CN109916985A - 一种检测mmp-14的电化学交流阻抗生物传感器及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测MMP‑14的电化学交流阻抗生物传感器及其制备方法，将多肽抑制剂溶解于Tris‑HCl缓冲液中，得到MMP‑14特异性识别的探针溶液，其中，多肽抑制剂的氨基酸序列为：GYPKSALR‑(CH2)6‑Cys；将金电极浸入MMP‑14特异性识别的探针溶液中进行自组装修饰，然后用Tris‑HCl缓冲溶液冲洗，得到IVSC/GE电极；将MCH溶液滴加到IVSC/GE电极表面进行封闭，冲洗电极表面，得到检测MMP‑14的电化学交流阻抗生物传感器。本发明的电化学交流阻抗生物传感器特异性高。
Description
技术领域
本发明属于医疗器械领域，涉及一种检测MMP-14的电化学交流阻抗生物传感器及其制备方法。
背景技术
在生理和病理条件下，基质金属蛋白酶(MMPs)是一种在组织重塑和血管生成过程中负责降解大部分细胞外基质的酶。据报道，MMPs主要在血管疾病、癌症、骨骼疾病和神经退行性等疾病中过度表达。MMPs可作为结直肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、乳腺癌、神经退行性疾病、免疫疾病和心血管疾病的标志物。因此，研发灵敏且精确的MMPs传感技术与治疗相关疾病密切相关，例如，癌症的诊断和药物的筛选。
近些年来，对MMP-9、MMP-3、MMP-7和MMP-2的活性分析成为了研究焦点，这些研究是基于MMPs催化结构域(CAT)中筛选的MMPs特异性多肽的水解断裂。由于底物肽的酶解反应往往会产生两个片段，因此可以通过荧光法或电化学法生物传感技术检测酶解后的多肽片段对MMPs进行分析，这些生物传感技术检测MMPs具有较高的灵敏度。然而，肽裂解片段与荧光分子或电活性分子结合段往往会产生非特异性吸附，从而产生假阳性信号。因此，上述生物传感技术因缺乏特异性，在临床上难以应用于检测活性位点导向的MMPs。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种检测MMP-14的电化学交流阻抗生物传感器及其制备方法，能对MMP-14进行即时检测，特异性强。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种检测MMP-14的电化学交流阻抗生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，配制MMP-14特异性识别的探针
将多肽抑制剂溶解于Tris-HCl缓冲液中，得到MMP-14特异性识别的探针溶液，其中，多肽抑制剂的氨基酸序列为：GYPKSALR-(CH2)6-Cys；
步骤2，电化学交流阻抗生物传感器的组装
步骤2.1，将金电极浸入MMP-14特异性识别的探针溶液中进行自组装修饰，然后用Tris-HCl缓冲溶液冲洗，得到IVSC/GE电极；
步骤2.2，将MCH溶液滴加到IVSC/GE电极表面进行封闭，封闭后用 Tris-HCl缓冲溶液冲洗电极表面，即得到检测MMP-14的电化学交流阻抗生物传感器。
优选的，步骤1中，MMP-14特异性识别的探针溶液中多肽抑制剂的浓度为2-20μM。
优选的，步骤2.1中的金电极在浸入MMP-14特异性识别的探针溶液中之前，进行以下处理：将金电极抛光，清洗，以清洗后的金电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，组成三电极体系，在电化学溶液中进行循环伏安扫描至循环伏安图谱稳定。
进一步的，扫描电位范围为-0.3V～+1.5V，扫描速率为0.1V.S-1。
进一步的，金电极抛光具体是在抛光布上用三氧化二铝抛光。
进一步的，清洗是分别在乙醇和去离子水中超声清洗2-5min。
优选的，步骤2.1中，自组装修饰的时间为10-15h。
优选的，步骤2.2中，MCH溶液的浓度为0.1-10mM。
优选的，步骤2.2中，封闭时间为30-60min。
采用上述制备方法制备得到的检测MMP-14的电化学交流阻抗生物传感器。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
所有MMPs的类血红素结构域(PEX)均呈高度保守的圆盘形状，其中的肽链相互折叠成具有伪四重对称性的β-螺旋桨状。不同MMP的PEX 中，第四外链(S4)的每个叶片明显不同，这说明了每个叶片介导的外链与其它特异性蛋白相关。用X射线衍射分析离体的MMP-14的PEX(PEX- 14)，发现该结构域中叶片I和叶片IV最外部的肽链凸起，这是其它MMPs 所不具备的特征。MMP-14可以通过PEX的叶片IV发生同源二聚化，也可以通过PEX的叶片I与CD44发生异源二聚化，进一步的研究发现，合成的多肽抑制剂IVS4和IS4可以分别干扰MMP-14的同源二聚化和与CD44 的异源二聚化。这说明多肽抑制剂IVS4和IS4可以和PEX-14中的叶片IV 和叶片I发生二聚化，可作为检测MMP-14的识别物质。本发明利用PEX 筛选出来的多肽抑制剂(IVSC)作为分子识别物质，因在IVSC上标记的 (CH2)6-Cys带有巯基，可通过Au-S自组装固定到金电极表面，用MCH封闭后即得到检测MMP-14的电化学交流阻抗生物传感器。当传感器与 MMP-14相互作用后，MMP-14与IVSC因发生二聚化而结合到电极表面，由于MMP-14不具有导电性，从而阻碍了[Fe(CN)6]3-/4-在金电极表面的电子转移，使得交流阻抗值随着MMP-14浓度的增加而增加，基于此实现对 MMP-14高选择性和高灵敏度检测。交流阻抗传感器检测MMP-14的原理图如图1所示。本发明的优点在于：(1)灵敏度高，本发明利用的电化学交流阻抗技术作为信号输出方式，该技术本身具有极高的灵敏度，本发明中的化学交流阻抗生物传感器可定量检测0.19μg/L MMP-14；(2)选择性高，利用MMP-14与多肽抑制剂(IVSC)发生二聚化，使电化学交流阻抗生物传感器界面上的电化学阻抗值增大的原理来检测MMP-14，常见的干扰蛋白： MMP-2、MMP-7、Thrombin、BSA对检测均无干扰；(3)步骤简单，化学交流阻抗生物传感器经组装好以后，与待测MMP-14溶液结合30min后就可以一步检测；(4)成本低廉，所需试剂量少。
本发明得到的检测MMP-14的电化学交流阻抗生物传感器，当传感器与MMP-14相互作用后，MMP-14与IVSC因发生二聚化而结合到电极表面，从而阻碍了[Fe(CN)6]3-/4-在金电极表面的电子转移，使得交流阻抗值随着 MMP-14浓度的增加而增加，基于此实现对MMP-14高选择性和高灵敏度检测，由于本发明传感器是利用MMP-14与IVSC的特异性反应，因此检测结果更准确。
附图说明
图1为本发明检测MMP-14的电化学交流阻抗生物传感器用于检测 MMP-14的原理图。
图2为不同浓度MMP-14对应的电化学阻抗图谱。
图3为电化学阻抗值与MMP-14浓度的线性关系图。
图4为电化学交流阻抗生物传感器检测MMP-14的选择性结果图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
一种检测MMP-14的电化学交流阻抗生物传感器的制备方法，具体制备步骤如下：
(1)金电极的预处理
将金电极在柔软的抛光布上分别用1.0μM、0.3μM和0.05μM的三氧化二铝抛光打磨至镜面，打磨后用去离子水冲洗电极表面。随后将金电极分别在乙醇和去离子水中超声清洗2-5min。以清洗后的金电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极(饱和KCl)组成三电极体系在 0.1-0.5M H2SO4溶液中进行循环伏安扫描至循环伏安图谱稳定。扫描电位范围为-0.3V～+1.5V，扫描速率为0.1V.S-1。
(2)配置MMP-14特异性识别的探针
用缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 7.4))配置2-20μM的多肽抑制剂 (IVSC)，得到MMP-14特异性识别的探针溶液。
(3)电化学交流阻抗生物传感器的组装
a.将预处理后的金电极(φ＝2.0mm)浸入0.5mL多肽抑制剂(IVSC) 溶液中修饰10-15h，然后用Tris-HCl(pH 7.4)缓冲溶液冲洗以去除任何吸附物质，得到IVSC/GE。其中多肽抑制剂(IVSC)的氨基酸序列为： GYPKSALR-(CH2)6-Cys。
b.将10-30μL含有0.1-10mM MCH的溶液滴加到IVSC/GE电极表面，封闭30-60min后用10mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，即得到可检测MMP-14的电化学交流阻抗生物传感器。Tris-HCl缓冲溶液的浓度可以是0.01-0.1M内的任一值，pH值可以为7-8内的任一值。
上述检测MMP-14的电化学交流阻抗生物传感器的使用方法，具体包括以下步骤：
(1)以上述制备得到的检测MMP-14的电化学交流阻抗生物传感器为工作电极，Ag/AgCl电极(饱和KCl)为参比电极，铂丝电极为对电极，构建三电极系统；
(2)将工作电极表面浸入2mL含有已知浓度MMP-14和10mM Tris- HCl(pH 7.4)的待测液中，30min后用10mM Tris-HCl(pH 7.4)冲洗除去任何吸附的物质。在电化学阻抗测试液中，测试电化学阻抗Ret，采用的电化学方法：交流阻抗法；偏置电位：0.2V；频率：100kHz～1.0Hz；振幅： 5.0mV；重复该步骤得到多组不同MMP-14浓度对应的电化学阻抗值；MMP-14浓度范围为1.0μg/L-50μg/L。
(3)在1.0μg/L-50μg/L浓度范围内，电化学阻抗值随MMP-14浓度的增大而增大(不同浓度的MMP-14对应的电化学阻抗图谱，如图2所示)。根据步骤(2)得到的多组不同MMP-14浓度对应的电化学阻抗数据模拟得到MMP-14浓度与电化学阻抗之间的拟合曲线。
(4)将工作电极浸入待测溶液中，在电化学阻抗测试液中，测试电化学阻抗Ret，根据MMP-14浓度与电化学阻抗之间的拟合曲线，得到待测溶液中MMP-14的浓度，单位为μg/L。
所述的电化学阻抗测试液为含10mM K4[Fe(CN)6]-、10mM K3[Fe(CN)6]-、10mM NaCl的Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4)。
本发明采用所述电化学交流阻抗生物传感器可以检测MMP-14，测试时步骤简单，电化学交流阻抗生物传感器组装好以后，与待测MMP-14溶液结合30min后就可以一步检测，有利于多种疾病的诊断和治疗。
以下结合附图实施列对本发明做进一步的详细描述。
具体实施例1
一种检测MMPs的电化学交流阻抗生物传感器的制备方法，本发明中所检测的MMPs为MMP-14，具体制备步骤如下：
(1)金电极的预处理
a.金电极在柔软的抛光布上分别用1.0μM、0.3μM和0.05μM的三氧化二铝抛光打磨至镜面，打磨后用去离子水冲洗电极表面。随后将金电极分别在乙醇和去离子水中超声清洗5min。以清洗后的金电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极(饱和KCl)组成三电极体系在0.5 M H2SO4溶液中进行循环伏安扫描至循环伏安图谱稳定。扫描电位范围为- 0.3V～+1.5V,扫描速率为0.1V.S-1。
(2)配置MMP-14特异性识别的探针
用缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 7.4))配置15μM的多肽抑制剂 (IVSC)，得到MMP-14特异性识别的探针溶液。
(3)电化学交流阻抗传感器的组装
a.将预处理后的金电极(φ＝2.0mm)浸入0.5mL 15μM多肽抑制剂(IVSC)溶液中修饰10h，然后用10mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲溶液充分冲洗电极表面除去任何吸附的物质，得到IVSC/GE。其中多肽抑制剂 (IVSC)的氨基酸序列为：GYPKSALR-(CH2)6-Cys。
b.将10μL 0.1mM MCH溶液滴加到IVSC/GE电极表面，封闭30min 后用10mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)冲洗电极表面，即得到可检测MMP-14 的交流阻抗生物传感器。
具体实施例2
一种检测MMPs的电化学交流阻抗生物传感器的制备方法，本发明中所检测的MMPs为MMP-14，具体制备步骤如下：
(1)金电极的预处理
a.金电极在柔软的抛光布上分别用1.0μM、0.3μM和0.05μM的三氧化二铝抛光打磨至镜面，打磨后用去离子水冲洗电极表面。随后将金电极分别在乙醇和去离子水中超声清洗2min。以清洗后的金电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极(饱和KCl)组成三电极体系在0.1 M H2SO4溶液中进行循环伏安扫描至循环伏安图谱稳定。扫描电位范围为- 0.3V～+1.5V，扫描速率为0.1V.S-1。
(2)配置MMP-14特异性识别的探针
用缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 7.4))配置2μM的多肽抑制剂(IVSC)，得到MMP-14特异性识别的探针溶液。
(3)电化学交流阻抗传感器的组装
a.将预处理后的金电极(φ＝2.0mm)浸入0.5mL 2μM多肽抑制剂 (IVSC)溶液中修饰12h，然后用10mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲溶液充分冲洗电极表面除去任何吸附的物质，得到IVSC/GE。其中多肽抑制剂 (IVSC)的氨基酸序列为：GYPKSALR-(CH2)6-Cys。
b.将20μL 5mM MCH溶液滴加到IVSC/GE电极表面，封闭40min后用10mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)冲洗电极表面，即得到可检测MMP-14的交流阻抗生物传感器。
具体实施例3
一种检测MMPs的电化学交流阻抗生物传感器的制备方法，本发明中所检测的MMPs为MMP-14，具体制备步骤如下：
(1)金电极的预处理
a.金电极在柔软的抛光布上分别用1.0μM、0.3μM和0.05μM的三氧化二铝抛光打磨至镜面，打磨后用去离子水冲洗电极表面。随后将金电极分别在乙醇和去离子水中超声清洗3min。以清洗后的金电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极(饱和KCl)组成三电极体系在0.3 M H2SO4溶液中进行循环伏安扫描至循环伏安图谱稳定。扫描电位范围为- 0.3V～+1.5V，扫描速率为0.1V.S-1。
(2)配置MMP-14特异性识别的探针
用缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 7.4))配置20μM的多肽抑制剂 (IVSC)，得到MMP-14特异性识别的探针溶液。
(3)电化学交流阻抗传感器的组装
a.将预处理后的金电极(φ＝2.0mm)浸入0.5mL 20μM多肽抑制剂 (IVSC)溶液中修饰15h，然后用10mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲溶液充分冲洗电极表面除去任何吸附的物质，得到IVSC/GE。其中多肽抑制剂 (IVSC)的氨基酸序列为：GYPKSALR-(CH2)6-Cys。
b.将30μL 10mM MCH溶液滴加到IVSC/GE电极表面，封闭60min 后用10mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)冲洗电极表面，即得到可检测MMP-14 的交流阻抗生物传感器。
应用实例
实例1MMP-14检测
一种检测MMPs的电化学交流阻抗生物传感器使用方法，包括如下步骤：
(1)以上述制备实施例1制备得到的检测早MMPs的电化学交流阻抗生物传感器为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，构建三电极系统；
(2)将工作电极表面浸入2mL浓度分别为1μg/L、3μg/L、5μg/L、7 μg/L、10μg/L、30μg/L、50μg/L的MMP-14和10mM Tris-HCl(pH 7.4)的待测液中，30min后用10mM Tris-HCl(pH7.4)冲洗除去任何吸附的物质，在电化学阻抗测试液中,测试电化学阻抗Ret，采用的电化学方法：交流阻抗法；偏置电位：0.2V；频率：100kHz～1.0Hz；振幅：5.0mV。
(3)根据测试结果发现，电化学交流阻抗值Ret在MMP-14浓度为1.0 μg/L-10μg/L范围内呈线性关系y＝0.3591x+15.764，R2＝0.9801，不同浓度的 MMP-14对应的电化学阻抗图谱如图2所示，电化学阻抗值与MMP-14浓度之间的线性关系图如图3所示。
(4)将工作电极浸入2mL待测溶液中，在电化学阻抗测试液中，测试得到电化学阻抗Ret，根据MMP-14浓度与电化学阻抗之间的拟合曲线，得到待测溶液中MMP-14的浓度，单位为μg/L。
所述的电化学阻抗试液为含10mM K4[Fe(CN)6]-、10mM K3[Fe(CN)6]-、10mM NaCl的Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4)。
由该实例1可知，电化学交流阻抗值与MMP-14浓度在1.0μg/L-10 μg/L浓度范围内呈线性关系，因此，根据检测限计算公式3σ/S，经计算实施例1制备得到的检测MMPs的电化学交流阻抗生物传感器检测MMP-14 的检测限可达0.19μg/L，这说明本发明的电化学交流阻抗传感器的灵敏度很高。
实例2选择性测试：
以上述具体实施例1制备得到的检测MMP-14的电化学交流阻抗生物传感器为工作电极，实验条件与上述具体实施例1相同，检测1.0μg/L MMP-14以及10μg/L常见干扰蛋白：MMP-2、MMP-7、Thrombin、BSA，结果如图4所示。
结果表明：除目标物MMP-14外，其余干扰蛋白与电化学交流阻抗生物传感器相互作用后，交流阻抗值均很小。这说明10倍的常见的干扰蛋白不影响检测，本发明的生物传感器具有较好的选择性。这主要是因为生物传感器是通过MMP-14与多肽抑制剂(IVSC)发生二聚化，使电化学交流阻抗生物传感器界面上的电化学阻抗值增大的原理来检测MMP-14。
基于多肽抑制剂与MMPs的类血红素结构域(PEX)相互作用，本发明首次构建了一种新颖的电化学生物传感器用于特异性的定量检测MMP-14。首先将能够抑制MMP-14同源二聚化的多肽抑制剂(IVSC)通过Au-S键自组装在金电极上，用6-巯基-1-己醇(MCH)封闭后生物传感器组装完成。 IVSC可以直接与MMP-14相互作用抑制MMP-14的同源二聚化，因此IVSC修饰的生物传感器可以用于检测MMP-14。在检测MMP-14过程中，以Fe(CN)6 3-/4-作为探针检测传感器界面上电子转移阻抗值的变化。MMP-14 浓度在1.0μg/L-10μg/L范围内与电子转移阻抗值呈现良好的线性关系，检出限为0.19μg/L。本发明通过研究多肽抑制剂与MMPs的类血红素结构域 (PEX)之间的相互作用，提出了一种新颖的方法用于评估MMPs介导的肿瘤扩散，并且为筛选MMPs的抑制剂提供了一个平台。
上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但不能理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一种检测MMP-14的电化学交流阻抗生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，配制MMP-14特异性识别的探针
将多肽抑制剂溶解于Tris-HCl缓冲液中，得到MMP-14特异性识别的探针溶液，其中，多肽抑制剂的氨基酸序列为：GYPKSALR-(CH2)6-Cys；
步骤2，电化学交流阻抗生物传感器的组装
步骤2.1，将金电极浸入MMP-14特异性识别的探针溶液中进行自组装修饰，然后用Tris-HCl缓冲溶液冲洗，得到IVSC/GE电极；
步骤2.2，将MCH溶液滴加到IVSC/GE电极表面进行封闭，封闭后用Tris-HCl缓冲溶液冲洗电极表面，即得到检测MMP-14的电化学交流阻抗生物传感器。
2.根据权利要求1所述的检测MMP-14的电化学交流阻抗生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤1中，MMP-14特异性识别的探针溶液中多肽抑制剂的浓度为2-20μM。
3.根据权利要求1所述的检测MMP-14的电化学交流阻抗生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤2.1中的金电极在浸入MMP-14特异性识别的探针溶液中之前，进行以下处理：将金电极抛光，清洗，以清洗后的金电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，组成三电极体系，在电化学溶液中进行循环伏安扫描至循环伏安图谱稳定。
4.根据权利要求3所述的检测MMP-14的电化学交流阻抗生物传感器的制备方法，其特征在于，扫描电位范围为-0.3V～+1.5V，扫描速率为0.1V.S-1。
5.根据权利要求3所述的检测MMP-14的电化学交流阻抗生物传感器的制备方法，其特征在于，金电极抛光具体是在抛光布上用三氧化二铝抛光。
6.根据权利要求3所述的检测MMP-14的电化学交流阻抗生物传感器的制备方法，其特征在于，清洗是分别在乙醇和去离子水中超声清洗2-5min。
7.根据权利要求1所述的检测MMP-14的电化学交流阻抗生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤2.1中，自组装修饰的时间为10-15h。
8.根据权利要求1所述的检测MMP-14的电化学交流阻抗生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤2.2中，MCH溶液的浓度为0.1-10mM。
9.根据权利要求1所述的检测MMP-14的电化学交流阻抗生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤2.2中，封闭时间为30-60min。
10.采用权利要求1-9任一项所述的制备方法制备得到的检测MMP-14的电化学交流阻抗生物传感器。
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|---|---|---|---|---|
| CN112649417A (zh) * | 2020-12-01 | 2021-04-13 | 西北大学 | 一种检测mmp-14的电化学发光生物传感器及其制备方法 |
| CN113671002A (zh) * | 2021-07-25 | 2021-11-19 | 武汉科技大学 | 一种基于金表面修饰葫芦[7]脲检测生物活性物质的方法 |
| CN113671002B (zh) * | 2021-07-25 | 2024-04-26 | 武汉科技大学 | 一种基于金表面修饰葫芦[7]脲检测生物活性物质的方法 |
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