CN108717125A - 奶牛早期乳腺炎症监测方法 - Google Patents

奶牛早期乳腺炎症监测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种奶牛早期乳腺炎症监测方法，包括如下步骤：(1)对牛奶进行SCC计数检测；(2)对牛奶进行病原微生物鉴定：包括菌落数计数和细菌学鉴定；(3)对牛奶进行体细胞分型检测；(4)对牛奶进行蛋白质差异表达水平及功能鉴定：包括蛋白质浓度测定、蛋白质定量、分析蛋白差异表达水平及功能鉴定。该方法通过对牛乳体细胞中免疫细胞的分化程度的检测及对乳蛋白与乳中菌体蛋白的表达水平与功能进行鉴定，有助于及时发现早期乳腺炎症的发生，同时有助于发现诱发早期炎症的病原体种类，为奶牛乳腺炎症的及时预防和针对性的治疗做好充分准备。

Description

奶牛早期乳腺炎症监测方法
技术领域
本发明属于畜牧业领域，具体地说，涉及一种奶牛早期乳腺炎症监测方法，主要应用于奶牛早期乳腺炎症与亚临床乳腺炎症的及早筛查。
背景技术
奶牛乳腺健康是牛奶生产的关键问题，监测乳腺的健康状况对于奶牛场经济来说是非常重要的。奶牛乳腺炎症会降低乳产量和质量，奶牛生育力甚至缩短寿命，严重影响奶牛场收入。炎症发生时乳腺内的免疫应答是反映炎症阶段的重要指示。因此，通过了解奶牛乳腺对炎症的免疫应答过程，进而及时掌握奶牛乳腺健康状态，可以改善牛奶生产质量并降低乳腺炎症的治疗成本。
在生产实际中应用作为广泛的判断乳腺炎症的方法是通过-体细胞数(SCC)。牛奶体细胞数(SCC)是反映奶牛乳房健康状况的重要指标之一，该指标偏高意味着奶牛可能处于亚健康或疾病状态。目前，已有部分国家对用于乳制品加工的生鲜乳制定了严格的SCC标准。世界各国SCC标准不同，表1为部分国家和地区生鲜乳SCC标准，其中日本对生乳中SSC的要求最为严格(规定每毫升牛乳中SCC少于30万个)。我国虽还没有对SSC标准作出明确规定，但规定了生鲜牛乳中SCC测定的标准方法。在奶牛正常生理状态下，牛奶体细胞的组成和数量都是基本稳定的，而当乳房外伤或疾病发生(如乳腺炎等)时，会导致牛奶SCC增多，进而造成产奶量降低，乳品质量下降等。牛奶的品质关系到消费者的健康，因此，确保生鲜乳的质量安全是奶牛养殖工作者必须着手解决的首要问题。
表1部分国家和地区SCC标准
但体细胞数法存在以下限制性：(1)各个国家与不同地域之间，用于判断奶牛乳腺健康状况的SCC标准，存在较大差异。到底健康乳腺、亚临床乳腺炎症和重度乳腺炎症的界限划分为多少，更为准确？(2)引起SCC变化的因素众多(例如，季节，气候，胎次，管理因素等)，不只是炎症这一个因素。从这一角度而言，仅依靠SCC判断乳腺炎症的发生及炎症阶段，显然是不够准确的。(3)SCC只是基于乳中细胞总数量的炎症量度，它无法准确的判断炎症发生的阶段。现实中奶牛隐性乳腺炎的发病率较高，虽然隐性乳腺炎没有临床症状，却可以引起奶产量的急剧减少。
奶牛乳腺内感染(IMI)的诊断一直以来主要基于SCC和细菌学分析。目前认为SCC＜100,000个细胞/mL的牛奶样本是健康的或处于正常的生理学范围内。在这些健康乳腺内也可能已经发生了炎症反应。实际上，SCC在炎症反应的初始阶段很低，直到入侵的病原体被释放化学引诱物的免疫细胞识别，从而刺激PMN的迁移。
因此有必要开发一种奶牛早期乳腺炎症监测方法，为奶牛乳腺炎症的及时预防和针对性的治疗做好充分准备。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种奶牛早期乳腺炎症监测方法，此方法主要应用于牛奶养殖场对奶牛乳房实际健康状况更为准确的判断，特别是对易忽视的低体细胞数(SCC＜200,000个/mL)的奶牛群。通过对其乳体细胞中免疫细胞的分化程度的检测及对乳蛋白与乳中菌体蛋白的表达水平与功能进行鉴定，有助于及时发现早期乳腺炎症的发生，同时有助于发现诱发早期炎症的病原体种类，为奶牛乳腺炎症的及时预防和针对性的治疗做好充分准备。
本发明技术方案如下：
一种奶牛早期乳腺炎症监测方法，所述方法包括：测定所述乳腺健康奶牛的牛奶样品中体细胞至少一种标志物的水平，标志物包括PMN比例和/或蛋白质表达，其中PMN比例增多，表示早期炎症发生。
优选地，体细胞数＜100,000个/mL的牛奶中，PMN比例高于70％，表示早期炎症发生。
优选地，体细胞数＜100,000个/mL的牛奶中能够检测到超过40％的凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)，表示早期炎症发生。
优选地，在牛奶样本中，以下蛋白质：LGB，LTF，THIE，BTN1A，C3，pscF和UBC的表达水平在[(SCC＜100,000个/mL)样品](对照组)中与细菌培养阴性-高体细胞数(SCC＞100,000个/mL)样品(试验组1)中的Log2蛋白比例比值＞1，则表示早期炎症发生。
或者，在[细菌培养阴性-低体细胞数(SCC＜100,000个/mL)样品](对照组)中的表达量与在细菌培养阳性样品(试验组2)中表达量的Log2蛋白比例比值＞1，则表示早期炎症发生。
间隔一个月后，对上个月诊断的早期炎症乳样，再进行蛋白鉴定。当如下蛋白质(CATHL2、CATHL3、CATHL4、SAA3、SERPINA3-1、PTGDS)的表达量的log2蛋白比例＞1(细菌培养阳性与细菌培养阴性奶样之比)，且P值＜0.01(如图6所示)，表明初期炎症(在初期无诊治的前提下)已发展成为较严重乳腺炎症，对这一批奶样本，还可进行SCC以及体细胞分型的再次检测，看SCC是否已经＞400,000个/mL且PMN＞70％。
一种奶牛早期乳腺炎症监测方法，包括如下步骤：
(1)对牛奶进行SCC计数检测；
(2)对牛奶进行病原微生物鉴定：包括菌落数计数和细菌学鉴定；
(3)对牛奶进行体细胞分型检测；
(4)对牛奶进行蛋白质差异表达水平及功能鉴定：包括蛋白质浓度测定、蛋白质定量、分析蛋白差异表达水平及功能鉴定。
其中步骤(1)采用体细胞计数仪测定牛奶SCC计数，优选使用Fossomatic 5000(Foss Electric，Denmark)测定SCC。
其中步骤(2)菌落数计数测试方法如下：制备10倍系列稀释样品匀液，共制备4个稀释梯度，分别为1∶103、1∶104、1∶105、1∶106。吸取500μL样品匀液于无菌琼脂平皿内，每个稀释梯度做两个平皿。同时，分别吸取500μL空白稀释液加入两个无菌琼脂平皿内做空白对照。待琼脂平板冷却凝固后，将平板翻转并封口，在恒温培养箱(36±1℃)培养48h，然后测定菌落数计数。
其中步骤(2)细菌学鉴定将每个牛奶样品的10μL涂布到含有5％脱纤维蛋白绵羊血液的血琼脂(Oxoid Ltd.，Basingstoke，UK)上。将平板在37±1℃下有氧培养并在24和48h后检查。根据国家乳腺炎委员会指南(NMC，1999)鉴定细菌，其中包括形态学，革兰氏染色，过氧化氢酶和凝固酶反应，氧化酶反应，生化特性和溶血模式。
其中步骤(2)优选分离出病原体凝固酶阴性葡萄球菌。
其中步骤(3)体细胞分型检测的具体方法如下：取14mL的牛奶加入15mL的离心管中；2000rpm，离心10min。离心后，去掉上层的乳脂，然后弃掉上清。在离心管底加入1mL的PBS，转移到新的15mL离心管中，并在离心管中加10mLPBS，混匀；2000rpm，离心10min，弃掉上清；重复三次。细胞重选在1mL的PBS中。取400uL细胞悬液于5mL流式管1中，进行细胞计数。取100uL细胞悬液于5mL流式管2中，加入10L PI，进行活性检测。三试验中使用的抗体如下：多形核白细胞抗体：Anti-CD11b抗体(货号：ab75476)；巨噬细胞抗体：Anti-CD14抗体[Tuk4](货号：ab27545)；Anti-mouse IgG(H+L)，F(ab′)2Fragment(Alexa 488Conjugate)；Anti-rabbit IgG(H+L)，F(ab′)2Fragment(Alexa 647Conjugate)。
其中步骤(3)优选测定淋巴细胞和PMN。
其中步骤(4)中所述蛋白质浓度测定，参考碧云天蛋白浓度测定试剂盒；所述蛋白质定量是指：首先，将乳样品去脂后，除去高丰度蛋白——酪蛋白，然后将乳清样品进行SDS-PAGE电泳；所述分析蛋白差异表达水平及功能鉴定采用Label free非标记定量蛋白质组学。
本发明有益效果如下：
(1)将牛奶体细胞分型检测技术与蛋白质定量组学技术结合，为奶牛乳腺健康状况的检测手段提出新的方法与炎症诊断的标志物；
(2)发奶牛乳腺早期炎症的发生可能低于公认的SCC阈值(SCC＜100,000个细胞/mL)，为判断奶牛早期乳腺炎症的发生提供了新的SCC阈值。
附图说明
在附图中：
图1A是具体实施方式中PMN随SCC的变化趋势图。
图1B是具体实施方式中淋巴细胞随SCC的变化趋势图。
图1C是具体实施方式中巨噬细胞随SCC的变化趋势图。
图2是具体实施方式中牛奶SCC≤100,000细胞/mL范围内体细胞分型的比较，其中***＝P＜0.01；**＝P＜0.05；NS＝P＞0.05。
图3是具体实施方式中牛奶样品中不同细菌状态下体细胞分型比较(n＝102)，其中***＝P＜0.01；**＝P＜0.05；NS＝P＞0.05。
图4是具体实施方式中培养阴性牛奶样品(n＝14)中体细胞分型比较，其中***P＜0.01；**P＜0.05；NS＝P＞0.05。
图5是具体实施方式中蛋白浓度标准曲线。
图6是具体实施方式中细菌培养样阳性与细菌培养阴性奶样之间差异显著表达蛋白。
图7是具体实施方式中细菌培养阳性奶样中差异表达显著的菌体蛋白功能。
图8是具体实施方式中细菌培养阴性奶样中差异表达显著的菌体蛋白功能。
图9是具体实施方式中细菌陪阳性和培养阴性组之间差异表达的蛋白质的相互作用。
图10A-10G是具体实施方式中紧密互作蛋白在不同乳腺状态组中的差异表达，其中，图10A为传染型病原体感染的奶样中LGB蛋白质表达量；图10B为传染型病原体感染的奶样中C3蛋白质表达量；图10C为奶样中THIE蛋白质表达量；图10D为奶样中BTN1A1蛋白质表达量；图10E为奶样中UBC蛋白质表达量；图10F为奶样中pscF蛋白质表达量；图10G为奶样中LTF蛋白质表达量。
图中a，ab，c，bc表示差异显著性，不同条形柱上的字母越不相同，表示差异越大，例如a与ab表示二者有差异，但不很显著，但a与c这二者之间，差异就极显著。
具体实施方式
以下的实施例仅为说明本发明的实施方案，而不限制本发明的范围。
试验材料：本试验采用的牛奶样品采集自北京5家奶牛养殖场的荷斯坦奶牛。排除具有明显临床症状的奶牛(例如子宫炎，临床乳腺炎，子宫脱垂，乳热，临床酮症)，其健康状况是根据直肠温度，心率，呼吸曲线，食欲和粪便一致性确定的。选择102头临床健康母牛[胎次(2～3胎)、泌乳天数(152±27)d、产奶量(27±3)kg/d]收集牛奶样本。收集时间为2017年6月5日。每天挤奶两次，分别为早上8:00和晚上7:00。共采集102份牛奶样本。采集牛奶样品前，对乳房外部进行药浴消毒，用单独的毛巾擦拭清洗，然后再次用酒精清洗。弃去头三把奶后，将约50mL来自每头奶牛4个乳区的乳样混合收集在无菌管中，随后将牛奶样品分装成3个子样品，分别用于牛奶体细胞分型、细菌分析及牛奶蛋白测定三个试验，最后将所有样品储存于-80℃冰箱中。
一、牛奶中的SCC及体细胞分型
1、使用Fossomatic 5000仪器获得体细胞计数。
由表2可知，102份奶样中，SCC的平均值为351.72×103个细胞/mL，其中有44份奶样SCC＜100,000个细胞/mL，划分为低SCC组；有28份奶样SCC在100,000～400,000个，为中等SCC组；有30份奶样SCC＞400,000个细胞/mL，为高SCC组。
表2牛奶样品中的SCC(n＝102)
2、牛奶体细胞分型测定
取14mL的牛奶加入15mL的离心管中；2000rpm，离心10min。离心后，去掉上层的乳脂，然后弃掉上清。在离心管底加入1mL的PBS，转移到新的15mL离心管中，并在离心管中加10mLPBS，混匀。2000rpm，离心10min。弃掉上清；重复三次。细胞重选在1mL的PBS中。取400uL细胞悬液于5mL流式管1中，进行细胞计数。取100uL细胞悬液于5mL流式管2中，加入10LPI，进行活性检测。上机测试，管1：上样两次，每次100uL，细胞数是每1mL的细胞悬液中含4.8×106细胞，1mL牛奶大约3×105细胞。管2：被PI染色的死细胞比例为20.27％。
使用流式细胞仪对102份牛奶混合样品中的体细胞进行分选，对其中最主要的三种免疫细胞(淋巴细胞，巨噬细胞和PMN的细胞)的含量及所占比例进行了分析。由表3可知，在102份牛奶样品中，牛奶SCC范围为13,000～1,024,000个细胞/mL，其中PMN的比例在4.48～87.29％(平均值±SD：39.76±32.44％)范围内变化；淋巴细胞比例范围为3.37～91.07％(平均值±SD：48.50±23.39％)；巨噬细胞比例为2.37～55.71％(平均值±SD：21.74±12.07％)。
表3牛奶样品中体细胞类型分布(n＝102)
由于在体细胞群体中存在广泛的细胞变异，特别是淋巴细胞和PMN。因此，试验分析了体细胞分型与SCC的相关性。由图1A可知，SCC＜200,000个细胞/mL时，PMN比例较低，仅为27.4％，随SCC的增加PMN的数量显著增加(r＝0.4604，P＜0.01)，当SCC＞400,000时，PMN比例高达87.29％，是炎症乳样中的主要细胞群体；由图1B可知，在SCC＜200,000的范围内，淋巴细胞为主要的细胞群，比例高达91.07％，随SCC的增加淋巴细胞比例显著减少(r＝-0.4970，P＜0.01)；由图1C可知，巨噬细胞的比例2.37～55.71％，并且随着SCC的增加，巨噬细胞的比例并没有表明与SCC有较强的相关性(r＝-0.1672，P＞0.05)。由图1A-1C可知，淋巴细胞百分比与SCC呈显负相关，PMN百分比与SCC呈显着正相关。
为了测试奶牛健康乳腺内免疫学状态是否有统计学差异，将所有SCC＜100,000个细胞/mL的奶样(共44个)根据SCC分为I至IV组，I组(SCC为13,000～34,000细胞/mL)共9个样品中。II组(SCC为34,000～55,000细胞/mL)共11个样品；III组(SCC为55,000～76,000细胞/mL)10个样品；IV组(SCC为76,000～100,000细胞/mL)14个样品。由图2可知，I～III组淋巴细胞的平均百分比(59.35～81.26％)显著高于IV组(22.17％)(P＜0.01)。4组之间巨噬细胞平均百分比无显著差异(19.15～32.13％)(P＞0.05)。I～III组之间的PMN的平均百分比差异并不显著(P＞0.05)。然而，PMN的比例在I～III组(19.17～31.22％)与IV组之间存在显着差异(82.68％)(P＜0.01)。
二、牛奶中的细菌种类及菌落总数
1、牛奶菌落总数测定：
分别称取5.0g胰蛋白胨、2.5g酵母浸膏、1.0g葡萄糖和15g琼脂，溶于1000mL蒸馏水中，调节pH至7.0±0.2，煮沸溶解，分装于锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌15min，用以制备琼脂培养基。称取8.5gNaCl，溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压蒸汽灭菌15min，用以制备无菌生理盐水。用无菌微量移液器吸取1mL牛奶样品置于盛有9mL无菌生理盐水试管中，充分混匀，制成1∶10的样品匀液。用微量移液枪吸取1mL1∶10的样品匀液，缓慢注入盛有9.0mL的无菌生理盐水的无菌试管中，震荡混匀，制成1∶100的样品匀液。按此方法，制备10倍系列稀释样品匀液，共制备4个稀释梯度，分别为1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000。在制备10倍递增稀释液时，吸取500μL样品匀液于无菌琼脂平皿内，每个稀释梯度做两个平皿。同时，分别吸取500μL空白稀释液加入两个无菌琼脂平皿内做空白对照。待琼脂平板冷却凝固后，将平板翻转并封口，在恒温培养箱(36±1℃)培养48h。参照GB 4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》，菌落数的计算公式为：
N为菌落总数；C为每个稀释度的菌落数；n为每个稀释度的平行次数。
2、牛奶细菌学分析
1)分别将每个牛奶样品10μL涂布到含有5％脱纤维蛋白绵羊血液的血琼脂平板和麦康凯琼脂平板。将平板在(37±1)℃下有氧培养并在24和48h后检查。根据国家乳腺炎委员会指南(NMC，1999)鉴定细菌，其中包括形态学，革兰氏染色，过氧化氢酶和凝固酶反应，氧化酶反应，生化特性和溶血模式。革兰阳性微生物通过过氧化氢酶反应分化为葡萄球菌和链球菌。使用绵羊血浆中的凝固酶试管用于区分将金黄色葡萄球菌与CNS。通过氧化酶测试以及麦康凯琼脂和曙红亚甲基蓝琼脂上的生长特征鉴定革兰氏阴性细菌。
2)细菌基因组DNA的提取。使用细菌基因组DNA提取试剂盒将待检样品取3mL按试剂盒说明书操作，提取细菌基因组DNA。将各供试菌种挑单菌落在5mL液体LB培养基中培养12h，8 000r/min离心8min收集菌体，用1mol/L NaCl洗2次，再用TE[c(Tris)＝10mmol/L，c(EDTA)＝25mmol/L，pH 8.0]洗2次，并用TE重悬，在0.2mg/mL溶菌酶(Sigma)和0.3mg/mLRNA酶A(Sigma)中37℃消化20min，再加入0.6％SDS、1％Sarkosyl和0.6mg/mL蛋白酶K在37℃水浴中1h.对胞溶菌产物分别用酚、氯仿各抽提2次，用0.33mol/L乙酸铵和2.5倍体积乙醇沉淀DNA。最后将DNA溶于TE(10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，pH 8.0)中，用Dyna Quant200仪对所提取的各细菌基因组DNA溶液进行浓度测定，作为PCR反应的模板。
3)PCR反应简易模板的制备。直接挑取单菌体溶于100μL高纯水中，在沸水中煮1min裂解菌体，使DNA释放出来，直接作为PCR反应的模板。
4)PCR反应与结果分析。在25μL的PCR反应体系中，DNA模板用量约为30ng。PCR反应条件：95℃预变性7min，94℃变性1min，52℃退火1min，65℃延伸8min，30个循环，65℃最后延伸16min，4℃停止反应。用1.5％(w)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用GDS8000凝胶图象分析仪照相。用Bray-Curtis法进行聚类分析。
由表4可知，牛奶样品中的不同SCC水平之间，菌落总数差异较大。SCC＜100,000个细胞/mL的牛奶样品中，菌落总数只有8.08×104CFU/mL；在100,000～400,000个细胞/mL范围内的牛奶样品，其菌落总数与健康组相比显著上升，达到4.604×105CFU/mL；当SCC＞400,000个细胞/mL时，菌落总数急剧上升，已高达9.49×106CFU/mL。但均在正常范围内。试验检测的102份牛奶样品中，有13.72％的样品细菌培养结果呈阴性，83.34％为培养阳性样品，有3个样品受到污染。根据引起奶牛乳腺炎病原菌的传播特点，将分离鉴定的病原菌分类为传染型，环境型和机会型，其中传染型病原体：对乳腺组织具有高度亲和力，可感染于乳房中，在挤奶时可由感染区传染到非感染区(代表细菌：金黄色葡萄球菌和无乳链球菌等)。环境型病原体：对乳腺组织亲和力较低，广泛存在于牛群可接触环境中(代表细菌：大肠杆菌、克雷伯氏菌等)。机会型病原体：致病力较弱，在机体免疫力正常时，无法致病，而当免疫机能下降，正常菌群比例失调，其可侵入机体，诱发疾病。由表5可知，在培养阳性的样本中，分离出的机会型病原体为凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)(占总样本的34.32％，占培养阳性样本的39.77％)。而感染CNS的奶样中平均SCC为71,850个细胞/mL。
分离出的传染型病原体(占总样本的27.45％，占培养阳性样本的31.81％)中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是最主要的病原体，感染传染型病原体的奶样平均SCC为824,280个细胞/mL。环境型病原体(约占总样本的21.57％；占培养样品的25％)包括变形菌属(Proteus spp)，绿脓杆菌(Pseudomonas)，肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella)，芽孢杆菌(Bacillus)，大肠杆菌(Escherichia coli)，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)等。平均SCC为338,670个细胞/mL。
表4牛奶样品中的菌落总数(n＝102)
表5牛奶样品中的细菌鉴定及分类(n＝102)
注：1细菌数量占所有样品的百分比(n＝102)
2细菌数量占所有培养阳性样品的百分比(n＝88)
三、牛奶中的不同病原体与体细胞分型
根据牛奶样品中检测到的不同乳腺炎病原体，分析了不同乳腺炎病原体状态下的体细胞分型。将102份奶样分为3组(无病原体组，次要病原体组和主要病原体组)。在102份牛奶样品中有14个(13.72％)没有检测到病原体，即细菌培养阴性。在47个样品(46.07％)中分离出主要病原体(如，CNS，金黄色萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌)，而在24个样品(23.53％)中检测到次要的病原体(如芽孢杆菌、绿农芽孢杆菌、肺炎克雷伯菌等)。由图3可知，与细菌培养阳性的牛奶样品(22.91-37.63％)相比，培养结果呈阴性的牛奶样品中平均淋巴细胞比例(59.48％)显著升高(P＜0.01)，是健康乳腺的主要细胞群。而巨噬细胞的比例(19.87～22.18％)没有与细菌状态呈现显着相关性(P＞0.05)。PMN在细菌培养阳性的奶样(38.90～58.96％)中显着高于培养阴性奶样(17.23％)(P＜0.01)，其中，PMN的平均百分比在主要病原体与次要病原体之间也存在显著差异(P＜0.01)。
由表5可知，虽然培养阴性样品只有13.72％，但其平均SCC＞200,000个细胞/mL，因此对细菌培养阴性的14个牛奶样品进行进一步的体细胞分型比较，根据SCC将其分为三组，即培养阴性-H(无病原菌生长-高SCC，SCC＞400,000个细胞/mL)组(4个)、培养阴性-M(无病原菌生长中等SCC，100,000＜SCC＜400,000个细胞/mL)组(5个)以及培养阴性-L(无病原菌生长低SCC，SCC＜100,000个细胞/mL)组(5个)。由图4可知，在培养阴性-L组中，淋巴细胞为优势细胞群(62.3％)，随SCC增加，淋巴细胞比例明显减少(P＜0.05)，培养阴性-H组中的淋巴细胞比例显著下降(P＜0.01)，仅占21.4％。PMN是培养阴性-H组和培养阴性-M组的主要细胞群体(61.32～72.48％)，培养阴性-L组中的PMN比例显著减低(P＜0.01)，巨噬细胞比例在培养阴性-L组和培养阴性-H组中分别为53.1％和48.72％，而在培养阴性-M组中的比例显著降低(P＜0.05)。
四、对牛奶进行蛋白质差异表达水平及功能鉴定
(1)蛋白质浓度测定(参考碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒)
表6蛋白浓度测定所需试剂
取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以-20℃长期保存。取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。例如取20uL 25mg/ml蛋白标准，加入980uL稀释液即可配制成0.5mg/ml蛋白标准。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9％NaCl或PBS稀释标准品。稀释后的0.5mg/ml蛋白标准也可以-20℃长期保存。根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50∶1)配制适量BCA工作液，充分混匀。例如5ml BCA试剂A加100uL BCA试剂B，混匀，配制成5.1ml BCA工作液。BCA工作液室温24小时内稳定。将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20uL加到96孔板孔中，加稀释液补足到20uL。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20uL。各孔加入200uL BCA工作液，37℃放置20-30分钟。(也可以室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间)。测定A562，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。标准曲线和样品浓度见图5。
(2)蛋白质定量
乳清分离：
取10mL牛奶样品4℃，3000×g离心20min(Beckman Coulter AvantiJ-26XX离心机，转子JA-25.15，Brea，CA)。取1ml脱脂乳加入30μL33％的乙酸，震荡混匀。室温放置10min，在上述混合液中加入30μL 3.3M的乙酸钠，混匀后，14000×g，20℃离心30min。超速离心后，将样品分离成3相，分离中间层的乳清液，-20℃保存，用于蛋白质组学样品制备。
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：
使用SDS-PAGE进一步分离纯化乳蛋白。配制12％的分离胶。将分离胶注入玻璃板夹层中，上部用MilliQ水封面，保持胶面平整，待分离胶聚合后，配制5％浓缩胶。配制好浓缩胶后，倒去分离胶表面的少量水分，然后灌入浓缩胶，插入点样梳。将待分析鉴定的蛋白质样品，阳性对照样品(必定含有所测定蛋白)和阴性对照样品(必定不含有所测定蛋白)，加入1/4样品体积的5×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃水浴3-5分钟(插入冰浴冷却后加样)。在电泳槽加入电泳缓冲液后，小心拔去上样梳，然后用注射器洗干净加样孔，检查一下电路连通状况，然后关闭电源。牛奶样品的上样蛋白含量为18μg，加样量为每孔30μL。加样完毕后，接通电源，起始时用的低电流或低电压(80V较为适宜)，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电流(或电压)(120V较为适宜)，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号(戴手套，防止污染胶面)。将电泳结束后的凝胶，用考马斯亮蓝G-250染色，室温染色4-6h。再将胶块取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白条带清晰。
还原烷基化及酶解：
除非另有说明，本试验中使用的所有NH4HCO3(ABC，0.05M)缓冲液pH均为8。每个步骤后，将样品超声处理1min，然后离心。使用解剖刀将每个样品的凝胶泳道切成8片，每个切片切成1-3mm，并转移到低结合微量离心管(0030 108.094，Eppendorf，Hamburg，Germany)。在0.05M二硫苏糖醇中60℃条件下温育1h将蛋白质还原，然后在室温下在黑暗中在0.1M碘乙酰胺中孵育1h。甲酰胺甲基化后，将凝胶片用0.05M ABC缓冲液洗涤3次。然后将凝胶片冷冻并解冻3次以增加胰蛋白酶的可接近性。将样品在20μL新鲜制备的胰蛋白酶溶液(10ng/μL)中再水合。加入额外的0.05M ABC缓冲液以在室温下孵育过夜后将消化液的上清液转移到干净的低结合的离心管中。将每次超声处理后的上清液加入到相同的低结合微量离心管中。使用pH纸检查肽混合物的最终pH。
液相串联质谱(LC-MS/MS)分析：
将总共18μL的胰蛋白酶消化的牛奶级分在最大压力为27,000kPa的0.10×30mmMagic C18AQ 200A5μm微珠(Michrom Bioresources Inc.，Auburn，CA)预浓缩柱(室内制备)中注射。将肽从预浓缩柱洗脱到0.10×200mm Prontosil 300-3-C18H分析柱(Prontosil，Bischoff，Germany)上，乙腈梯度以0.5μL/min的流速洗脱，使用从9至34％乙腈在50分钟内用0.5vol/vol％乙酸在水中。在3min内，使用乙腈百分比增加至80％(在乙腈和水中用20％水和0.5体积/体积％乙酸)洗涤该柱。在预浓缩和分析柱之间，通过固定在P777 Upchurch微交会(IDEX，Oak Harbor，WA)的固体0.5-mm平板电极将3.5kV的电喷雾电压直接施加到洗脱液上。在LTQOrbitrap XL(Thermo Electron，San Jose，CA)上，在m/z380和1,400之间测量全扫描正模式FTMS光谱。在线性阱(MS/MS阈值＝5.000)中，以数据依赖模式记录FTMS扫描中4个最丰富的双重和三重充电峰的CID碎片MS/MS扫描。
乳清蛋白质定量：
尽管在蛋白质鉴定前已将所有牛奶样品的总蛋白浓度调整一致(所有乳清样本蛋白浓度均为20mg/mL)，但鉴定结果发现，细菌培养阳性样品和培养阴性样品组之间的蛋白质表达水平存在显着差异，与细菌培养阴性样品相比，有58种蛋白质的表达水平在细菌培养样阳性样品中显示出显著差异(P＜0.05)。如图6所示，这58种蛋白质中，有38种蛋白质的表达下调，其中CD36，CD59，CSN3，BTN1A1，ABCG2，PLIN2，GP2，UBC和IDHI的下调在培养阳性奶样中更呈现极显着(P＜0.01)。其余20种蛋白质表达上调，其中CATHL4，CATHL3，CATHL2，ITIH4，SERPINA3-1，PTGDS，SAA3和IGKV3-20在培养阳性样品中的表达量超过培养阴性样品的约8倍。此外，还发现21种差异表达蛋白仅在细菌培养阳性样品中检测到，而培养阴性样品中未检测到。
由表7可知，在这些上调的蛋白质中，大多数与免疫系统有关，如CATHL2，CATHL3，CATHL4，IGKV3-20，PTGDS和LTF，其中上调最显著的蛋白质是CATHL4(P＜0.01)和CATHL3(P＜0.01)其上调比例是其他差异表达蛋白的约8倍。在显著下调的蛋白质中，BTN1A1与脂质合成和分泌有关；PLIN2和GP2与转运有关；ABCG2具有酶活性；MFGE8参与细胞凋亡；CD59与免疫系统有关。下调极显著的蛋白质为CD36(P＜0.01)，其下调比例为其他差异表达蛋白的约20倍。
表7细菌培养样阳性与细菌培养阴性奶样中差异显著的表达蛋白列表
细菌培养阳性奶样中蛋白质鉴定：
在58种差异表达显著的蛋白质中，有21种蛋白质仅在细菌培养阳性奶样中检测到，而培养阴性样品中未检测到。由表8可知，这21种蛋白质均属于菌体蛋白。其中显著上调的表达蛋白包括ARSC，HNS，cfr，SODA，pscF(P＜0.05)，上调极显著的蛋白质有SRAP，THIE，aacA-aphD(P＜0.01)。此外，在所有鉴定到的菌体蛋白中，所属凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)的蛋白质占比最多，达到36.84％，其次是金黄色葡萄球菌菌体蛋白(19.14％)。由图7可知，这些菌体蛋白的主要功能包括吸附、物质转运、免疫保护、细菌合成以及免疫原性。其中，多数菌体蛋白发挥了细胞吸附(30.8％)、免疫原性(22.5％)和细菌合成(21.1％)的分子功能。
表8细菌培养阳性奶样中差异表达显著的菌体蛋白
注：1菌体蛋白占细菌培养阳性样本中表达蛋白的百分比(n＝21)
2菌体蛋白占所有显著调节表达蛋白总数量的百分比(n＝58)
细菌培养阴性奶样中差异表达蛋白：
在细菌培养阴性奶样中，根据不同SCC水平将样品分为三组，即无病原体-H(SCC＞400,000个细胞/mL)组、无病原体-M(100,000＜SCC＜400,000个细胞/mL)组和无病原体-L(SCC＜100,000个细胞/mL)组，对3组样品中的差异表达蛋白进行鉴定。由表9和图8可知，在高SCC的奶样中，显著上调表达的蛋白质多数为特异性免疫相关蛋白(59.4％)(如LTF、CATHL2、CATHL3、PTGDS和IGKV3-20)，此外还包括功能为蛋白酶抑制剂(15.2％)的表达蛋白(如SERPINA3-1，ACTB，和SERPINA1)同样在高SCC奶样中显著上调。
在7种显著下调的差异表达蛋白中，多数蛋白功能与免疫应答无关而与其他生物学功能相关。其中BTN1A1，APOA4和PLIN2与脂质代谢功能有关；IDH1与具有催化活性；MFGE8可介导吞噬细胞凋亡；LALBA和CSN3与乳蛋白合成有关。
表9细菌培养阴性奶样中显著调节差异表达蛋白
注：1比值＞1代表与低SCC组相比，高SCC组中差异蛋白上调；比值＜1代表与低SCC组相比，高SCC组中差异蛋白下调。
五、牛体细胞分型与乳蛋白差异表达分析方法的相关性
(1)细菌培养阳性与细菌培养阴性乳清样本中差异表达蛋白间的相互作用
本试验通过Label free非标记定量蛋白质组学技术鉴定了参与乳腺炎症反应过程的几种功能蛋白质，如参与免疫保护或分泌，酶活性，细胞迁移，物质转运，凝血以及急性期反应等，还包括一些特殊的菌体蛋白。然而，参与炎症反应过程的多种蛋白质的功能发挥并不是独立完成的，而是存在着复杂的互作关系。本试验使用最版本的STRING 10数据库分析了显著差异表达蛋白间的相互作用，这种相互作用既包括蛋白质之间直接的物理作用，也包括蛋白质之间间接的功能相关性。由图9可知，在复杂的蛋白互作网络图中LGB，LTF，THIE，BTN1A，C3，pscF和UBC这7蛋白之间紧密连接。通过GO功能注释分析发现这些互作关系紧密的蛋白质大多与免疫应答相关。
UBC(聚泛素-C)作为几种蛋白互作关系网络中的中心蛋白在细菌培养阳性和培养阴性乳清样本中都有较高的浓度。UBC参与转录因子NF-κB激活的信号传导过程。NF-κB在细胞因子诱导的基因表达中起关键性的调控作用，它调控的基因编码急性期反应蛋白、细胞因子、细胞粘附分子、免疫调节分子、病毒瘤基因、生长因子、转录和生长调控因子等。通过调控多种基因的表达，NF-kB参与免疫反应、炎症反应、细胞凋亡、肿瘤发生等多种生物进程。病原体入侵乳腺通过菌体蛋白THIE(硫胺素-磷酸合酶)吸附于乳腺上皮细胞，定植后开始大量繁殖，引发炎症。
LGB(乳球蛋白)肝脏中产生并迁移到感染部位以抑制微生物的生长。部分γ-球蛋白积极参与防御体系，并支持嗜中性粒细胞的吞噬作用。而C3(补体蛋白C3)是慢性炎症中嗜中性粒细胞的化学引诱物，特别是具有对IMI病原体的免疫应答成功的动物具有快速有效的中性粒细胞募集能力随后汇集到牛奶中[107]。因此，当合适的抗体结合细菌时，促进了嗜中性粒细胞的病原体识别和破坏。随炎症的发生，菌体蛋白(pscF)开始对巨噬细胞产生更多的毒性，使其吞噬功能低效，这就在一定程度上解释了，试验一中随SCC的增多，巨噬细胞含量有逐渐下降的趋势。BTN1A1(丁基菲林亚族1A1)受到炎症刺激，激活CD4和CD8T细胞的增殖。但BTN1A1同时具有调节乳脂分泌的功效，由于炎症的影响，乳脂合成受阻，导致BTN1A1蛋白表达显著下调。这就在一定程度解释了淋巴细胞并没有随SCC的增多而呈线性增长趋势。
LTF(乳铁蛋白)由乳腺上皮细胞和嗜中性粒细胞合成。它是具有抗菌，抗病毒，免疫调节功能。从图9中可看出，LTF与UBC都对菌体蛋白(pscF和THIE)产生作用。LTF除了通过减少自由基形成和通过下调LPS诱导的细胞因子来调节免疫应答，并且是免疫功能诸如粒细胞生成，细胞因子产生，抗体合成，自然杀伤细胞毒性，淋巴细胞增殖和补体激活的有效激活剂，也是白细胞介素(IL-1，IL-2)和肿瘤坏死因子(TNF)的合成的必须物质。
(2)几种紧密互作蛋白在不同乳腺健康状态组中的差异表达
与健康组相比，传染型病原体感染的奶样中UBC，LGB，C3，LTF和pscF这5种蛋白质表达量显著增加(P＜0.01)，而环境型病原体感染的奶样中只有LBG和LTF蛋白浓度含量较高(图10E，图10A，图10B，图10G，图10F)。其中C3，LGB和LTF与PMN的合成与吞噬功能相关，这些蛋白浓度的增多代表抗菌活性和免疫反应的活跃程度；UBC参与NF-κB通路激活与信号转导，再一次说明其所在机体内强烈的炎症反应过程。这再一次验证了前面试验中所发现的，感染传染型病原体的奶样中PMN含量明显增多，与环境型和机会型病原体相比，传染型病原体的致病力更强。机会型病原体感染的奶样中只有THIE(图10C)和LTF这2种蛋白质表达显著增加(P＜0.01)，THIE所属凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)菌体蛋白，其强大的免疫保护功能，能够帮助CNS逃逸免疫防御，抑制吞噬作用。机会型IMI未观察到LGB等免疫球蛋白的显著变化的变化，可能的原因为CNS通常在乳房皮肤上发现，一些培养阳性结果可能是由于在收集复合奶样时的乳头皮肤污染而不是真正的乳腺内感染。BTN1A1(丁基菲林亚族1A1)蛋白，主要激活CD4和CD8T淋巴细胞增殖。此蛋白只在健康组和培养阴性-L组中显著表达(P＜0.01)，而在高SCC组和培养阳性奶样中表达均不显著(图10D)。免疫蛋白差异表达的鉴定，再一次验证了体细胞分型检测结果。即淋巴细胞是健康乳腺中的主要细胞群体，并且随着SCC的增多而逐渐减少。
前面结果发现，具有极低SCC(76,000～100,000个/mL)的奶样中分离出大量的CNS，且PMN比例在此范围内，显著增加。通过蛋白质鉴定发现，C3，LTF和THIE在培养阴性-L中表达量显著增加(P＜0.01)。C3(图10B)和LTF(图10G)蛋白的显著表达量，说明即使在低SCC的乳区内，血液和乳腺中的PMN逐渐募集到感染或创伤乳腺部位，此时慢性炎症很可能已经开始发生。此外THIE蛋白在培养阴性-L组乳样中被检测到，这一结果证明，即使通过细菌培养鉴定技术并没有鉴定到病原微生物的存在，但蛋白质鉴定结果表明CNS菌体蛋白(THIE)已经存在于乳区内，只是CNS存在量低于细菌鉴定检测最低限度，或是由于试验所分析的牛奶样品是4个乳区的复合乳，因而存在健康乳区的稀释效应。这再一次证明了Labelfree定量蛋白质组学的高度灵敏性。
以上具体实施方式基于Label free非标记定量蛋白质组学技术，分析奶牛不同乳腺健康状态下乳清中的差异表达蛋白质。结果表明，乳腺的健康状态与特异性蛋白质的存在或不存在无关，但主要涉及蛋白质的表达水平。在所鉴定出的692种表达蛋白中，有58种蛋白质显示出显著调节变化。与细菌培养阴性乳清样本相比，细菌培养阳性乳清样本中有20种表达蛋白显著上调，而上调蛋白质的功能多数与特异性免疫反应有关。一些显著上调表达的急性期蛋白可作为IMI的诊断标志物。此外，有21种仅在培养阳性乳清样本中鉴定到的菌体蛋白，这些菌体蛋白的存在一方面验证了细菌培养鉴定结果，另一方面，从菌体蛋白特性和功能角度，阐明了病原微生物诱发炎症的分子机制。另外30种显著下调的表达蛋白中，多数蛋白功能与免疫保护无关，而与其他生物学功能相关，例如脂质代谢、乳糖合成、乳汁分泌以及在慢性炎症中对免疫细胞(T淋巴细胞、嗜中性粒细胞等)的诱导趋化作用。本发明从蛋白质组成变化的角度揭示了不同乳腺健康状态下乳腺内的生物学现象，并为检测炎症乳样提供了生物标记物。
从以上试验可以看出，体细胞分型检测可用于对奶牛乳腺健康状况做出更详细分析。特别是在低SCC的奶样中更早的识别炎症起始发生。在健康乳腺中，淋巴细胞为主要细胞群，而在急性炎症中，PMN为优势细胞群，抵御入侵病原菌并对乳腺进行免疫保护。而乳腺早期炎症反应的发生明显低于目前公认的健康乳腺SCC(SCC＜100,000个细胞/mL)的阈值。因此，在奶牛乳腺炎症监测这一领域的进一步研究应集中在对具有低SCC奶样中免疫细胞的持续观测。此外，与环境型和机会型病原体感染相比，感染传染型病原体(如金黄色葡萄球菌、无乳链球菌等)的乳汁中，PMN比例明显升高。但是在低SCC乳中分离出大量的CNS，且PMN比例在76,000-100,000个/mL范围内，显著增加，表明CNS是诱发早期乳腺炎症的潜在病原体。细菌培养阴性样品中，中等至高SCC乳汁中观察到酪蛋白和乳糖含量的显着变化。而在细菌培养样品样本中没有观察到差异，表明这些乳成分的变化是由于炎症而不是感染导致。鉴于环境型病原体也对乳成分造成负面影响，应高度重视奶牛健康管理。
乳腺的健康状态与特异性蛋白质的存在与否无关，但主要涉及蛋白质的表达水平。在所鉴定出的692种表达蛋白中，有58种蛋白质显示出显著调节变化。与细菌培养阴性乳清样本相比，细菌培养阳性乳清样本中有20种表达蛋白显著上调，而上调蛋白质的功能多数与特异性免疫反应有关。一些显著上调表达的急性期蛋白可作为IMI的诊断标志物。此外，有21种仅在培养阳性乳清样本中鉴定到的菌体蛋白，这些菌体蛋白的存在一方面验证了细菌培养鉴定结果，另一方面，从菌体蛋白特性和功能角度，阐明了病原微生物诱发炎症的分子机制。另外30种显著下调的表达蛋白中，多数蛋白功能与免疫保护无关，而与其他生物学功能相关，例如脂质代谢、乳糖合成、乳汁分泌以及在慢性炎症中对免疫细胞(T淋巴细胞、嗜中性粒细胞等)的诱导趋化作用。差异表达蛋白的检测能够揭示不同乳腺健康状态下乳腺内的生物学现象，并为检测炎症乳样提供了潜在的生物标记物。
以上内容描述了本发明的基本原理和主要特征，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (8)

1.一种奶牛早期乳腺炎症监测方法，所述方法包括：测定牛奶样品中至少一种标志物的水平，体细胞数＜100,000个/mL的牛奶中，PMN比例高于70％，表示早期炎症发生。
2.根据权利要求1所述奶牛早期乳腺炎症监测方法，其特征在于，在牛奶样品中，蛋白质LGB，LTF，THIE，BTN1A，C3，pscF和UBC的表达水平在细菌培养阴性-高体细胞数样品与细菌培养阴性-低体细胞数样品中的蛋白比例比值＞1，则表示早期炎症发生，其中低体细胞数样品是指体细胞数＜100,000个/mL的样品，高体细胞数样品是指体细胞数＞100,000个/mL的样品。
3.根据权利要求1或2所述奶牛早期乳腺炎症监测方法，其特征在于，在细菌培养阴性-低体细胞数样品中的表达量与在细菌培养阳性样品中表达量的Log2蛋白比例比值＞1，则表示早期炎症发生，其中低体细胞数样品是指体细胞数＜100,000个/mL的样品。
4.根据权利要求1-3任一所述奶牛早期乳腺炎症监测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对牛奶进行体细胞数检测；
(2)对牛奶进行病原微生物鉴定：包括菌落数计数和细菌学鉴定；
(3)对牛奶进行体细胞分型检测；
(4)对牛奶进行蛋白质差异表达水平及功能鉴定：包括蛋白质浓度测定、蛋白质定量、分析蛋白差异表达水平及功能鉴定。
5.根据权利要求4所述奶牛早期乳腺炎症监测方法，其特征在于步骤(1)采用体细胞计数仪测定牛奶体细胞数。
6.根据权利要求4所述奶牛早期乳腺炎症监测方法，其特征在于步骤(2)菌落数计数测试方法如下：制备10倍系列稀释样品匀液，共制备4个稀释梯度，分别为1∶103、1∶104、1∶105、1∶106；吸取500μL样品匀液于无菌琼脂平皿内，每个稀释梯度做两个平皿；同时，分别吸取500μL空白稀释液加入两个无菌琼脂平皿内做空白对照；待琼脂平板冷却凝固后，将平板翻转并封口，在恒温培养箱(36±1℃)培养48h，然后测定菌落数计数。
7.根据权利要求4所述奶牛早期乳腺炎症监测方法，其特征在于步骤(3)体细胞分型检测的具体方法如下：取14mL的牛奶加入15mL的离心管中；2000rpm，离心10min；离心后，去掉上层的乳脂，然后弃掉上清；在离心管底加入1mL的PBS，转移到新的15mL离心管中，并在离心管中加10mLPBS，混匀；2000rpm，离心10min，弃掉上清；重复三次；细胞重选在1mL的PBS中；取400uL细胞悬液于5mL流式管1中，进行细胞计数；取100uL细胞悬液于5mL流式管2中，加入10L PI，进行检测。
8.根据权利要求4所述奶牛早期乳腺炎症监测方法，其特征在于步骤(4)中所述蛋白质浓度测定，参考碧云天蛋白浓度测定试剂盒；所述蛋白质定量是指：首先，将乳样品去脂后，除去高丰度蛋白酪蛋白，然后将乳清样品进行SDS-PAGE电泳；所述分析蛋白差异表达水平及功能鉴定采用Label free非标记定量蛋白质组学。
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