CN106811538A - 一种虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的pcr‑dgge分析方法 - Google Patents

一种虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的pcr‑dgge分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术工程领域，具体涉及一种虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR‑DGGE分析方法。该方法按以下步骤进行：虾仁样品的预处理及菌体收集；虾仁样品中微生物总DNA的提取；以提取的微生物的总DNA为模板，进行16SrRNA的PCR扩增；将PCR产物在进行DGGE电泳分析，电泳结束后染色、扫描仪成像，在PCR‑DGGE图谱上标记特异性条带，切胶回收，最后在NCBI数据库进行Blast比对，获得虾仁低温贮藏过程中细菌多样性以及特定腐败菌的信息。该方法可以用于虾仁保鲜或者低温贮藏过程中主要菌群尤其是特定腐败菌群的分析，可避免传统分离培养的耗时大，工作繁重，操作繁琐，实现对虾仁样品中菌群总DNA的高效提取、有效扩增以及菌群微生态及特定腐败菌准确分析。

Description

一种虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法
技术领域
本发明涉及生物技术工程领域，具体涉及一种虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法。
背景技术
虾仁的腐败不仅是虾仁本身的理化变化所致，更是腐败菌增殖的结果。不同的水产食品具有不同微生物生态类群，其独特的菌相构成取决于食品加工所使用的原料、加工参数和产品的贮藏条件等。在贮藏期内的微生物菌相往往不是固定的，这是因为在特定的贮藏环境中，微生物具有的忍耐力不同。前人对食品的微生物腐败进行了大量系统的研究，逐步认识到，虽然食品在加工流通过程中会受到多种细菌的侵染，但最终只有少部分细菌大量增殖，在腐败中占据主导地位，并且产生腐败代谢物(臭味、异味、颜色等)，这些菌被称之为特定腐败菌(Specific spoilage organisms SSO)。对于新鲜或者初加工的虾仁，SSO不仅数量少，而且所占总微生物的比例也非常小，但由于其对贮藏环境的忍耐力强，能够在特定的环境下快速增殖，并在贮藏期中产生代谢产物，到感官拒绝点时，SSO的数量得到了大量的积累，所占比例也大幅增加，与此同时代谢产物也有了迅速增加和积累，导致了虾仁的感官不可接受及其腐败变质的发生。不同的原料、加工工艺、包装、运输方式等会导致食品微生态系统的不同，所以特定腐败菌也会不同，因此必须针对不同产品进行微生物的菌相分析。
人们对食品贮藏过程中的细菌的研究，多采用传统的分离、纯化和鉴定方法，不仅繁杂耗时，而且受培养条件的影响，所用分离培养基不能满足所有细菌的营养需求，仅有很少一部分细菌能被分离到。因此传统培养方法不能全面反映食品贮藏过程中细菌的多样性与特定腐败菌的真实情况，结果准确性及可靠性差。
PCR-DGGE(PCR-denatured gradient gel electrophoresis)技术是基于微生物基因所包含的序列不同而对微生物的多态性进行分析，可对整个菌群多样性实现动态分析，并可同时检测多个样品，还可对不同样品进行比较，因而有利于研究不同来源样品中细菌菌群多样性的动态观察。
发明内容
为解决传统培养方法不能全面、准确反映虾仁低温贮藏过程中的细菌的种群结构、细菌多样性与特定腐败菌的问题，本发明提供了一种虾仁贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法。
本发明提供一种虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，按以下步骤进行：
(1)、虾仁样品的预处理及菌体收集；
(2)、提取虾仁样品中微生物总DNA；
(3)、以提取的微生物总DNA为模板，进行细菌16S rRNA的PCR扩增，并检测；
(4)、将PCR产物进行DGGE电泳分析；电泳结束后染色、扫描仪成像，得到DGGE图谱，在图谱上标记特异条带，切胶回收；
(5)、回收的DNA条带重新进行PCR扩增，然后测序，将测得的序列结果在NCBI数据库进行Blast同源性比对分析，确定细菌的归属，然后根据在DGGE图谱上标记的条带情况与鉴定出的细菌种类进行分析。
进一步地，所述虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，按以下步骤进行：
(1)、虾仁样品的预处理及菌体收集；
(2)、采用细菌微生物DNA提取液进行虾仁样品中微生物总DNA的快速提取；
(3)、以提取的微生物总DNA为模板，采用16S rRNA基因V3高变区F357-GC和R518区具有特异性的引物对，进行细菌16S rRNA的PCR扩增，将PCR反应的产物用琼脂糖凝胶电泳检测；
(4)、将PCR产物进行DGGE电泳分析；电泳结束后染色、扫描仪成像，得到DGGE图谱，在图谱上标记特异条带，切胶回收；
(5)、回收的DNA条带重新进行PCR扩增，然后对产物进行测序，将测得的序列结果在NCBI数据库进行Blast同源性比对分析，确定细菌的归属，然后根据在DGGE图谱上标记的条带情况与鉴定出的细菌种类进行分析。
进一步地，所述虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步骤(1)的具体操作为：样品为南美白对虾，从养殖塘捕捞后放入水泥池充气暂养一个晚上，捕捞打包并且冰藏后运到实验室的无菌室，无菌操作去壳与肠腺；称取10g虾仁加入到90mL PBS缓冲液中，均质器均质1min，200目绢布过滤，取滤液1000rpm离心10min，去沉淀，上清液10000rpm离心5min，收集菌体重悬浮于TE中，-20℃保存备用。
进一步地，所述虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步骤(2)中所述细菌微生物DNA提取液的组成为：9g NaCl，0.1g SDS(十二烷基硫酸钠)，1mLβ-硫基乙醇，1000mL去离子水。
进一步地，所述虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步骤(2)中所述DNA的快速提取方法为：取样品菌悬液离心后，倒去上清，加入提取液涡旋，沸水浴加热，再次离心，上清液即为DNA溶液。
进一步地，所述虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步骤(2)中所述DNA的快速提取方法为：取样品菌悬液1mL，15000rpm离心1min，倒去上清，加入50μL提取液涡旋混匀，沸水浴加热2min，15000rpm再次离心1min，上清液即为DNA溶液。
进一步地，所述虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步骤(3)中将PCR反应的产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
进一步地，所述虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步骤(3)中引物对F357-GC和R518为：
进一步地，所述虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步骤(3)中反应体系为50μl总体积，ddH2O 41.25μl，10×Buffer(含2.0mM MgCl2)5μl，dNTP(10mM)1μl，F357-GC(10μM)1μl，R518(10μM)1μl，Taq酶(5U/μl)0.25μl，模板DNA 0.5μl。
进一步地，所述虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步骤(3)中反应程序为：94℃4min预变性；94℃0.5min；56℃1min；72℃0.5min；30Cycles，72℃延伸7min；取PCR产物各3μl，1.5％琼脂糖凝胶电泳，1×TAE缓冲液，120V稳压电泳30min，凝胶成像仪拍照。
进一步地，所述虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步骤(4)的具体操作为：
取样品各400ng的V3区PCR产物，采用D-Code突变检测系统对样品进行DGGE分析；所用的聚丙烯酰胺凝胶浓度为8％(丙稀酰胺：双丙稀酰胺＝37.5︰1)，变性剂浓度从30％～60％(100％的变性剂为7mol/L尿素，40％甲酰胺)；在60V电压下，60℃恒温，1×TAE中电泳16.0h；电泳完毕后，用超纯水冲洗胶，然后将胶放进含EB的染液中，置于摇床上染色30min，并立即进行拍照和切胶用于条带分析；选取较有代表性(条带清晰)的条带，用洁净的手术刀片将目标DGGE条带完整的切下并装入1.5ml离心管中，用上海生物工程公司的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒SK8131方法回收，备用。
进一步地，所述虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步骤(4)中所述电泳仪器为Dcode的基因突变检测系统，电泳条件为电压60V，60℃恒温，电泳16.0h；变性梯度为30％～60％。
本方法的积极效果是能全面准确的反映虾仁低温贮藏过程中细菌的种群结构、细菌多样性与特异性。与纯培养方法相比较，该方法具有操作简便、快速、重复性好等优势，在快速的同时还能比对分析大量样品，可以对比分析同一种虾仁不同贮藏温度以及同一贮藏温度不同贮藏时间段的细菌群落差异，还能对比分析研究不同贮藏阶段的特定腐败菌及细菌群落差异。采用DGGE分析可以检测到菌群中相对含量1％以上的菌，并可对微生物图谱进行分析。
附图说明
图1为虾仁样品在-20℃贮藏过程中PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为虾仁样品在-20℃贮藏下细菌总DNA的PCR-DGGE图谱。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面具体讲述本发明的具体实施步骤：
1、虾仁样品的预处理：
样品为舟山市浙江华兴水产科技有限公司养殖的南美白对虾，从养殖塘捕捞后放入水泥池充气暂养一个晚上(为了排掉肠道内的粪便)，捕捞打包并且冰藏后运到实验室的无菌室，无菌操作去壳与肠腺，称取10g虾仁加入到90mLPBS缓冲液中，均质器均质1min，200目绢布过滤，取滤液1000rpm离心10min，去沉淀，清液10000rpm离心5min,收集菌体重悬浮于TE中，-20℃保存备用；其余虾仁按照每份10g分装-20℃贮藏，间隔一定时间后按照上述步骤操作进行预处理后进行细菌DNA的提取。
2、虾仁样品中微生物总DNA的提取：
采用自制的细菌微生物DNA提取液，其配方为：9g NaCl，0.1gSDS，1mLβ-硫基乙醇，1000mL去离子水。DNA的快速提取方法为：取样品菌悬液1mL，15000rpm离心1min，倒去上清，加入50μL提取液涡旋混匀，沸水浴加热2min，15000rpm离心1min，上清液即为DNA溶液。该方法特征在于：DNA提取的步骤中所提取的DNA无需进一步纯化，可以直接用于后续的PCR扩增。
3、PCR扩增：
所用引物为细菌16S rDNA V3高变区F357-GC和R518(见表1)，反应体系为50μl总体积，ddH2O 41.25μl，10×Buffer(含2.0mM MgCl2)5μl，dNTP(10mM)1μl，F357-GC(10μM)1μl，R518(10μM)1μl，Taq酶(5U/μl)0.25μl，模板DNA 0.5μl。PCR扩增反应程序：94℃4min预变性；94℃0.5min；56℃1min；72℃0.5min；30Cycles，72℃延伸7min。取PCR产物各3μl，1.5％琼脂糖凝胶电泳，1×TAE缓冲液，120V稳压电泳30min，凝胶成像仪拍照。
表1：16S rDNA V3高变区PCR所用引物
4、PCR-DGGE分析及切胶回收：
取样品各400ng的V3区PCR产物，采用D-Code突变检测系统对样品进行DGGE分析。所用的聚丙烯酰胺凝胶浓度为8％(丙稀酰胺：双丙稀酰胺＝37.5︰1)，变性剂浓度从30％～60％(100％的变性剂为7mol/L尿素，40％甲酰胺)。在60V电压下，60℃恒温，1×TAE中电泳16.0h。电泳完毕后，用超纯水冲洗胶，然后将胶放进含EB的染液中，置于摇床上染色30min，并立即进行拍照和切胶，用于条带分析。选取较有代表性(条带清晰)的条带，用洁净的手术刀片将目标DGGE条带完整的切下并装入1.5ml离心管中，用上海生物工程公司的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒SK8131方法回收，备用。
5、PCR扩增与克隆测序
回收的DNA条带需重新进行PCR扩增，扩增引物为表1中去掉GC夹子的引物，然后将再次扩增的PCR产物送去上海生物工程有限公司进行克隆测序。将测得的序列在NCBI数据库进行Blast比对，确定细菌的归属，并登陆NCBI数据库进行Blast同源性比对，比对结果说明虾仁在-20℃贮藏过程中芽孢杆菌属是其特异性腐败菌，具体比对结果见表2。
表2.DGGE图谱分离细菌V3区序列相似性比较结果
从上表中可以看出芽胞杆菌、摩根(氏)菌属、不动细菌属、寡养食单胞菌是虾仁冻藏过程中的特异性腐败菌。
本实例是为便于阅读者更好理解本发明的内容，提供的一种具体实施方案，而非限制本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，按以下步骤进行：
(1)、虾仁样品的预处理及菌体收集；
(2)、提取虾仁样品中微生物总DNA；
(3)、以提取的微生物总DNA为模板，进行细菌16S rRNA的PCR扩增，并检测；
(4)、将PCR产物进行DGGE电泳分析；电泳结束后染色、扫描仪成像，得到DGGE图谱，在图谱上标记特异条带，切胶回收；
(5)、回收的DNA条带重新进行PCR扩增，然后测序，将测得的序列结果在NCBI数据库进行Blast同源性比对分析，确定细菌的归属，然后根据在DGGE图谱上标记的条带情况与鉴定出的细菌种类进行分析。
2.根据权利要求1所述的虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，按以下步骤进行：
(1)、虾仁样品的预处理及菌体收集；
(2)、采用细菌微生物DNA提取液进行虾仁样品中微生物总DNA的快速提取；
(3)、以提取的微生物总DNA为模板，采用16S rRNA基因V3高变区F357-GC和R518区具有特异性的引物对，进行细菌16S rRNA的PCR扩增，将PCR反应的产物用琼脂糖凝胶电泳检测；
(4)、将PCR产物进行DGGE电泳分析；电泳结束后染色、扫描仪成像，得到DGGE图谱，在图谱上标记特异条带，切胶回收；
(5)、回收的DNA条带重新进行PCR扩增，然后对产物进行测序，将测得的序列结果在NCBI数据库进行Blast同源性比对分析，确定细菌的归属，然后根据在DGGE图谱上标记的条带情况与鉴定出的细菌种类进行分析。
3.根据权利要求2所述的虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步骤(1)的具体操作为：样品为南美白对虾，从养殖塘捕捞后放入水泥池充气暂养一个晚上，捕捞打包并且冰藏后运到实验室的无菌室，无菌操作去壳与肠腺；称取10g虾仁加入到90mL PBS缓冲液中，均质器均质1min，200目绢布过滤，取滤液1000rpm离心10min，去沉淀，上清液10000rpm离心5min，收集菌体重悬浮于TE中，-20℃保存备用。
4.根据权利要求2所述的虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步骤(2)中所述细菌微生物DNA提取液的组成为：9g NaCl，0.1g SDS(十二烷基硫酸钠)，1mLβ-硫基乙醇，1000mL去离子水。
5.根据权利要求2所述的虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步骤(2)中所述DNA的快速提取方法为：取样品菌悬液1mL，15000rpm离心1min，倒去上清，加入50μL提取液涡旋混匀，沸水浴加热2min，15000rpm再次离心1min，上清液即为DNA溶液。
6.根据权利要求2所述的虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步骤(3)中引物对F357-GC和R518为：
7.根据权利要求2所述的虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步骤(3)中反应体系为50μl总体积，ddH2O 41.25μl，10×含2.0mM MgCl2的Buffer 5μl，10mM的dNTP 1μl，10μM的F357-GC 1μl，10μM的R518 1μl，5U/μl的Taq酶0.25μl，模板DNA0.5μl。
8.根据权利要求2所述的虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步骤(3)中反应程序为：94℃4min预变性；94℃0.5min；56℃1min；72℃0.5min；30Cycles，72℃延伸7min；取PCR产物各3μl，1.5％琼脂糖凝胶电泳，1×TAE缓冲液，120V稳压电泳30min，凝胶成像仪拍照。
9.根据权利要求2所述的虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步骤(4)的具体操作为：
取样品各400ng的V3区PCR产物，采用D-Code突变检测系统对样品进行DGGE分析；所用的聚丙烯酰胺凝胶浓度为8％，其中丙稀酰胺：双丙稀酰胺＝37.5︰1，变性剂浓度从30％～60％，其中100％的变性剂为7mol/L尿素，40％甲酰胺；在60V电压下，60℃恒温，1×TAE中电泳16.0h；电泳完毕后，用超纯水冲洗胶，然后将胶放进含EB的染液中，置于摇床上染色30min，并立即进行拍照和切胶用于条带分析；选取清晰的条带，用洁净的手术刀片将目标DGGE条带完整的切下并装入1.5ml离心管中，用柱式DNA胶回收试剂盒SK8131方法回收，备用。
10.根据权利要求2所述的虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步骤(4)中所述电泳仪器为Dcode的基因突变检测系统，电泳条件为电压60V，60℃恒温，电泳16.0h；变性梯度为30％～60％。
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