CN104630356A - 一种分析酱油曲醅中未知微生物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分析酱油曲醅中未知微生物的方法。该方法先进行样品的采集，从采集的酱油醅中提取基因组DNA；建立扩增16S rDNA V3可变区的PCR反应体系和反应程序；PCR产物的纯化；对纯化后的PCR产物进行变性梯度凝胶电泳，电泳结束后，用SYBRGREEN染色，用凝胶成像仪拍照；采用Quantity one软件对图谱进行多样性分析和聚类分析；对图谱上的优势条带和差异条带进行切胶回收；对回收条带进行PCR扩增；扩增产物用来做测序分析；所测得的序列经于NCBI上进行Blast比对分析，然后进行同源性分析。本发明以微生物的DNA序列为对象，可明确酱油制曲和发酵过程中微生物群落结构和动力学变化规律。

Description

一种分析酱油曲醅中未知微生物的方法

技术领域

本发明尤其涉及一种微生物的分析方法，特别是涉及一种分析酱油醅中未知微生物的方法；具体是涉及酱油的生产制曲和发酵过程分析并进行监控外来微生物的污染的方法，。属于酱油生产领域。

背景技术

中国传统酱油的生产，制曲及发酵过程都是敞开式的，许多有益的微生物和有害微生物都参与其中，其所起到的好坏作用不清楚，目前通过传统的培养分析方法只了解到其中一部分微生物，还有很多有益或有害微生物仍不清楚。因为传统的微生物学研究方法是借鉴于需要从环境中分离和纯培养微生物，在其形态、生理生化特征和代谢等方面加以分析。然而，自然界中各种微生物都混杂生活在一起，即使很少量的样品也是许多微生物共存的群体，要分离某种微生物，首先须使该微生物处于纯培养状态。现有的方法：稀释涂布平板法、稀释混合平板法或平板划线法是分离和纯化微生物的常规方法，但许多研究已经证实，该方法一般仅能培养和分离出占总数1％的极少数微生物，由于微生物之间复杂的共生关系和培养条件，有多达99％的微生物不能在实验室条件下培养和分离，远远不能满足微生物生态学研究的需要，而且更难以及时有效地跟踪微生物群落结构的变化过程。它最大的缺点是：即使最复杂的实验组合也不能对分离物进行精确的鉴定，而且不能揭示分离物之间的系统发育关系，种属分类的准确性不高，导致微生物资源大量丢失。

发明内容

本发明针对现有传统培养技术存在的问题和酱油发酵过程各种微生物混杂特性，目的在于客服现有技术的缺点，提供一种种属分类的准确性高的分析酱油曲醅中未知微生物的方法。

本发明适用于所有生产工艺的酱油的各个发酵阶段酱油曲醅中微生物群落分析，利用构建的细菌16SrDNA V3区通用引物，建立了酱油曲醅中微生物结构的技术分析体系，具有无需分离培养过程、快速、方便、全面、重复性好等优点。发酵曲料中微生物群落结构和动力学变化规律可以成为传统酿造业改造的突破口，不仅可以深入分析纯种微生物的发酵生产工艺，而且能够深入分析传统酿造中的群体微生物在发酵生产过程所起的作用，分析出影响传统发酵食品的质量问题和安全问题。

本发明目的通过如下技术方案实现：

一种分析酱油曲醅中未知微生物的方法，包括如下步骤：

1)样品的采集：在酱油发酵罐采集样品，在酱油发酵周期分时间段进行采样；

2)从采集的酱油醅中提取基因组DNA；

3)建立扩增16S rDNA V3可变区的PCR反应体系和反应程序，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用GelDoc 2000System凝胶成像仪拍照，分析结果；扩增所用的引物为SEQ.ID.NO1和SEQ.ID.NO2；

4)PCR产物的纯化；

5)对上述纯化后的PCR产物进行变性梯度凝胶电泳，电泳结束后，用SYBR GREEN染色，用凝胶成像仪拍照；

6)采用Quantity one软件对图谱进行多样性分析和聚类分析；

7)对图谱上的优势条带和差异条带进行切胶回收；

8)对回收条带进行PCR扩增，扩增所用的引物为SEQ.ID.NO3和SEQ.ID.NO2；

9)扩增产物用来做测序分析，测序反应所用的引物为SEQ.ID.NO3和SEQ.ID.NO2；

10)所测得的序列经于NCBI上进行Blast比对分析，然后进行同源性分析。

进一步地，所述采集样本的采样位置为发酵罐的中层曲醪和顶层曲醪。

所述采用的时间为发酵的第0天、第15天、第30天、第45天、第60天、第75天和第90天。

所述提取基因组DNA用酱油类DNA提取试剂盒提取酱油醅样品基因组DNA，该方法能较好地去除大豆蛋白，降低盐分和色素的含量。

所述步骤(3)中反应体系组成为：总体积50μl，包括DNA模板6μL，正反引物各1μL，ExTaq Primx(该混合液包括Ex Taq、dNTP Mixture和Ex Taq Buffer)25μl，加ddH₂O至50μl。

所述步骤(3)中PCR的反应程序为降落PCR，预变性94℃4min，前20个循环为：94℃变性1min，65℃退火1min，每个循环后退火温度下降0.5℃，72℃延伸1min；再于恒定退火温度下进行10个循环，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，最后再72℃延伸5min，于4℃保存。

所述步骤(4)采用TaKaRa公司的DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0试剂盒纯化PCR产物。

所述步骤(5)中进行变性梯度凝胶电泳的条件为：采用8％的丙烯酰胺凝胶浓度，上样量为20μL，电压60v，60℃，电泳时间为3.5h。

所述步骤(5)中的染色方法为：将凝胶从玻璃板上剥离，放入1:10000体积比稀释的SYBRGREEN染色缓冲液中，避光染色20分钟。

步骤(8)中反应体系组成为：总体积50μl，包括DNA模板6μL，正反引物各1μL，Ex TaqPrimx(该混合液包括Ex Taq、dNTP Mixture和Ex Taq Buffer)25μl，加ddH₂O至50μl，扩增所用的引物为338F和518R；

步骤(9)中测序反应体系为：Big Dye Seq Buffer(5×)2μL，Big Dye(2.5×)0.5μL，测序模板DNA0.5μL，测序引物(10μM)0.5μL，加ddH₂O至10μL，测序反应所用的引物为338F和518R。

相对于现有技术，本发明具有如下优点：

1)本发明以酱油曲醅为目标物，建立了扩增16S rDNA V3可变区的PCR反应体系和反应程序，确定了变性梯度凝胶电泳的反应条件，最终建立并优化了酱油曲醅中未知微生物群落的检测体系。

2)本发明适用于酱油曲醅中未知微生物群落分析，成本低廉、具可重复性、可直接快速分析的优点，无需分离培养的过程，便可获得微生物群落完整的相关信息。

3)本发明以微生物的DNA序列为对象的分子生物技术，可以大规模地平行处理多种微生物的种群动态变化规律，这是传统研究技术无法比拟的；酱油制曲和发酵过程中微生物群落结构和动力学变化规律可以成为传统酿造业改造的突破口，使我们不仅可以深入研究纯种微生物的发酵生产工艺，而且能够深入研究传统酿造中的群体微生物在发酵生产过程的作用。通过这些研究，分析出影响发酵制品的质量问题和安全问题。

附图说明

图1为16S rDNA目标片段PCR扩增电泳图；

图2为不同发酵时间样品细菌总DNA的DGGE图谱；

图3为不同发酵时期微生物种群多样性聚类分析图。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但实施例不构成对本发明保护范围的限定。

实施例

一种分析酱油曲醅中未知微生物的方法，包括如下步骤：

1、取样品：

由于传统高盐稀态酿造工艺的酱油生产的发酵周期为3个月，因此，共7个采样时间，分别为：发酵0天、15天、30天、45天、60天、75天及90天。采样位置为发酵罐的中层曲醪和顶层曲醪。

2、总DNA提取

无菌条件下分别取不同时间采集的样品10g，加入50mL灭菌双蒸水，摇床振荡60min。4℃，4000g离心15min，取上清于4℃，5000g离心10min，取上清液，于4℃保存。参照酱油类DNA提取试剂盒(购自北京鼎国生物技术有限责任公司)说明提取预处理过的样品，所提取的DNA溶于TE缓冲液，‐20℃条件下保存。

3、PCR‐DGGE引物序列

引物由上海生物工程有限公司合成，序列如下：

SEQ.ID.NO1：引物338F‐GC‐clamp；

SEQ.ID.NO2：引物518R；

SEQ.ID.NO3：引物338F。

PCR引物338F‐GC‐clamp(SEQ.ID.NO1)和引物518R(SEQ.ID.NO2)是用来扩增16S rDNA V3可变区，引物338F(SEQ.ID.NO3)和引物518R(SEQ.ID.NO2)是用来扩增DGGE电泳后切胶回收的产物，同时也作为测序反应的引物。

4、16S rDNA V3片段的扩增

50μl的PCR反应体系如下：25μl的Premix Taq(TaKaRa公司)，模板DNA 5μl，338F‐GC‐clamp(SEQ.ID.NO1)和引物518R(SEQ.ID.NO2)分别作为正、反引物，正反引物(20μM)各1μl，适量的灭菌双蒸水补足50μl。

PCR反应程序：PCR反应采用touchdown降落PCR，即：预变性条件为94℃，5min，前20个循环为94℃1min，65℃1min(每个循环后退火温度下降0.5℃)和72℃1min；再于恒定退火温度下进行10个循环(94℃1min，55℃1min，72℃1min)，最后再72℃延伸10min，于4℃保存。

用1.5％(W/V)琼脂糖凝胶(含有1.5μg/mL Gene View染料)电泳检测PCR产物，点样量6μL，用GelDoc 2000System凝胶成像仪拍照，分析结果，见图1。

由于所设计引物扩增的目的长度应为230bp左右，由图1可见，PCR产物效果理想，并且无拖尾现象及引物二聚体出现，与Marker条带对比，可知产物浓度能够满足DGGE电泳的加样要求。图1中，M：DL2000Marker；1#：成曲；2#：发酵15天；3#：发酵30天；4#：发酵45天；5#：发酵60天；6#：发酵75天；7#：发酵90天。

5、PCR产物的纯化

采用TaKaRa公司的DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0试剂盒纯化PCR产物。

6、变性梯度凝胶电泳及图谱分析

对上述纯化后的PCR产物进行变性梯度凝胶电泳。DGGE采用Biorad DCode ApparatusDGGE电泳仪，8％聚丙烯酰胺凝胶电泳。变性梯度范围15％‐55％(100％变性剂含有7mol/L尿素和质量百分含量40％的去离子甲酰胺)，在1×TAE缓冲液中200V电泳240min。经SYBRGreen I(Invitrogen公司)染色后用凝胶成像系统照相。不同发酵时间所提取的基因组DNA经变性梯度凝胶电泳后的DGGE图谱，如图2所示。图2中，1#：成曲；2#：发酵15天；3#：发酵30天；4#：发酵45天；5#：发酵60天；6#：发酵75天；7#：发酵90天。由图2可知，成曲(发酵0天)表现的细菌多样性最复杂，这与细菌的生长环境有关，发酵15天到发酵90天的样品的细菌多样性明显少于成曲。从同一迁移位置的条带来分析，发现有的条带进入发酵期后明显较暗，有的甚至逐渐消失，这是由于发酵期间，微生物处于高盐生长环境，而且随着发酵时间的增长，暴晒时间也就越长，从而使发酵缸内处于高温状态，大多数菌不适应此类生长条件而死亡，由此可见酱油生产的发酵条件具有抑制微生物生长的作用。

7、利用Quantity One软件对不同发酵时间样品细菌总DNA的DGGE图谱进行多样性分析和聚类分析，根据电泳条带的数量，质量及迁移率进行聚类分析，得到结果如图3所示。由图3可知，成曲的微生物与发酵期间的微生物相似性较低，而到发酵45天后，5号、6号和7号样品的微生物相似性高达90％以上，这说明在发酵后期，发酵缸内的微生物群落变化不大，而成曲样品的多数微生物进入发酵罐后由于环境的盐分过高生长受抑制而死亡。

8、DNA的回收测序

无菌条件下切下DGGE胶上的9条特异性条带(图2标示)，置于40μL无菌双蒸水中4℃过夜。取2μL模板DNA进行PCR扩增(PCR扩增条件同步骤4，引物为338F和518R)。PCR产物经DGGE证明于所割条带迁移位置相同时，再割胶回收，用338F和518R为引物再次扩增，扩增产物经纯化及琼脂糖凝胶电泳检验后用于测序。

在NCBI上用BLAST软件在GenBank中与参考序列进行相似性比对，然后采用Clustal X1.83软件及MEGA 4.0进行同源性分析。分析结果如表1所示，细菌相似性均达95％以上。本实施例选取了部分特异性条件进行种属分析，但结合图2及表1分析，仍可表明：微生物在酱油发酵生产期间具有显著的差异性及动态演替过程。在成曲时期微生物具有较高的多样性，Weissella cibaria(魏斯菌属)，Weissella paramesenteroides(类肠膜魏斯氏菌)，UnculturedEnterobacter sp(不可培养的肠杆菌属)，Citrobacter freundii(弗氏柠檬酸杆菌)，Enterobactersp.BF1‐8(肠杆菌属)，Enterobacter aerogenes(产气肠杆菌)均被检出，这证明了DGGE技术用于分析微生物多样性方面的优越性。a，b，c三条带均检出为Weissella cibaria(魏斯菌属)，这可能是由于该菌种的含量主导优势过大，而且存在于整个发酵周期，而造成电泳过程产生的部分拖尾现象。d，h，g条带分别为Weissella paramesenteroides(类肠膜魏斯氏菌)，Enterobacter sp.BF1‐8(肠杆菌属)和Citrobacter freundii(弗氏柠檬酸杆菌)，f和i条带分别为Uncultured Enterobacter sp(不可培养的肠杆菌属)及Enterobacter aerogenes(产气肠杆菌)。

表1 DGGE特异性条带序列分析结果

本发明利用分子生物学技术，利用构建的细菌16SrDNA V3区通用引物，运用变性梯度凝胶电泳技术分析酱油发酵过程不同发酵时期酱油曲醅中的微生物菌落结构，克服了部分微生物由于不可分离培养造成的难以直接分析研究的难题，有助于发现酱油发酵过程更完整的微生物种群信息，因此具有非常广泛的应用前景。

Claims (9)

1.一种分析酱油曲醅中未知微生物的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)样品的采集：在酱油发酵罐采集样品，在酱油发酵周期分时间段进行采样；

2)从采集的酱油醅中提取基因组DNA；

3)建立扩增16S rDNA V3可变区的PCR反应体系和反应程序，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用GelDoc 2000 System凝胶成像仪拍照，分析结果；扩增所用的引物为SEQ.ID.NO1和SEQ.ID.NO2；

4)PCR产物的纯化；

5)对纯化后的PCR产物进行变性梯度凝胶电泳，电泳结束后，用SYBR GREEN染色，用凝胶成像仪拍照；

6)采用Quantity one软件对图谱进行多样性分析和聚类分析；

7)对图谱上的优势条带和差异条带进行切胶回收；

8)对回收条带进行PCR扩增，扩增所用的引物为SEQ.ID.NO3和SEQ.ID.NO2；

9)扩增产物用来做测序分析，测序反应所用的引物为SEQ.ID.NO3和SEQ.ID.NO2；

10)所测得的序列经于NCBI上进行Blast比对分析，然后进行同源性分析。

2.根据权利要求1所述的分析酱油曲醅中未知微生物的方法，其特征在于，所述采集样本的采样位置为发酵罐的中层曲醪和顶层曲醪。

3.根据权利要求1所述的分析酱油曲醅中未知微生物的方法，其特征在于，所述采用的时间为发酵的第0天、第15天、第30天、第45天、第60天、第75天和第90天。

4.根据权利要求1所述的分析酱油曲醅中未知微生物的方法，其特征在于，所述提取基因组DNA用酱油类DNA提取试剂盒提取酱油醅样品基因组DNA。

5.根据权利要求1所述的分析酱油曲醅中未知微生物的方法，其特征在于，所述步骤(3)中反应体系组成为：总体积50μl，包括DNA模板6μL，正反引物各1μL，Ex Taq Primx(该混合液包括Ex Taq、dNTP Mixture和Ex Taq Buffer)25μl，加ddH₂O至50μl。

6.根据权利要求1所述的分析酱油曲醅中未知微生物的方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR的反应程序为降落PCR，预变性94℃4min，前20个循环为：94℃变性1min，65℃退火1min，每个循环后退火温度下降0.5℃，72℃延伸1min；再于恒定退火温度下进行10个循环，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，最后再72℃延伸5min，于4℃保存。

7.根据权利要求1所述的分析酱油曲醅中未知微生物的方法，其特征在于，所述步骤(4)采用TaKaRa公司的DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0试剂盒纯化PCR产物。

8.根据权利要求1所述的分析酱油曲醅中未知微生物的方法，其特征在于，所述步骤(5)中进行变性梯度凝胶电泳的条件为：采用8％的丙烯酰胺凝胶浓度，上样量为20μL，电压60v，60℃，电泳时间为3.5h。

9.根据权利要求1所述的分析酱油曲醅中未知微生物的方法，其特征在于，所述步骤(5)中的染色方法为：将凝胶从玻璃板上剥离，放入1:10000体积比稀释的SYBR GREEN染色缓冲液中，避光染色20分钟。