1)石墨烯修饰电极的制备
将化学氧化法制备的氧化石墨烯分散于磷酸盐缓冲溶液中形成稳定的分散液，将该分散液滴涂到经清洁后的玻碳电极上，氧化石墨烯修饰过的电极在室温下干燥；
(2)为了提高修饰电极的稳定性，将步骤(1)制得的修饰电极继续滴涂壳聚糖乙酸溶液；
(3)电极上氧化石墨烯的电化学还原
将步骤(2)制得的修饰电极作为工作电极放入摩尔浓度为0.05～0.2M磷酸盐缓冲溶液中，与饱和甘汞参比电极和铂片对电极构成三电极体系，在-1.5～0V电压范围内做循环伏安扫描，使氧化石墨烯还原成石墨烯，从而进一步提高电极的导电性及对钙卫蛋白抗体的吸附性能，增大钙卫蛋白抗体在电极上的吸附量；
(4)用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N羟基琥珀酰亚胺活化电极表面的羧基
将4～6μL的含有50～600mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲溶液滴涂到步骤(3)制得的修饰电极上，并在室温下活化1～3小时；
(5)修饰钙卫蛋白抗体
将5～7μL浓度为25～300μg/mL的钙卫蛋白抗体溶液滴加到步骤(4)制得的电极表面，于25～35℃恒温箱中孵化0.5～2小时，用8～12mM的磷酸盐缓冲溶液洗去未与电极结合牢固的钙卫蛋白抗体；
(6)封闭电极非特异性活性位点
用4～6μL浓度为0.5～3wt％的牛血清白蛋白溶液封闭步骤(5)制得电极的表面非特异性活性位点，于25～35℃恒温箱中孵化0.5～2小时，用8～12mM的磷酸盐缓冲溶液清洗掉未与电极结合牢固的牛血清白蛋白；
(7)修饰钙卫蛋白
将5～7μL浓度为10～200ng/mL的一系列不同浓度的钙卫蛋白用于和电极上抗体特异性识别，于25～35℃恒温箱中孵化0.5～2小时，用8～12mM的磷酸盐缓冲溶液清洗掉未与电极上抗体结合牢固的钙卫蛋白，于4℃冰箱中储存备用。
2.根据权利要求1所述的基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法，其特征是，步骤(1)中，氧化石墨烯在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为0.05mg/ml～5mg/ml，修饰电极所用氧化石墨烯分散液用量为0.5～20μL。
3.根据权利要求1所述的基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法，其特征是，步骤(1)中，氧化石墨烯在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为0.5～3mg/ml，修饰电极所用氧化石墨烯分散液用量为2～15μL。
4.根据权利要求1所述的基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法，其特征是，步骤(2)中，壳聚糖乙酸溶液采用浓度为0.1～0.5wt％的壳聚糖乙酸溶液。
5.根据权利要求1所述的基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法，其特征是，步骤(4)中，N羟基琥珀酰亚胺在磷酸盐缓冲溶液中的摩尔浓度为100～200mM，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在磷酸盐缓冲溶液中的摩尔浓度为200～500mM。
6.一种权利要求1至5之一所述方法制备的基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的应用，其特征在于，钙卫蛋白生物传感器用于检测钙卫蛋白，包括检测粪便中的钙卫蛋白、血清中的钙卫蛋白或尿中的钙卫蛋白。
7.根据权利要求6所述的基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的应用，其特征在于，石墨烯修饰电极传感器对钙卫蛋白溶液浓度的检测过程如下：
将修饰有钙卫蛋白的电极与银/氯化银电极和铂片电极构成三电极体系，以溶解于磷酸盐缓冲溶液的摩尔浓度为1～3mM的铁氰化钾溶液为电解液，在电化学工作站上在-0.2～0.6V电压范围内做循环伏安扫描或差分脉冲伏安扫描，在循环伏安扫描或差分脉冲伏安扫描曲线上的峰电流随钙卫蛋白浓度呈规律性变化，从而实现对钙卫蛋白浓度的检验。
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