CN101324590B - 一种测定雌三醇含量的免疫分析法 - Google Patents

Abstract

本发明为在磁性微粒子表面包被雌三醇抗体，应用于雌三醇免疫分析检测的方法。其技术特征包括：将待测抗原的抗体通过共价键连接在磁性微粒子表面上。包被前充分洗涤磁性微粒子，在指定的缓冲溶液体系中加入磁性微粒子和雌三醇抗体血清，室温震荡条件下进行反应。包被有雌三醇抗体的磁性微粒子封闭后，可直接参与免疫反应，用于雌三醇免疫分析。在抗体包被及分析测定过程中，可以配套使用磁性分离器进行沉淀分离。本发明操作简便，成本低廉。反应过程一步到位，无需大型贵重仪器即可完成操作，并可与多种型号的检测仪器配合使用，适宜普遍推广。

Description

一种测定雌三醇含量的免疫分析法

技术领域

本发明用于标记免疫分析领域，特别适用于标记免疫分析法中的竞争法原理测定雌三醇含量。

背景技术

内分泌系统作为人类机体的三大信息传递系统之一，在调节机体各项功能方面起着重要的作用。内分泌系统受到干扰会导致机体整个内环境的稳定性遭到破坏。激素作为内分泌腺的一种重要的天然产物，在调节机体功能，维持内环境稳定方面有着不可替代的作用。激素在血液中以低浓度传递，并与靶细胞受体结合，对机体功能起到的调节作用。激素过少时会引起某些组织或器官功能失调，甚至危及生命；激素过多，则会引起内分泌机能亢进。雌三醇作为主要的小分子雌激素之一，是雌二醇在人体内代谢的最终产物。雌三醇不具有生物活性，但其含量可以反映人体生长发育和生殖系统状况，准确测定体内的雌三醇含量有着重要的意义。目前，我国规定的人体雌三醇正常含量，男性及未孕妇女小于7nmol/L，妊娠期妇女为104-1215nmol/L。

免疫分析法是以抗原与抗体特异性结合为基础而建立的生物化学方法。由于抗原与抗体是一对一的专一反应，因此免疫分析法具有高度的选择性。免疫分析根据标记与否可分为标记免疫分析法和非标记免疫分析法。最成熟的标记免疫分析法是放射免疫分析法。但由于放射性物质的毒害性，此方法已经逐渐开始被非放射免疫分析方法所代替，其中包括：酶联免疫分析法、荧光免疫分析法、电化学分析法、电化学发光分析法和化学发光分析法等。标记免疫分析中的竞争法又称竞争性抑制法，主要是根据标记抗原与同种未标记待测抗原与抗体间可发生竞争性结合的原理，主要用于测定小分子抗原。标本中的抗原和一定量的标记抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量越多，结合在固相上的酶标抗原愈少，因此阳性反应检测信号值低于阴性反应，检测信号值与待测抗原的浓度成反比。竞争法测抗原有多种模式，可将标本和标记抗原同时加入与固相抗体竞争结合，也可将标本先加入到固相抗体中进行结合，洗涤后再加入标记抗原，与结合在固相上的抗原竞争进行取 代反应。

近年来，磁性微粒子的应用使免疫分析技术研究取得了重大进展，灵敏度得到提高，反应时间大大缩短，为实现全自动化检测提供了有利条件。磁性微粒子直径一般为800-2000nm，其表面带有活性基团，如-CONH₂，-COOH等，具有包被量大，均一性高，牢固性强等优点，是免疫反应中理想的固相材料。目前在我国免疫分析领域，磁性微粒子主要作为免疫反应完成后的分离试剂使用，以缩短分离时间，简化分离过程。而在国外进口的全自动磁性微粒子免疫分析仪器中，磁性微粒子可作为抗体包被固相材料直接参与免疫反应，如拜耳公司生产的ACS全自动化学发光免疫分析系统。相对于传统的免疫反应模式而言，这种由磁性微粒子直接参与的免疫反应在反应时间、均一性和稳定性方面都有着传统反应模式不可比拟的优越性。但是这种进口的仪器价格昂贵且无法与国产仪器配套使用，维护管理复杂，一旦损坏不易修理，从而大大限制了其应用。因此，一种简便、稳定、价格适中、适用性广泛的，且适用于国产免疫检测仪器的磁性微粒子固相包被技术将在免疫分析领域有着广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种磁性微粒子作为抗体包被固相材料应用于免疫分析，特别是竞争法测定雌三醇的方法。该方法将待测抗原的抗体通过共价键连接在磁性微粒子表面上，由磁性微粒子直接参与免疫反应。磁性微粒子粒径小，分散程度高，大大增加了包被表面积，增大抗原和抗体的结合几率，增加抗原或抗体的吸附量，使反应速率加快。配合振荡器及磁板分离器使用，无需离心分离，使清洗和分离更加简便。反应一步到位，过程简便，无需大型贵重仪器即可完成操作，并可与多种型号的检测仪器配合使用。

本发明的技术方案如下：

一种用于雌三醇检测的磁性微粒子免疫分析法，其中包括以下步骤：

1.将成品磁性微粒子用洗涤液进行充分洗涤，每次洗涤后用磁性分离器使磁性微粒子充分沉淀，弃去上清液；

2.洗涤后的磁性微粒子用稀释液稀释还原至原体积，加入适量anti-E3血清室温震荡条件下进行包被，抗体血清可直接加入，不需要经过纯化处理；

3.反应结束后，分离、洗涤，加入封闭液，室温振荡封闭，封闭后的磁性微粒子用磁性微粒子稀释液稀释还原至原体积，在4℃条件下可保存一年 以上；

4.使用包被有anti-E3的磁性微粒子测定雌三醇时，用磁性微粒子稀释液将其按1:6的比例进一步稀释后，作为固相抗体直接参与免疫反应。

在上述免疫分析法中，洗涤液为生理盐水(含0.9％NaCl)，一般洗涤3次以上，去除原有缓冲液中可能存在的干扰物质。磁性分离器由意大利Biochem公司提供，磁场强度为4000高斯。

最后一次洗涤弃去上清后，加入磁性微粒子稀释液将磁性微粒子还原至洗涤前原体积。磁性微粒子稀释液成分为：25mmol/L PB缓冲液(pH值7.4)，每1000mL含水解明胶2.5g，牛血清蛋白(BSA)7.5g，氯化钠(NaCl)4.5g，防腐剂(Proclin-300)0.5ml。

在磁性微粒子中加入适量anti-E3血清，在平悬振荡器上室温振荡反应3-4h。一般anti-E3血清加入量为每1mL磁性微粒子加入anti-E3血清1μl。

反应结束后，用磁性分离器将磁性微粒子充分沉淀后吸去上清。用生理盐水洗涤2次后，加入封闭液，在平悬振荡器上室温振荡封闭2h。封闭液成分为50mmol/L PB缓冲液(pH值7.4)，每1000mL含水解明胶5g，牛血清蛋白(BSA)15g，防腐剂(Proclin-300)0.5ml。封闭后的磁性微粒子用磁性微粒子稀释液稀释还原至原体积，在4℃条件下可保存一年以上。

使用时，用磁性微粒子稀释液将其按一定比例进一步稀释后，作为固相抗体直接参与免疫反应，稀释比例一般为1:6。

附图说明

图1为本发明的反应原理及操作流程图，

(1)在烧杯中加入洗涤后的磁性微粒子和雌三醇抗体血清。

(2)室温震荡条件下进行反应，抗体包被在磁性微粒子表面。

(3)反应完毕后，用磁性分离器使磁性微粒子充分沉淀后分离洗涤。

图2为包被有雌三醇抗体的磁性微粒子应用于雌三醇免疫分析反应原理及操作流程图。

(1)在烧杯中加入包被有雌三醇抗体的磁性微粒子、雌三醇及雌三醇标记物。

(2)雌三醇和雌三醇标记物与雌三醇抗体发生竞争性免疫反应。

(3)反应完毕后，用磁性分离器使磁性微粒子充分沉淀后分离洗涤。

图3为本发明的磁性微粒子放射免疫分析法与磁性微粒子作为分离试剂 的常用放射免疫分析法测定人血清样本相关性曲线；

图4为本发明的磁性微粒子化学发光免疫分析法与磁性微粒子作为分离试剂的常用化学发光免疫分析法测定人血清样本相关性曲线；

图5为本发明的磁性微粒子化学发光免疫分析法及经典板式化学发光免疫分析法测定人血清样本相关性曲线。

具体实施方式

下面结合附图及实施例进一步描述本发明。

实施例1

本实施例为使用本发明的包被有雌三醇抗体的磁性微粒子应用于雌三醇放射免疫分析法检测。

首先，反应前将包被有anti-E3的磁性微粒子用稀释液按一定1：6的比例稀释。

反应试管中依次加入E3标准品(或待测物)、磁性微粒子各100灿l以及50μl¹²⁵I-E3(35000cpm)，37℃条件下震荡反应45min。反应结束后，在磁性分离器上倾去上清，洗涤2～3次，每次加入洗涤液300μl，洗涤液为PBST缓冲溶液(pH值7.4)。弃去上清，在安徽合肥众成机电技术公司生产的DFM-96型多管自动γ计数仪上测放射性计数，按Logit对log数据方程处理系统测量，得出相关参数和待测样品浓度。

本实施例中E3标准曲线5个浓度值定为：0.3、1、3、10、30ng/ml，即检测线形范围为：0.3-30ng/ml。

以正常人健康查体血清作为样本，用本发明的磁性微粒子固相一抗包被放射免疫分析方法测定其精密度、准确性及健全性。每种方法均重复3次以上，结果如表1所示：

表1：磁性微粒子固相一抗放射免疫分析法测定正常人血清样本

采集人血清样本共42例，其中，正常人血清(男女均有)30例，其余12例正常人血清E3含量为高值人血清样本。42例人血清样本分别用本发明的磁性微粒子固相一抗放射免疫分析法及磁性微粒子作为分离试剂的常用 放射免疫分析法进行测定，将所得结果进行相关性分析，相关性曲线如图3所示，两种方法对比，相关性系数大于0.9900。

实施例2

本实施例为使用本发明的包被有雌三醇抗体的磁性微粒子应用于雌三醇化学发光免疫分析法检测。

首先，反应前将包被有anti-E3的磁性微粒子用稀释液按一定1：6的比例稀释。

反应试管中依次加入E3标准品(或待测物)、E3-HRP及包被有anti-E3的磁性微粒子各100μl，37℃条件下震荡反应60min。反应结束后，在磁性分离器上倾去上清，洗涤2～3次，每次加入洗涤液300μl，洗涤液为PBST缓冲溶液(pH值7.4)。弃去上清，加入化学发光底物液300μl，37℃避光放置20min后，在日本滨松公司生产的BHP9504型微孔板发光分析仪上检测化学发光计数值，按Logit对log数据方程处理系统测量，得出相关参数和待测样品浓度。

本实施例中E3标准曲线5个浓度值定为：0.6、2、6、20、60ng/ml，即检测线形范围为：0.6-60ng/ml。

以正常人健康查体血清作为样本，用本发明的磁性微粒子固相一抗包被化学发光免疫分析方法测定其精密度、准确性及健全性。每种方法均重复3次以上，结果如表2所示：

表2：磁性微粒子固相一抗化学发光免疫分析法测定正常人血清样本

采集人血清样本共36例，其中，正常人血清(男女均有)27例，其余9例正常人血清E3含量为高值人血清样本。36例人血清样本分别用本发明的磁性微粒子固相一抗化学发光免疫分析法、磁性微粒子作为分离试剂的化学发光免疫分析法及经典板式化学发光分析法进行测定，将所得结果进行相关性分析，相关性曲线如图4和图5所示，三种方法对比，相关性系数均大于0.9900。

Claims (3)

1.一种包被有anti-E3的磁性微粒子在制备用于免疫分析法检测雌三醇的试剂中的应用：

将成品磁性微粒子用洗涤液进行充分洗涤，每次洗涤后用磁性分离器使磁性微粒子充分沉淀，弃去上清液，所述的洗涤液为生理盐水；

洗涤后的磁性微粒子用稀释液稀释还原至原体积，加入适量anti-E3血清室温震荡条件下进行包被，抗体血清可直接加入，不需要经过纯化处理，所述磁性微粒子稀释液成分为：pH值7.4的25mmol/L PB缓冲液，每1000mL含水解明胶2.5g，牛血清蛋白7.5g，氯化钠4.5g，Proclin-3000.5ml，所述适量anti-E3血清为每1mL磁性微粒子加入anti-E3血清1μl；

反应结束后，分离、洗涤，加入封闭液，室温振荡封闭，封闭后的磁性微粒子用磁性微粒子稀释液稀释还原至原体积，在4℃条件下可保存一年以上，所述的封闭液成分为pH值7.4的50mmol/L PB缓冲液，每1000mL含水解明胶5g，牛血清蛋白15g，Proclin-300 0.5ml；封闭在室温震荡条件下完成，封闭时间为2h；

所述免疫分析法包括以下步骤：使用包被有anti-E3的磁性微粒子测定雌三醇时，用磁性微粒子稀释液将其按1∶6的比例进一步稀释后，作为固相抗体直接参与免疫反应。

2.按权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的包被反应过程在平悬振荡器上室温条件下进行，震荡反应时间为3-4h，所述anti-E3血清加入量为每1mL磁性微粒子加入anti-E3血清1μl。

3.按权利要求1所述的应用，其特征在于：包被有anti-E3的磁性微粒子保存条件为4℃，保存期限为一年以上。

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