CN101570786A - 用变性梯度电泳鉴定白酒大曲或酒醅酵母群落结构的方法 - Google Patents

用变性梯度电泳鉴定白酒大曲或酒醅酵母群落结构的方法 Download PDF

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Abstract

用变性梯度电泳鉴定白酒大曲或酒醅酵母群落结构的方法，属于微生物生态技术领域。本发明利用珠磨法提取白酒大曲或酒醅样品基因组DNA，通过设计常见酿酒微生物中酵母的通用DGGE引物，PCR扩增酵母核糖体中的种特异性DNA片段，DGGE电泳分离不同种属的对应的DNA片段，切胶回收优势微生物对应的条带，再次PCR扩增及连接T载体和阳性克隆的挑选，DGGE电泳重新比对后，进行测序鉴定切胶条带对应的微生物信息。本发明采用不依赖于培养的分子技术，具有简便、快速、灵敏等特点，本方法为发现、鉴别白酒大曲或酒醅中酵母群落结构提供了检测方法，进而为开发不同香型白酒风味定向的酿酒功能微生物提供了参考依据。

Description

用变性梯度电泳鉴定白酒大曲或酒醅酵母群落结构的方法
技术领域
用变性梯度电泳鉴定白酒大曲或酒醅酵母群落结构的方法，涉及使用PCR-DGGE现代分子生态技术克服传统微生物分离方法的缺陷型来分析白酒大曲和酒醅酵母群落结构并指导优势及高效风味定向酿酒微生物筛选的技术，本发明属于微生物生态技术领域。
背景技术
变性梯度电泳(DGGE)技术是由Fischer和Lerman于1979年最先提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术。1985年，Myers等首次在DGGE中使用“GC夹板”和异源双链技术，使该技术日臻完善。不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分.DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂(尿素和甲酰胺)梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来.一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链行为。含有GC夹子的DNA片段最高的解链区域在GC夹子这一段序列处，它的解链温度很高，可以防止DNA片段在DGGE胶中完全解链。当加了GC夹子后，DNA片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开。
与传统的微生物研究方法相比，PCR-DGGE一大优点是能够快速、准确地鉴定在自然环境及人工环境中的微生物种群，并进行复杂微生物群落结构演替规律、微生物种群动态、基因定位、表达调控的评价分析，无须对所研究的微生物进行纯种培养，这一特性解决了无法对某些难培养的微生物进行研究的难题。PCR-DGGE技术的另一大优点是能快速同时对比分析大量的样品。因此它既可以对比分析不同的微生物群落之间的差异，也可以研究同一个微生物群落随时间和外部环境压力的变化过程。PCR-DGGE技术具有检测极限低、易操作、可重复性强等特点，且PCR-DGGE技术可靠性强、重现性高、方便快捷，已成为微生物群落遗传多样性和动态分析的强有力工具。
酒曲酿酒是中国酿酒的精华所在。白酒以多菌系固态发酵工艺赋予其独特的风格特征，即白酒的生产依赖于原材料在密闭窖池中，多微共酵，形成复杂的白酒成分。白酒风格的形成，从生产技术上分析，原料是前提，大曲是基础，工艺是关键。大曲微生物不仅是窖内发酵产酒的主要菌系来源，而且是白酒风味的重要成因。我国对白酒的研究历史久远，但对大曲、酒醅等微生物群落结构的研究主要集中于传统的分离、培养和初步鉴定。目前认为，利用现有手段，自然界中可培养的微生物仅仅占到微生物总数的0.1％～10％；而且分离培养方法会改变原始菌群的微生态构成，无法分析微生物之间以及微生物与环境之间的相互关系。应用PCR-DGGE分析白酒大曲和酒醅中酵母群落结构对判断和鉴定白酒生产中与特征风味物质相关的关键微生物、指导生产工艺改进，具有重要的理论和实践意义。
发明内容
本发明的目的在于针对现有研究方法存在的问题，提供利用变性梯度电泳分析鉴定白酒大曲和酒醅中酵母群落结构的方法。本发明采用不依赖于培养的分子技术，通过设计常见酿酒微生物中酵母的通用DGGE引物，并通过PCR-DGGE技术分析白酒大曲和酒醅酵母群落结构及优势酿酒用酵母。本方法具有简便、快速、灵敏等特点，结合培养方法可以分离出DGGE测序分析出的优势酵母并进行相关发酵实验，本方法为发现、鉴别白酒大曲和酒醅中酵母群落提供了检测方法，进而为开发不同香型白酒风味定向的酿酒功能微生物提供了参考依据。
本发明的技术方案：利用珠磨法提取白酒大曲或酒醅样品基因组DNA，PCR扩增酵母核糖体中的种特异性DNA片段，DGGE电泳分离不同种属的对应的DNA片段，切胶回收优势微生物对应的条带，再次PCR扩增及连接T载体和阳性克隆的挑选，DGGE电泳重新比对后，进行测序鉴定切胶条带对应的微生物信息。
用变性梯度电泳鉴定白酒大曲或酒醅酵母群落结构的方法，步骤为：
a)选择用于待鉴定的样品——白酒大曲或酒醅，并采用珠磨法提取样品中所有微生物的基因组DNA；
b)选用酵母26S rRNAD1区基因扩增的引物对，并在引物对的正向引物的5’端加上GC发夹结构；引物对为：
NL1-GC：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，
LS2：5’-ATTCCCAAACAACTCGACTC-3’；
c)以步骤a)中的基因组DNA为模板进行PCR扩增；
酵母PCR条件为：用NL1-GC、LS2通用引物进行酵母26S rDNAD1区片段的扩增，25μL反应体系包括2.5μL的10×Buffer，2μL的25mmol/L dNTP混合物，1U Taq DNA聚合酶，每种引物25pmol，DNA模板用量为10ng，双蒸水补足25μL；PCR反应程序：94℃预变性4min；94℃1min、65℃1min、72℃1min进行30个循环；最后72℃延伸10min；
d)将PCR扩增产物在DGGE电泳上进行分离：电泳仪器为Bio-rad公司的Dcode基因突变检测系统；酵母DGGE电泳条件为电压100V，60℃下电泳200min，丙烯酰胺凝胶浓度为8％，变性梯度为10％-50％，由7mol/L尿素和质量浓度40％去离子甲酰胺组成的水溶液作为100％变性剂；
e)染色后将DGGE胶上优势条带进行切胶回收：染色方法为使用1×SYBR-Green染色45min，染色分三次进行；切胶回收方法为：优势条带切割后放入灭过菌的离心管中，加入60μL的灭菌去离子水清洗，后加入60μL的灭菌去离子水并于4℃静置过夜；
f)切胶条带重新PCR扩增后连接T载体、转化入大肠杆菌、挑选阳性克隆；PCR扩增采用的引物与步骤b)所述的引物相同；扩增程序与步骤c)所述的扩增程序相同；
g)重新DGGE比对：使用步骤c)中的PCR产物及步骤f)中挑选阳性克隆对应的PCR产物进行DGGE比对；
h)比对正确的PCR产物对应的阳性克隆子进行测序，测序结果到Genbank上比对；获得白酒大曲或酒醅酵母群落的结构。
步骤a)中的样品为任一种待检测白酒大曲或酒醅样品，样品多点取样后进行混合，混合后的样品重量为5g。
基因组提取方法：采用珠磨方法。5g大曲或酒醅样品用30mL无菌的0.1mol/LPBS缓冲液悬浮，加入三颗玻璃珠，漩涡振荡5min，300×g离心5min，取上清，沉淀用PBS缓冲液重复洗涤3次，离心后收集全部上清；9,000×g离心3min，收集细胞沉淀，用5mL PBS洗3次，重悬于0.2mL的PBS中；取前处理后的样品，9,000×g离心5min，收集沉淀；重悬于1mL buffer Z(10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，150mmol/L NaCl)；混匀后，转移到加有0.3g玻璃珠(直径0.1mm)的螺帽管中，加入150μL苯酚，置于Beadbeater细胞破碎仪上以最大速度击打4min；击打4min后，轻轻混匀后，冰浴10min，每5min轻轻颠倒摇匀；加入150μL氯仿∶异戊醇(24∶1，V/V)溶液，轻轻混匀，15,000×g离心10min，收集上清，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠；用等体积酚、酚∶氯仿和氯仿各抽提一次，15,000×g离心10min，收集上清；2倍体积冰乙醇-20℃沉淀至少2h，15,000×g离心15min，弃上清，沉淀真空冷冻干燥后溶于30μL无菌水中，加入20mg/mL的RNase 3μL消化15min；0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，GeneQuant 100测定DNA浓度，稀释终浓度为10ng/μL，-20℃保存。
本发明的有益效果：本发明通过PCR-DGGE技术分析白酒大曲和酒醅酵母群落结构及优势酿酒用酵母，可广泛应用于析不同工艺(香型)或产地的白酒大曲或酒醅酵母种群结构及同一种白酒大曲或酒醅发酵过程中酵母种群变化规律，为功能酵母的分离提供参考。
附图说明
图1本方法的流程示意图。
图2实施例1的某浓香型白酒大曲DGGE电泳图。1号泳道为曲皮，2号泳道为曲心。
图3实施例2的某清香型酒醅DGGE电泳图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容。
实施例1
采用江苏北部浓香型白酒大曲，同一种大曲分别对曲块中心及表皮进行取样。采用Beadbeater法提取样品中所有微生物的基因组。采用Bio-rad PCR仪进行PCR扩增，酵母PCR条件为：用通用引物进行酵母26S rDNAD1区DNA片段的扩增，引物为：
NL1-GC：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，
LS2：5’-ATTCCCAAACAACTCGACTC-3’；
25μL反应体系包括2.5μL 10×Buffer，2μL 25mmol/L dNTP混合物，1U TaqDNA聚合酶，每种引物25pmol，DNA模板用量约为10ng，双蒸水补足25μL。PCR反应程序：94℃预变性4min；94℃ 1min，65℃1min，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
DGGE条件为：丙烯酰胺凝胶浓度为8％，变性梯度范围为10％-50％(由7mol/L尿素和质量浓度40％去离子甲酰胺组成的水溶液作为100％变性剂)，PCR产物上样量为200ng。在100V、60℃条件下电泳200min。电泳完毕后用SYBRgreen I(1×TAE，1∶10000)染色45min，通过UVI成像系统来成像。实验结果见图2，1号泳道为曲皮，2号泳道为曲心。
将DGGE电泳后的凝胶，置于在凝胶成像仪上，选取相关条带切割后放入灭过菌的离心管中，编号，加入60μL的灭菌去离子水清洗，后加入60μL的灭菌去离子水并于4℃静置过夜。取储存样品液2μL作为PCR反应模板，进行PCR反应。将该PCR产物DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带的亮度，在离心管中加入DNA∶T载体为300∶1mol比例的经纯化回收的DNA与T载体，再加入5μL Solution I，最后加去离子水补充成10μL的反应混合液，稍微震荡。放置在金属浴中，16℃连接16h。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，并进行蓝白斑挑选。选择样品基因组的PCR产物作为参照，DGGE比对阳性克隆子PCR产物的相对位置，淘汰假阳性克隆子。阳性克隆子送往上海生工测序，测序后登陆Genbank进行测序比对。
实施例2
采用清香型白酒酒醅，在发酵瓷缸中分上中下三点取样，取样完成后进行混合。采用Beadbeater法提取样品中所有微生物的基因组。采用Bio-rad PCR仪进行PCR扩增。酵母PCR条件为：用通用引物进行酵母26S rDNAD1区DNA片段的扩增。引物为：
NL1-GC：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，
LS2：5’-ATTCCCAAACAACTCGACTC-3’；
25μL反应体系包括2.5μL 10×Buffer，2μL 25mmol/L dNTP混合物，1U TaqDNA聚合酶，每种引物25pmol，DNA模板用量约为10ng，双蒸水补足25μL。PCR反应程序：94℃预变性4min；94℃1min，65℃1min，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
DGGE条件为：丙烯酰胺凝胶浓度为8％，变性梯度范围为10％-50％(由7mol/L尿素和质量浓度40％去离子甲酰胺组成的水溶液作为100％变性剂)，PCR产物上样量为200ng。100V、60℃条件下电泳200min。电泳完毕后用SYBR greenI(1×TAE，1∶10000)染色45min，通过UVI成像系统来成像。实验结果见图3。
将DGGE电泳后的凝胶，置于在凝胶成像仪上，选取相关条带切割后放入灭过菌的离心管中，编号，加入60μL的灭菌去离子水清洗，后加入60μL的灭菌去离子水并于4℃静置过夜。取储存样品液2μL作为PCR反应模板，进行PCR反应。将该PCR产物DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带的亮度，在离心管中加入DNA∶T载体为300∶1mol比例的经纯化回收的DNA与T载体，再加入5μL Solution I，最后加去离子水补充成10μL的反应混合液，稍微震荡。放置在金属浴中，16℃连接16h。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，并进行蓝白斑挑选。选择样品基因组的PCR产物作为参照，DGGE比对阳性克隆子PCR产物的相对位置，淘汰假阳性克隆子。阳性克隆子送往上海生工测序，测序后登陆Genbank进行测序比对。
序列表
NL1-GC：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，
LS2：5’-ATTCCCAAACAACTCGACTC-3’；

Claims (2)

1、用变性梯度电泳鉴定白酒大曲或酒醅酵母群落结构的方法，其特征是步骤为：
a)选择用于待鉴定的样品——白酒大曲或酒醅，并采用珠磨法提取样品中所有微生物的基因组DNA；
b)选用酵母26S rRNAD1区基因扩增的引物对，并在引物对的正向引物的5’端加上GC发夹结构；引物对为：
NL1-GC：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，
LS2：5’-ATTCCCAAACAACTCGACTC-3’；
c)以步骤a)中的基因组DNA为模板进行PCR扩增；
酵母PCR条件为：用NL1-GC、LS2通用引物进行酵母26S rDNA D1区片段的扩增，25μL反应体系包括2.5μL的10×Buffer，2μL的25mmol/L dNTP混合物，1U Taq DNA聚合酶，每种引物25pmol，DNA模板用量为10ng，双蒸水补足25μL；PCR反应程序：94℃预变性4min；94℃1min、65℃1min、72℃1min进行30个循环；最后72℃延伸10min；
d)将PCR扩增产物在DGGE电泳上进行分离：电泳仪器为Bio-rad公司的Dcode基因突变检测系统；酵母DGGE电泳条件为电压100V，60℃下电泳200min，丙烯酰胺凝胶浓度为8％，变性梯度为10％-50％，由7mol/L尿素和质量浓度40％去离子甲酰胺组成的水溶液作为100％变性剂；
e)染色后将DGGE胶上优势条带进行切胶回收：染色方法为使用1×SYBR-Green染色45min，染色分三次进行；切胶回收方法为：优势条带切割后放入灭过菌的离心管中，加入60μL的灭菌去离子水清洗，后加入60μL的灭菌去离子水并于4℃静置过夜；
f)切胶条带重新PCR扩增后连接T载体、转化入大肠杆菌、挑选阳性克隆；PCR扩增采用的引物与步骤b)所述的引物相同；扩增程序与步骤c)所述的扩增程序相同；
g)重新DGGE比对：使用步骤c)中的PCR产物及步骤f)中挑选阳性克隆对应的PCR产物进行DGGE比对；
h)比对正确的PCR产物对应的阳性克隆子进行测序，测序结果到Genbank上比对；获得白酒大曲或酒醅酵母群落的结构。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤a)中的样品为任一种待检测白酒大曲或酒醅样品，样品多点取样后进行混合，混合后的样品重量为5g。
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