CN102653796A

CN102653796A - 一种分析啤酒大麦或大麦麦芽微生物群落的方法

Info

Publication number: CN102653796A
Application number: CN2012101681631A
Authority: CN
Inventors: 蔡国林; 陆健; 梁小刚; 张中华; 商曰玲
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2012-05-25
Filing date: 2012-05-25
Publication date: 2012-09-05

Abstract

本发明公开了一种嵌套聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（Nested PCR-DGGE）分析啤酒大麦或大麦麦芽中微生物群落结构的方法，该方法属于微生物生态学技术领域。本发明利用土壤DNA抽提试剂盒提取啤酒大麦、大麦麦芽样品的基因组DNA,采用嵌套PCR扩增细菌16S rDNA、真菌18S rDNA序列，PCR产物经DGGE分析后，对主要条带进行割胶回收，再次PCR后琼脂糖胶回收，T-A克隆，测序分析获取微生物的相关信息。本发明方便、快捷、重复性好，对分析啤酒大麦或大麦麦芽中的微生物及微生物对麦芽品质的影响具有很好的指导意义。

Description

一种分析啤酒大麦或大麦麦芽微生物群落的方法

技术领域

本发明涉及一种啤酒大麦或大麦麦芽微生物群落的方法，特别是一种用嵌套聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（Nested polymerase chain reaction denaturing gradient gel electrophoresis，Nested PCR-DGGE）技术分析啤酒大麦或大麦麦芽中微生物的群落结构的方法。

背景技术

嵌套PCR是一种变异的聚合酶链式反应(PCR)，即使用内、外两对引物扩增目标片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似，第二对引物位于在第一次PCR扩增片段的内部，因此嵌套PCR有着特异性强，准确率高的优点。

变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术已广泛应用于食品发酵领域，该技术最初是由Fischer和Lerman在1979年提出用于检测DNA突变的一种电泳技术。1993年Muyzer等人首次将DGGE技术应用于微生物生态学研究，并证实了这种技术在研究自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性。DGGE可以将长度相同序列不同的DNA混合物进行分离：DNA分子中碱基的组成和排列差异，会使不同序列的双链DNA分子具有不同的解链温度，当双链DNA分子在含梯度变性剂(尿素、甲酰胺)聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，当某一双链DNA序列迁移到变性凝胶的一定位置，并达到其解链温度时，即开始部分解链，部分解链的DNA分子的迁移速度随解链程度增大而减小，从而使具有不同序列的DNA片段滞留于凝胶的不同位置，达到分离的目的。

将嵌套PCR和DGGE联合起来，理论上讲能够分辨出一个碱基对的差异，分辨率较高。DGGE指纹图谱上条带数的多少在一定程度上可以反应样品中微生物组成的差异，条带的亮度在一定程度上可以反应出样品中微生物的多少，相对于传统分离培养的方法有明显的优势。

麦芽（由啤酒大麦通过在人工控制的、适宜的外界条件下，有限制的发芽过程而得到的产品）是啤酒酿造的主要原料，啤酒大麦在田间生长时就已经附着成千上万的微生物，微生物在制麦过程中影响着麦芽的品质，并与啤酒酿造中所产生的问题息息相关。因此，利用嵌套PCR-DGGE技术分析啤酒大麦或大麦麦芽中的微生物群落结构意义重大而深远。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种分析啤酒大麦或大麦麦芽微生物群落的方法，采用Nested PCR-DGGE技术分析啤酒大麦或大麦麦芽中微生物的群落结构，避免了传统分离培养法存在的耗时等缺陷。本发明不同于传统的分离培养，选择细菌16S rDNA、真菌18S rDNA的通用引物扩增并将PCR产物进行变性梯度凝胶电泳，分析啤酒大麦或大麦麦芽中的优势微生物及影响麦芽品质的主要微生物。本方法具有方便、省时、重复性好等特点，若结合传统的分离培养能够更好地反映啤酒大麦或大麦麦芽中微生物群落结构的组成，对研究微生物对麦芽品质的影响有着重要的指导意义。

本发明的技术方案：用土壤DNA抽提试剂盒提取啤酒大麦或大麦麦芽样品的基因组DNA，Nested PCR扩增细菌的16S rDNA、真菌18S rDNA部分序列，产物经DGGE电泳分离后，对主要条带进行割胶回收，T-A克隆，测序分析，鉴定条带对应的微生物，测序结果在NCBI进行检索。

本发明通过Nested PCR-DGGE技术分析啤酒大麦或大麦麦芽中微生物的群落结构，可以对不同地区、不同品种的啤酒大麦或大麦麦芽进行微生物群落分析，也可以分析制麦过程中微生物群落的变化规律，为研究微生物对啤酒大麦或大麦麦芽品质的影响以及改善国产啤酒大麦麦芽酿造性能奠定了一定基础。

附图说明

图1细菌16SrDNA分析

A：第一轮PCR；B：第二轮PCR，B1、B2为啤酒大麦样品，m1、m2为大麦麦芽样品。

图2真菌16SrDNA分析

图中A：第一轮PCR；B：第二轮PCR，B1、B2为啤酒大麦样品，m1、m2为大麦麦芽样品。

图3细菌16S rDNAV3区分析

A：啤酒大麦，B：大麦麦芽。

图4真菌18S rDNA分析

中A：啤酒大麦，B：大麦麦芽。

图5微生物群落分析实例

具体实施方法

实施例1样品基因组DNA提取

取3份经液氮研磨好的样品（0.5g），用土壤DNA抽提试剂盒提取基因组DNA，详细步骤参照说明书。得到的粗DNA用核酸蛋白定量仪检测后存于﹣20℃备用。

实施例2嵌套PCR反应

分别合成细菌16S rDNA、真菌18S rDNA的嵌套PCR引物对，见下表：

Figure 2012101681631100002DEST_PATH_IMAGE001

25μL反应体系包括：模板DNA 0.5μL，引物各0.4μM，dNTPs 0.2mM，rTaq酶2.5U，Tris-HCl(pH 8.3)10mM，KCl 50mM，MgCl₂ 1.5mM，ddH₂O补足25μL。将第一轮PCR反应产物稀释50倍后做Nested PCR反应中的模板DNA。反应程序分别为：27F-1492R：95℃5min；95℃1min，50℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min。F341-GC-R518：94℃4min；94℃45s，55℃45s，72℃45s，30个循环；72℃10min。NS1-FR1：95℃8min；95℃1min，50℃1min，72℃2min，30个循环；72℃10min。NS3-GC-YM951：94℃4min；94℃1min，52℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min。PCR扩增结果如图1（细菌）、图2（真菌）所示，图中A：第一轮PCR；B：第二轮PCR，B1、B2为啤酒大麦样品，m1、m2为大麦麦芽样品。

实施例3DGGE分析

第二轮PCR产物进行变性梯度凝胶电泳；电泳的相关参数是：细菌8%的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂梯度范围为45%~65%（100%的变性剂浓度为7M尿素，40%甲酰胺），电泳温度60℃，电压150V；电泳时间5.5h；电泳缓冲液为1×TAE buffer；真菌8%的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂梯度范围为30%~50%，电泳温度60℃，电压150V；电泳时间6.5h；电泳缓冲液为1×TAEbuffer。DGGE指纹图谱如图3（细菌16S rDNAV3区）、图4（真菌18S rDNA）所示，图中A：啤酒大麦，B：大麦麦芽。

实施例4微生物群落分析

用无菌小刀将DGGE胶上的主要条带进行切胶回收，以不带GC夹的第二轮PCR引物为引物，按实施例2的条件进行再一次PCR扩增，并按照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书进行割胶回收；之后将回收产物进行T-A克隆，菌液PCR。将实施例2中得到的第二轮PCR产物与本实施例中阳性克隆子对应的PCR产物进行DGGE比对。将比对正确的阳性克隆子送上海生工生物工程有限公司，进行测序，测序结果登陆NCBI在Genbank数据库中进行检索；分析后得到啤酒大麦、大麦麦芽中微生物的群落结构。选取图3中a、b两条带为例子进行说明，条带测序结果如SEQ ID NO.a、SEQ ID NO.b所示。条带的Genbank比对结果见图5。最终确定其最可能的微生物如下表所示。

Figure 2012101681631100002DEST_PATH_IMAGE002

以上显示了和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中的描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围内所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.一种分析啤酒大麦或大麦麦芽微生物群落的方法，其特征在于提取啤酒大麦或大麦麦芽样品基因组DNA后，通过第一轮PCR扩增细菌16S rDNA和真菌18S rDNA；再次通过第二轮PCR，PCR产物经变性梯度凝胶电泳分析后，对主要条带进行割胶回收；T-A克隆，测序分析，及BLAST比对获取微生物群落信息；所述第二轮PCR时在引物对的正向引物的5’端加上GC发夹结构；

所述16S rDNA的第一轮PCR所用引物对为：

27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，

1492R：5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’；

PCR反应程序为：95℃ 5min；95℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；所述18S rDNA第一轮PCR所用引物对为：

NS1：5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’，

FR1：5’-AICCATTCAATCGGTAIT-3’；

PCR反应程序为：95℃8min；95℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 2min，30个循环；72℃ 10min；所述16S rDNA的第二轮PCR所用引物对为：

F341-GC：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG*CCTACGGGAGGCAGCAG-3’，

R518：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’；

PCR反应程序为：94℃4min；94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 45s，30个循环；72℃ 10min；所述18S rDNA第二轮PCR所用引物对为：

NS3-GC：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG*GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCC-3’，

YM951r：5’-TTGGCAAATGCTTTCGC-3’；

PCR反应程序为：94℃ 4min；94℃ 1min，52℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述啤酒大麦或大麦麦芽样品采用缩分法取样，最终样品的重量为0.5g。

3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于PCR反应体系为：模板DNA 0.5μL，引物各0.4μM，dNTPs 0.2mM，rTaq酶2.5U，Tris-HCl(pH 8.3)10mM，KCl 50mM，MgCl21.5mM，ddH2O补足25μL；将第一轮PCR反应产物稀释50倍后做第二轮PCR反应中的模板DNA。

4.权利要求1-2所述的方法，其特征在于所述变性梯度凝胶电泳的相关参数是：细菌电泳条件为8%的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂梯度范围为45%~65%，其中100%的变性剂浓度为7M尿素、40%甲酰胺，电泳温度60℃，电压150V；电泳时间5.5h；电泳缓冲液为1×TAE buffer；真菌电泳条件按为8%的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂梯度范围为30%~50%，其中100%的变性剂浓度为7M尿素、40%甲酰胺，电泳温度60℃，电压150V；电泳时间6.5h；电泳缓冲液为1×TAEbuffer。