CN112326899A

CN112326899A - 一种鉴别牛乳的凝乳能力的方法及其应用

Info

Publication number: CN112326899A
Application number: CN202011197812.1A
Authority: CN
Inventors: 张书文; 吕加平; 郑思凡; 逄晓阳; 芦晶
Original assignee: Institute of Food Science and Technology of CAAS
Current assignee: Institute of Food Science and Technology of CAAS
Priority date: 2020-10-30
Filing date: 2020-10-30
Publication date: 2021-02-05

Abstract

本发明涉及生物制品检测技术领域，尤其涉及一种鉴别牛乳的凝乳能力的方法及其应用。本发明对凝乳能力强、凝乳能力差和凝乳能力极差甚至不凝乳的牛乳样品中的各类蛋白、盐以及各种DHI数据进行了对比分析，结果发现β‑乳球蛋白的基因型为AA的牛乳相较于AB和BB的牛乳凝乳能力更强，κ‑酪蛋白的基因型为BB的牛乳相较于AA和AB的牛乳凝乳能力更强，体细胞数量较多的牛乳凝乳能力较差，以及pH值高于6.8的牛乳凝乳能力较差。本发明据此提供了一种鉴别牛乳凝乳能力的方法，即通过对牛乳中β‑乳球蛋白、κ‑酪蛋白基因型、体细胞数量和pH值来判断牛乳的凝乳能力，这在发酵乳制品质量控制领域具有重要意义。

Description

一种鉴别牛乳的凝乳能力的方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物制品检测技术领域，尤其涉及一种鉴别牛乳的凝乳能力的方法及其应用。

背景技术

牛奶凝乳是生产酸奶和干酪等发酵乳制品生产过程中的关键步骤。在添加凝乳酶或发酵剂后，凝乳差或者不凝乳现象的出现严重影响了产品得率以及品质。在抗生素残留控制十分严格的情况下，还是会出现不凝乳或凝乳性差的现象，研究发现约有13％的奶牛，例如荷斯坦奶牛、Jersry奶牛等所产牛乳凝乳时间显著较长,并且约有2～4％的奶牛所产牛乳不凝乳，牛奶凝乳能力(MCP＝Milk coagulation properties)是决定牛奶转化为酸奶和奶酪比例的一个重要因素。因此，牛奶中的酪蛋白含量和MCP是干酪生产的关键因素。牛奶凝固能力是牛奶凝固过程中多种因素共同作用的结果。酪蛋白形成一个凝胶网络，夹带脂肪和奶酪的其他成分形成凝乳，据报道，牛乳的遗传因素中酪蛋白的多态性显著影响牛乳的凝乳能力。目前尚未有具体的牛乳凝乳能力评价，以及适合于加工为酸奶或是干酪的牛乳分类体系。

发明内容

为了解决现有技术存至少存在的一个技术问题，本发明提供一种鉴别牛乳的凝乳能力的方法及其应用。

第一方面，本发明提供一种鉴别牛乳的凝乳能力的方法，包括：

获得待测牛乳样本中的体细胞数量、β-乳球蛋白的基因型、κ-酪蛋白的基因型和pH值，根据所述待测牛乳样本中的体细胞数量、β-乳球蛋白的基因型、κ-酪蛋白的基因型和pH值判断所述待测牛乳样本的凝乳能力。

进一步地，所述判断所述待测牛乳样本的凝乳能力：

体细胞数量低的牛乳相较于体细胞数量高的牛乳具备更强的凝乳能力；β-乳球蛋白的基因型为AA的牛乳相较于AB和BB的牛乳具备更强的凝乳能力；κ-酪蛋白的基因型为BB的牛乳相较于AA和AB的牛乳具备更强的凝乳能力；pH值低于6.80的牛乳相较于高于6.80的牛乳具备更强的凝乳能力。

依据上述方法，在实际应用中，可以依据其中任一项结论进行牛乳凝乳能力的评价，或者在检测完上述所有指标后，综合所有检测结果进行牛乳凝乳能力的评价，对于凝乳能力更强的牛乳可以用来制备干酪等固体奶制品，对于凝乳能力较差的牛乳可以用来制备酸奶等液体奶制品。

进一步地，所述更强的凝乳能力为：凝胶时间更短或凝胶强度更强。

进一步地，所述凝胶时间更短为凝乳时间在18min以内。

进一步地，所述凝胶强度更强为凝胶强度在30min之内能达到52Pa以上。

进一步地，所述体细胞数量为通过所述待测牛乳样本的DHI数据得到。

本发明进一步提供体细胞数量、β-乳球蛋白的基因型、κ-酪蛋白的基因型和pH值在鉴别牛乳凝乳能力中的应用。

本发明进一步提供所述方法在牛乳产品加工分类中的应用，所述应用具体为，在判断所述待测牛乳样本的凝乳能力之后，将所述具备更强的凝乳能力的牛乳加工为干酪制品，将不具备更强的凝乳能力的牛乳加工为奶制品

本发明具备如下有益效果：

本发明对凝乳能力强、凝乳能力差和凝乳能力极差甚至不凝乳的牛乳样品中的各类蛋白、盐以及各种DHI数据进行了对比分析，结果实验验证了得到了两种和牛乳凝乳能力密切相关的蛋白β-乳球蛋白和κ-酪蛋白，其中，β-乳球蛋白的基因型为AA的牛乳相较于AB和BB的牛乳凝乳能力更强，κ-酪蛋白的基因型为BB的牛乳相较于AA和AB的牛乳凝乳能力更强。除此之外，本发明还发现体细胞数量较多以及pH值高于6.80的牛乳凝乳能力较差。据此，本发明提出将β-乳球蛋白和κ-酪蛋白的基因型以及体细胞数量作为判断牛乳凝乳能力的依据，同时提出了根据这些指标鉴别牛乳凝乳能力的方法，这在牛乳制品质量控制领域具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的流变仪检测三种牛乳样品牛乳凝乳性能结果，其中，WC为凝乳性能好的样品，PC为凝乳性能差的样品，NC为不凝乳的样品；

图2为本发明实施例1提供的毛细管电泳和高效液相色谱HPLC检测牛乳凝乳性能结果，其中A～C代表凝乳性能好的牛乳样品，D～F代表凝乳性能差的牛乳样品，G～I代表凝乳性能极差至不凝乳的样品，1为α-La；2为β-Lg；3～4为α-CN；5为κ-CN；6～7为β-CN；

图3为本发明实施例1提供的不同凝乳特性的牛乳液相图谱。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本实施例中涉及到的试剂和仪器若无特殊说明，均可以市售购得。

实施例1

本实施例针对凝乳能力强和差不同牛乳进行了多项指标的分析，具体流程如下：

1、采集血样和乳样

1.1样品采集

血样采集：本实施例通过牛场3625头母牛系谱分析，本实施例采集了其后代1071头16月龄大青年、一胎、二胎母牛血样并提取DNA，采用竞争性等位基因特异性PCR对样本进行分型，之后利用KASP技术对其进行了CSN3(κ－CN)和BLG(β－LG)基因分型检测。

乳样采集：初筛和复筛方法。在奶场，采集已知的6种基因型原料乳样品，每种基因型样品每次采集至少30份，每份50-100mL，共180份；相同试验重复3次(每隔15天采集1次，共采集三次)。从中筛选出凝乳能力好、凝乳能力差及不凝乳每类至少5份样品；然后，重复采集选出的样本奶样5次(隔3天采集1次，每天采集早、中、晚三次，每次采集50毫升-100毫升)。

1.2感应耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)检测原料乳中Ca、Mg、P含量

本实施例使用ICP-MS(Agilent，California，美国)测定样品中可溶性Ca、Mg和P的浓度。样品前处理将牛乳分为可溶相和胶体相，所有样品均一式三份测量。其中，胶体相元素含量＝元素总含量－可溶相元素含量。

1.3流变仪分析

本实施例准备已预选好的牛奶样品20mL，用10％(体积/体积)的乳酸将pH调节至6.5，移取适量样品至流变仪样品池中，检测条件为应变1％，频率1Hz，预热并稳定温度在33℃后，样品添加凝乳酶(酶浓度为0.038IMCU/mL)，搅匀后，开始测定1h，检测指标包括凝乳时间、储能模量G'、损失模量G”即等；

1.4DHI数据收集和整理

数据来自该采样牛场采样牛只的DHI记录，主要包括牛号、基因型、采样时间、胎次、产犊日期、泌乳天数、日产奶量、乳脂率、乳蛋白率、脂蛋白比、体细胞数、体细胞评分等信息。为保证结果的可靠性，数据不完整的记录不纳入分析。

1.5毛细管电泳分析蛋白多态性

采用毛细管电泳定量分析样品牛乳κ-cn和β-lg的含量。将样品与样品缓冲溶液按1∶3(V/V)的比例混合，室温放置1h，10000r/min离心5min，取上清液，用0.45μm的滤膜过滤后直接进样。

1.6高效液相色谱法分析牛乳中蛋白质含量

本实施例向奶样中加入等体积的工作液Ⅰ样品融化后振荡10s混匀，室温静置1h。将混合溶液16000g 4℃离心5min，除去表层乳脂，取底层溶液300μL于新的离心管中，加入工作液Ⅱ体积比1∶3稀释，混匀，过滤到进样瓶中待测。流动相A为0.1％TFA水溶液，流动相B为0.1％TFA乙腈溶液。流动相经抽滤、超声脱气后备用。

1.7数据处理与分析

除另有说明，每种处理均进行三次重复。进行具有相互作用作用的单向ANOVA以确定显着差异(P<0.05)。使用Duncan的多重范围测试比较了多个均值之间的差异。统计学显着性设定为P<0.05。绘图软件由Origin 9.0完成。

2、结果与分析

2.1凝乳能力判定标准

本实施例按照凝乳时间来划分凝乳等级，凝乳时间在18min以内的划分为凝乳性能好(WC)乳样，凝乳时间在18-30min之内的划分为凝乳性能差(PC)乳样，凝乳时间大于30min的乳样即为不凝乳样(NC)。

2.2凝乳强度判定

凝乳好样品的凝胶强度在30min内能达到130Pa以上，最小也在50Pa，而NC样品在30min内的凝胶强度仅有20Pa，甚至更低，具体地，其中WC:52.18-151.97Pa；PC：4.18-31.28Pa；NC：0.028-0.67Pa。

一般认为，G'值越高，其凝胶结构越致密。凝胶化定义为凝胶G'值大于1Pa的时间点。通过流变数据可以总结出，在预选出的全部样品中，可以明显的界定出凝乳效果好、差以及不凝乳的样品，其凝乳时间从表1中可以看出，WC、PC与NC的凝乳时间经过分析是存在显著性差异的，并且达到极显著水平。图1显示的是WC、PC和NC牛乳的动态流变示意图，从图中可以看出，WC牛乳的G'值最高，其凝胶结构最为紧密，并且凝乳时间最短，凝乳效率最高；而PC牛乳虽能形成凝胶状态，但其凝乳时间较长，G'值普遍比WC牛乳要低，证明其凝胶结构不够紧致，不坚硬，形成的凝乳状态不好，会影响生产品质；NC牛乳显而易见基本未形成凝乳状态，其G'值甚至未达到10Pa，没有形成凝胶状态，必会影响最终产品品质。表2显示了β-LG AA基因型凝乳时间较短，且凝胶强度最高，但乳球蛋白含量较高会对凝乳产生不利影响，延长RCT并降低凝乳强度；κ-CN BB基因型较其他四种基因型，其凝乳时间最短，G'30值最高，证明形成的凝胶结构更为致密，形成了高度交联的网状结构，BB型基因对牛乳凝乳产生有利影响。

表1动态流变数据(均值±SE)定义牛乳凝乳等级的显著性分析结果

**代表显著性水平为P＜0.01，差异达到极显著水平；

¹主观评价30分钟时的硬度：坚固＝足以形成立方体；柔软＝不足以形成立方体。

等级按照G'₁₈(Pa)的时间来划分的；不凝乳时间统一选取检测总时长60min作为最终时间。

表2基因型与凝乳时间及凝乳硬度的关系

*代表显著性p<0.05，差异达到显著性水平

2.3基因型

2.1牛乳蛋白基因型频率统计

血样采集结果中显示，CSN3基因设计4个位点，BLG基因设计2个SNP位点，其中CSN3基因有AA、AB、AE、BB、BE、EE六种基因型，BLG基因型有AA、AB、BB三种基因型。

表3所示是牛场现有奶牛中已知基因型的牛乳蛋白基因型及频率，κ-CN和β-LG的乳蛋白基因型存在比例上的差异。从表中也可以看出，酪蛋白和乳球蛋白的不同基因型牛乳的凝乳频率也是存在明显差异的。分泌κ-CN AA基因型牛乳的母牛所占比例最高，在κ-CN的AB、

BB、BE基因的总体凝乳效果是较好的，凝乳频率都达到了70％以上。等位基因B对凝乳有积极作用，与AB型相比，BB基因型更能提高干酪产量，等位基因A对凝乳产生消极作用。κ-CN EE在整体牛群中比例含量最少，考虑到母牛的更替换代，所以在后续分析处理中并未对此基因型列入到数据库中；在所有奶牛组中最常见的β-乳球蛋白基因型是AB,β-乳球蛋白的AA和BB基因型的凝乳效果良好，凝乳频率都超过了80％，而AB基因型有33.01％的牛乳凝乳性能很差，甚至有7.56％的牛乳不凝乳，这就导致了其整体的凝乳能力大大减弱。从以上结果中可以看出，在如此巨大的检测数量下，显示有至少4％以上的牛乳存在不凝乳的现象，若这部分牛乳应用到实际生产过程中，其对生产效率的影响可想而知，这也证明了做此项研究的必要性。结果表明：κ-CN和β-LG的B变体可通过缩短凝乳时间，改善凝乳硬度而对MCP有有利影响。另外，κ-CN A和E型变体对凝乳有负面影响。

表3κ－CN和β－LG蛋白各基因型牛乳的凝乳频率

2.4不同凝乳类型牛乳组成及盐分布

从表4中可以明显看出，在非凝样品中的盐含量是明显低于凝乳样品的，尤其胶体钙含量明显较低，以及上清液和胶体相中磷元素含量具有明显差异，说明这些离子含量的差异对凝乳能力有明确影响。

结果同时显示，凝乳性能好的牛乳体细胞数SCC明显低于NC及PC样品，SCC含量越高，牛乳的凝乳性能越差，当然还包括有乳房炎的个体牛，泌乳量减少，牛乳中SCC含量增加。SCC增加可能与纤溶酶活性增加有关，纤溶酶降解产物的积累也可能影响凝乳，因为这些成分会干扰导致凝乳形成的聚集胶束，可以迅速将β-CN、αs1-和αs2-CN裂解为较小的多肽。另外乳脂和乳蛋白含量越高，牛乳的凝乳效果越好，但乳脂的蛋白质的含量对MCP的影响是有限的，凝乳过程包含多种机制，如已知pH的变化会影响酶的活性，证明纤溶酶在低pH牛奶中的活性较低。此外，乳糖含量与MCP呈正相关趋势，在凝乳性能好WC样品中含量略有增高，但其中机制尚不清楚。有解释说乳糖是牛奶中重要的渗透调节剂，当乳腺发炎时，血液中的离子流入乳汁的量增加，会导致高SCC乳汁中的电导率增加和乳糖含量降低。

除此之外，结果显示，WC样品的pH值整体要比凝乳差和不凝乳样品要低，这可能是由于在高pH下溶解胶束P和Ca的时间更长，所以pH越高，牛乳的凝乳性能越差。表4中显示不同凝乳性能的牛乳中乳蛋白含量无明显差异或显著趋势，但总蛋白中酪蛋白含量与凝乳性能呈正相关趋势，牛乳中酪蛋白含量越高，凝乳性能MCP越好，凝乳时间越短，凝胶强度越高。

一般凝乳性能好的牛乳pH值低于6.80，而PC及NC样品pH值一般都在6.85以上。并且牛乳中对凝乳有重要的钙离子在胶体和可溶相的比例分布差异明显，WC样品胶体钙含量较PC、NC样品要高。

表4牛乳组成和矿物质成分(均值±SD)与凝乳等级的关系

¹测量脱脂奶中的总矿物质含量。在超速离心的上清乳浆中测量可溶性矿物质含量。胶束矿物质含量＝总矿物质含量—可溶性矿物质含量。

*p<0.05,**p<0.01,***p<0.0001.基于ANOVA检验计算的显着性值。

2.5毛细管电泳和高效液相色谱HPLC检测结果

从图2中可以看出，牛乳中几种蛋白质利用毛细管区带电泳分析方法可快速明了地检测出来。通过峰形和峰值的对比，WC样品的β-CN的大部分样品都存在两个峰，并且在NC样品中其他小峰，可能是水解产物，或者蛋白磷酸化水平较高。

凝乳性能好样品检测出的峰形明显，不同蛋白分离效果好，且无干扰峰，而PC和NC样品电泳图峰形交杂，有许多较小的杂峰，分离效果一般，存在许多分解或磷酸化程度较高的蛋白，这些因素是导致凝乳效果差的因素之一。

从图3中可以看出，其结果和毛细管电泳结果是相互对应的，凝乳好的牛乳蛋白相对含量要比PC和NC的高，PC和NC样品的图谱中出现了除主要乳清蛋白和酪蛋白五种蛋白的其他峰值，可能是在PC和NC样品中的其他种类蛋白含量较多，如proteolyticβ-CN，para-κ-CN等一些磷酸化程度较高的蛋白峰。乳蛋白质的异质性不仅表现在蛋白质的种类和不同遗传变异体(genetic variant)上，而且还表现在蛋白质翻译后的修饰上，如磷酸化、糖基化、二硫键的形成及蛋白质的水解。

结果显示，在所有奶牛组中，β-LG AB基因型最常见，而β-LG基因型为AA的牛乳要比基因型为BB或AB的牛乳更适于加工干酪，前者可以加快凝乳速度并且能够获得更高的干酪产量，这可能是由于含基因型为AA的β-LG的牛乳通常酪蛋白含量较高所致；κ-CN BB基因型牛乳具有较好的凝乳性能，较AA、AB等其凝乳时间更短和凝胶强度更强。凝乳性能好的样品中酪蛋白含量及钙离子含量较高，总胶体钙含量越高，对酶凝越有利，pH值较PC和NC样品要低，凝结受κ-CN含量的有利影响，酪蛋白和乳清蛋白组成和基因频率的变化会影响MCP的变化。乳蛋白的遗传多态性主要影响牛乳蛋白的相对浓度及其磷酸化程度，对凝乳的影响主要是通过影响蛋白浓度而产生间接影响。牛乳中α-LA的相对浓度对酶凝具有不利影响，相反，κ-CN相对含量越高的牛乳其凝乳性能越好。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种鉴别牛乳的凝乳能力的方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述判断所述待测牛乳样本的凝乳能力：

体细胞数量低的牛乳相较于体细胞数量高的牛乳具备更强的凝乳能力；和/或，

β-乳球蛋白的基因型为AA的牛乳相较于AB和BB的牛乳具备更强的凝乳能力；和/或，

κ-酪蛋白的基因型为BB的牛乳相较于AA和AB的牛乳具备更强的凝乳能力；和/或，

pH值低于6.80的牛乳相较于高于6.80的牛乳具备更强的凝乳能力。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述更强的凝乳能力为：凝胶时间更短，和/或，凝胶强度更强。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述凝胶时间更短为凝乳时间在18min以内。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述凝胶强度更强为凝胶强度在30min之内能达到52Pa以上。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述体细胞数量为通过所述待测牛乳样本的DHI数据得到。

7.体细胞数量、β-乳球蛋白的基因型、κ-酪蛋白的基因型和pH值在鉴别牛乳凝乳能力中的应用。

8.权利要求2-5任一项所述方法在牛乳产品加工分类中的应用，所述应用具体为，在判断所述待测牛乳样本的凝乳能力之后，将所述具备更强的凝乳能力的牛乳加工为干酪制品，将不具备更强的凝乳能力的牛乳加工为奶制品。