CN107523625A

CN107523625A - 多微固态发酵中产乙醇和产乳酸关键微生物的定量分析方法

Info

Publication number: CN107523625A
Application number: CN201710855043.1A
Authority: CN
Inventors: 杨帆; 晏培; 汪地强; 方芳; 陈坚; 王莉
Original assignee: Kweichow Moutai Co Ltd
Current assignee: Kweichow Moutai Co Ltd
Priority date: 2017-09-20
Filing date: 2017-09-20
Publication date: 2017-12-29
Anticipated expiration: 2037-09-20
Also published as: CN107523625B

Abstract

本发明涉及白酒酿造技术领域，具体涉及多微固态发酵中产乙醇和产乳酸关键微生物的定量分析方法。本发明采用特异性的引物对酿酒酵母的HIS3基因，粟酒裂殖酵母的AHD1基因，乳酸菌的16SrRNA片段进行定量PCR分析，以分析大曲和酒醅中酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌的变化趋势，用来预测酒精产量。本发明的方法具有检测速度快，灵敏度高，准确性好，特异性好，免培养优点。

Description

多微固态发酵中产乙醇和产乳酸关键微生物的定量分析方法

技术领域

本发明属于酿酒技术领域，具体涉及白酒生产企业中的多微固态发酵中产乙醇和产乳酸关键微生物的定量分析方法。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)是酱香型白酒生产过程中主要的两种产酒酵母，乳酸菌(包括乳球菌属、乳杆菌属、戊糖片球菌属和魏斯式属)是酱香型白酒生产中的一类主要产乳酸微生物，这些微生物存在于白酒生产的空气、凉堂、大曲中，并且随着酒醅的摊凉、拌曲和堆积发酵，富集在酒醅中。因此，酒醅中酿酒酵母、粟酒裂殖酵和乳酸菌数量的多少，在酱香型白酒的风味形成及产量稳定上起着重要作用。

目前，对酒醅中酿酒酵母、粟酒裂殖酵和乳酸菌数量的检测方法是平板培养法。该方法虽然简单、经济，但劳动强度大、传统培养生长缓慢(48小时以上)，而且有大部分乳酸菌很难用传统方法培养。因此建立快速检测酒醅中酿酒酵母、粟酒裂殖酵和乳酸菌数量的检测方法势在必行。荧光定量PCR技术具有快速、高灵敏性、特异性和精确性的特点。目前该技术已广泛应用于食源性微生物检测领域。然而，迄今国内还未见于利用荧光定量PCR方法检测酒醅中酿酒酵母、粟酒裂殖酵和乳酸菌的报道。

发明内容

本发明的目的在于，在白酒生产工艺中，解决上述技术中存在的问题，快速、精确、特异性地检测酒醅中的酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌。

本发明的目的通过以下技术手段实现：

一方面，本发明提供了一种多微固态发酵中产乙醇和产乳酸关键微生物的定量分析方法。

所述的多微固态发酵具体指的是酒醅发酵；所述产乙醇的关键微生物为酿酒酵母、粟酒裂殖酵母；所述的产乳酸关键微生物为乳酸菌。

该方法利用酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌保守性DNA序列(特异性片段)设计引物；然后使用该引物对待测基因组DNA进行荧光定量PCR扩增和检测。该方法具有快速、高灵敏性、特异性和精确性的特点。

其中，所述的酿酒酵母的特异性片段为HIS3；

所述粟酒裂殖酵母的特异性片段为ADH1；

所述乳酸菌特异性片段为16SrRNA。

现有技术中酿酒酵母和粟酒裂殖酵母常用于定量PCR的保守序列有26SrRNAD1、D2区、18SrRNA基因、5SrRNA基因、ITS、GAP基因，以及乳酸菌16SrRNA，然而，经发明人实验发现，对于酒醅和大曲中的酿酒酵母和粟酒裂殖酵母，这些现有研究中的保守位点都不太适于用于定量这三种菌的定量分析。

经发明人多次摸索实验，发现酿酒酵母HIS3基因和粟酒裂殖酵母的ADH1以及乳酸菌16SrRNA基因更加适合于酒醅和大曲的实时定量。

作为优选的实施方式，定量PCR时，采用的引物对如下：

扩增酿酒酵母的引物对如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

扩增粟酒裂殖酵母的引物对如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

扩增乳酸菌的引物对如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

本发明的设计的引物扩增稳定，扩增结果清晰，重复性好，灵敏度高，稳定性好，特异性好。

本发明中，扩增酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸菌可以在同一反应体系内进行多重定量PCR，也可以在不同的体系中进行对三种微生物分别进行定量PCR。

进一步，所述的方法具体包含以下步骤：

(1)、提取基因组DNA：利用核酸提取仪震荡破碎细胞，结合膜过滤纯化的方法提取酒醅中微生物总基因组DNA；

(2)、扩增：采用酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌的特异性引物，以酒醅微生物总基因组DNA为模板，对酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌的特异性片段进行特异性扩增；

(3)、定量分析：通过标准曲线和待测样品的CT值对酒醅中酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌进行定量分析。

其中，步骤(2)中，作为优选的实施方式，扩增时，定量PCR反应程序为：95℃预变性30s，进入40个循环，95℃5s，55℃30s，溶解曲线：95℃5s，60℃1min，95℃5s 1个循环。该反应程序可以同时扩增酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌的特异性片段。

作为优选的实施方式，本发明的方法采用绝对定量PCR。绝对定量PCR还包括标准曲线的制备。具体的，标准曲线制备的方法为：分别对酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸菌的保守序列进行PCR扩增，得到特异性目的片段，将目的片段与质粒载体连接，获得重组质粒，再将质粒转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆转化子，提取得到高浓度质粒，将此质粒做10倍比稀释，作为荧光定量PCR的标准样品，从而进行荧光定量PCR获得标准曲线。作为优选的实施方式，制作标标曲时，荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性30s，进入40个循环，95℃5s，55℃30s，溶解曲线：95℃5s，60℃1min，95℃5s 1个循环。

另一方面，本发明还提供了一种多微固态发酵中产乙醇和产乳酸关键微生物的定量检测引物，其至少含有以下引物对中的一对：

如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的扩增酿酒酵母特异性片段的引物对；

如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的扩增粟酒裂殖酵母特异性片段的引物对；

如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的扩增乳酸菌特异性片段的引物对；

另一方面，本发明还提供了一种多微固态发酵中产乙醇和产乳酸关键微生物的检测试剂盒，其至少含有以下引物对中的至少一条或至少一对：

如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示扩增酿酒酵母的特异性引物对；

如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示扩增粟酒裂殖酵母的特异性引物对；

如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示扩增乳酸菌的特异性引物对。

另一方面，本发明还提供了一种微固态发酵中产乙醇和产乳酸关键微生物检测芯片，其至少含有以下引物对中的一对：

如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示扩增酿酒酵母的特异性引物对；

如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示扩增乳酸菌的特异性引物对。

作为一种优选的实施方式，本发明中，所述的酿酒酵母特异性片段HIS3的序列如SEQ ID NO.7所示；所述粟酒裂殖酵母特异性片段为ADH1的序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明取得的有益效果：

(1)本发明首次以酿酒酵母的保守性DNA序列HIS3，粟酒裂殖酵母的保守性DNA序列ADH1，乳酸菌保守性DNA序列16SrRNA为特异性检测位点，用于测定酒醅中酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌的含量。其相对于现有技术中的检测位点具有更高的特异性。

(2)本发明的设计的引物扩增稳定，扩增结果清晰，重复性好，灵敏度高，稳定性好，特异性好。

(3)本发明的扩增反应程序可同时适用于三种微生物特异性片段的扩增。

(4)本发明的方法与传统微生物平板培养法比较，具有快速、高灵敏性、特异性和精确性的特点。

具体的，步骤①和③中的荧光定量PCR体系：总体积20μL，体系包括10μL SYBRGreen，6.4μL无菌去离子水，0.8μL 10μmol/L引物(正向、反向)，2μL DNA模板。

具体的，步骤①和③中的荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性30s，进入40个循环，95℃5s，55℃30s，溶解曲线：95℃5s，60℃1min，95℃5s 1个循环。

附图说明

图1为实施例3中酿酒酵母、粟酒裂殖酵和乳酸菌的荧光定量PCR扩增曲线；

图2为实施例3中酿酒酵母、粟酒裂殖酵和乳酸菌的荧光定量PCR溶解曲线；

图3为酿酒酵母荧光定量PCR标准曲线；

图4为粟酒裂殖酵母荧光定量PCR标准曲线；

图5为乳酸菌荧光定量PCR标准曲线。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

在本发明中，荧光定量PCR采用TaKaRa专用定量PCR试剂Premix ExTaq^TMII预混液，该预混液能抑制非特异性反应，可以在宽广的范围内进行更加准确的定量，可以进行重复性好、可信度高的Real Time PCR解析。

实施例1酒醅中微生物基因组DNA提取

称取7.5g酒醅样品于50ml离心管，加入20ml核酸提取缓冲液(2％CTAB(w/v)，100mM Tris-HCl(pH 8.0)，20mM EDTA(PH8.0),1.4M NaCl)，20g无菌石英砂，核酸提取仪震荡1min，10000rpm离心10min；上清液加等体积P:C:I(苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)，11000rpm离心20min；上清液加2倍体积硅胶膜结合液(4M盐酸胍，0.5M乙酸钾)，吸附柱过滤，弃滤液；吸附柱自然条件下干燥1h，加入300μL无菌水溶解DNA，过滤，滤液装于1.5mL无菌离心管中，-20℃保存备用。

实施例2标准曲线构建

1.合成针对于酿酒酵母HIS3、粟酒裂殖酵母ADH1和乳酸菌16SrRNA的特异性引物

酿酒酵母特异性引物序列(5′—3′):

SEQ ID NO.1

S.cere-F：GGGCTGGAAGATCGGTGACTAC

SEQ ID NO.2

S.cere-R：AGCGTGAGGACAGTTGGATTCG

粟酒裂殖酵母特异性引物序列(5′—3′):

SEQ ID NO.3

S.pombe-F:CGAGACGAGACGAGACGAGATG

SEQ ID NO.4

S.pombe-R：CGACAAACGGCACACCAAACG

乳酸菌特异性引物序列(5′—3′):

SEQ ID NO.5

Lac.16s-F：AGAACACCAGTGGCGAAGG

SEQ ID NO.6

Lac.16s-R：CAGGCGGAGTGCTTAATGC

2.得到特异性扩增目的片段

分别以酿酒酵母、粟酒裂殖酵母的纯菌DNA和酒醅总DNA为模板，以S.cere-F/S.cere-R、S.pombe-F/S.pombe-R、Lac.16s–F/Lac.16s-R为引物进行PCR扩增，PCR扩增体系：总体积25μL，体系包括2.5μL Buffer，2μL dNTP，0.2μL Taq DNA聚合酶，1μL 10μmol/L引物(正向、反向)，1μLDNA模板，用ddH₂O补足至25μL。

PCR反应程序为：95℃预变性4min后，进入30个循环，95℃1min；55℃1min；72℃1min，最后72℃延伸10min。

扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，并割胶回收。

3.重组质粒构建

将pMD19-T Vector和目的片段以1：3比例连接，然后将产物转化JM109感受态大肠杆菌细胞，将已转化的感受态细胞涂布与含有氨苄青霉素的LB平板上，挑取阳性菌落，与含有氨苄青霉素的液体LB培养基振荡培养，用菌液提取质粒。将质粒做10倍比稀释，测定OD值，取平均值计算拷贝数，具体计算公式如下：

C_标＝(OD_260nm×A×N×6.02×10²³×10^－6)/(660×碱基对数)

其中：C_标：DNA模版浓度(拷贝/μL)

A：0.05，换算系数，即，1OD_260nm＝0.05μg/(μL双链DNA)

N:稀释倍数

6.02×10²³：阿佛加德罗常数

4.荧光定量PCR

荧光定量PCR体系：总体积20μL，体系包括10μL SYBR GreenⅡ，6.4μL无菌去离子水，0.8μL 10μmol/L引物(正向、反向)，2μL DNA模板。

荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性30s，进入40个循环，95℃5s，55℃30s，溶解曲线：95℃5s，60℃1min，95℃5s 1个循环。

实施例3酒醅微生物群落中酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌的荧光定量PCR

酒醅样品中酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌的定量：使用实施例1中获取的酒醅总DNA，使用实施例2中酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌的特异性引物。按照实施例2中荧光定量PCR反应体系和荧光定量PCR程序进行酒醅荧光定量PCR分析。

根据由酿酒酵母标准品荧光定量PCR，得到线性方程y＝－3.4263x+36.338(R²＝0.9969)(如图3所示)计算酒醅样品中酿酒酵母的拷贝数，酿酒酵母荧光定量PCR扩增曲线如图1所示、溶解曲线如图2所示。

根据由粟酒裂殖酵母标准品荧光定量PCR，得到线性方程y＝－3.1768x+35.243(R²＝0.998)(如图4所示)计算酒醅样品中粟酒裂殖酵母的拷贝数，粟酒裂殖酵母荧光定量PCR扩增曲线如图1所示、溶解曲线如图2所示。

根据由乳酸菌标准品荧光定量PCR，得到线性方程y＝－3.3237x+34.107(R²＝0.9996)(如图5所示)计算酒醅样品中乳酸菌的拷贝数，乳酸菌荧光定量PCR扩增曲线如图1所示、溶解曲线如图2所示。不同阶段酒醅中微生物数量如表1所示。

表1.不同阶段酒醅中微生物数量

实施例4酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌的特异性扩增位点的筛选

1.纯种菌株的基因组提取

提取表2中所有微生物的基因组DNA。

2.选择荧光定量PCR引物

将表2中的菌株的DNA分为两组，一组选取本发明扩增位点(保守序列)及相应位点的荧光定量PCR引物(见实施例2)；

另一组选取现有技术中这些菌的扩增位点(保守序列)及现有技术中已经在其他的样品中成功扩增该位点的引物进行扩增(这些引物详见参考文献)。具体的见表2，其中乳酸菌类的扩增位点为16SrRNA，酿酒酵母扩增位点为26SrRNA、粟酒裂殖酵母的扩增位点为5SrRNA。

用于扩增乳酸菌16SrRNA、酿酒酵母26SrRNA、粟酒裂殖酵母5SrRNA的引物序列为：

酿酒酵母26SrRNA^[1]

SEQ ID NO.9

NL-1:GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG

SEQ ID NO.10

NL-4:GGTCCGTGTTTCAAGACGG

粟酒裂殖酵母5SrRNA^[2]

SEQ ID NO.11

5S-F：GGTTGCGGCCATATCTAG

SEQ ID NO.12

5S-R：AGATTGCAGCACCTGAGT

乳酸菌16SrRNA^[3]

SEQ ID NO.13

Lac1:AGCAGTAGGGAATCTTCCA

SEQ ID NO.14

Lac2:ATTYCACCGCTACACATG

3.荧光定量PCR分析

按照上一步设计的引物和实施例2中荧光定量PCR反应体系对纯种菌株的基因组进行荧光定量PCR分析。结果如表2所示：

表2.实时定量PCR引物特异性验证结果

正如背景技术中所述，乳酸菌包括乳球菌属、乳杆菌属、戊糖片球菌属和魏斯式属，从表2可以看出本发明所用乳酸菌引物可以扩增表中所有乳酸菌，而现有技术中的乳酸菌的引物则不能扩增出编号2的乳酸菌Lactococcusgarvieae。同时，本发明的针对酿酒酵母和粟酒裂殖酵母选择的位点及引物只能单一扩增其对应的微生物，而现有技术中扩增酿酒酵母位点和引物，不仅扩增出目标菌种，还扩增出编号18的Pichiaetchellsii(不属于酿酒酵母)，可见选择该位点对于固态发酵物中微生物的扩增不具有特异性。同样地，现有技术中的粟酒裂殖酵母的扩增位点及引物还扩增出不属于粟酒裂殖酵母的编号18的Pichiaetchellsii，也不具有特异性，不能实现本发明的目的。

综上，本发明选择的扩增位点在众多的菌种中，能够完整的扩增出本发明的目标菌种和目标片段，且具有很强的特异性，能够实现本发明多微固态中产乙醇和产酸的微生物定量分析，最终实现准确地预测酒醅或大曲发酵中乙醇和乳酸的产量。

实施例5酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌的特异性扩增引物的筛选

表3.实时定量PCR引物序列及筛选结果

1.引物的设计

根据实施例4中选择的乳酸菌、酿酒酵母和粟酒裂殖酵母的扩增位点DNA序

列设计引物，每种微生物设计5对引物，具体引物序列如表4。

2.酒醅微生物群落中酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌的见实施3。

3.不同引物荧光定量PCR扩增效率的计算

计算结果见表3。

荧光定量PCR扩增效率在90–105％之间为可信区间。从表3可以看出本发明所用乳酸菌引物扩增效率为99％，而其余4对引物扩增效率均大于105％。同时，本发明所用酿酒酵母和粟酒裂殖酵母引物扩增效率分别为96％和105％，其余引物扩增效率均不在90–105％。可见本发明所选引物可以高效率的扩增固态发酵物中的微生物。

综上，本发明选择的引物在众多的引物中，能够高效率的扩增出本发明的目标菌种和目标片段，且具有很强的特异性，能够实现本发明多微固态中产乙醇和产酸的微生物定量分析，最终实现准确地预测酒醅或大曲发酵中乙醇和乳酸的产量。

参考文献

1.Cletus P.Kurtzman&Christie J.Robnett.Identification and phylogenyofascomycetous yeasts fromanalysis of nuclear large subunit(26S)ribosomal DNApartial sequences[J].Antonie van Leeuwenhoek,1998,73:331-371.

2.De Schutter K,Lin Y C,Tiels P,et al.Genome sequence of therecombinant protein production host Pichia pastoris[J].Nature biotechnology,2009,27(6):561-566.

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序列表

<110> 贵州茅台酒股份有限公司

<120> 多微固态发酵中产乙醇和产乳酸关键微生物的定量分析方法

<130> PT20170844-DD-P

<160> 38

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gggctggaag atcggtgact ac 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agcgtgagga cagttggatt cg 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgagacgaga cgagacgaga tg 22

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<211> 21

<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<400> 7

gggctggaag atcggtgact acttgcgcct ttggatgagg cactttccag agcggtggta 60

gatctttcga acaggccgta cgcagttgtc gaacttggtt tgcaaaggga gaaagtagga 120

gatctctctt gcgagatgat cccgcatttt cttgaaagct ttgcagaggc tagcagaatc 180

gaatccaact gtcctcacgc t 201

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<211> 103

<212> DNA

<213> 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)

<400> 8

cgagacgaga cgagacgaga tgaacgaaat aacccgctcc caactctata aagggttaag 60

gatagagaga aattgagtgg tacgtttggt gtgccgtttg tcg 103

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gcatatcaat aagcggagga aaag 24

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ggtccgtgtt tcaagacgg 19

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ggttgcggcc atatctag 18

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agattgcagc acctgagt 18

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agcagtaggg aatcttcca 19

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attycaccgc tacacatg 18

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acgctcttca aggtgactgg 20

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cttatcgctg accccctgtc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ctgagagggt aatcggccac 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ttagccgtgg ctttctggtt 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gcggtaatac gtaggtggca 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

ttgagccgaa ggctttcaca 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

taacaccgca tggtgtaggg 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

gtggccgatt accctctcag 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

atacgtaggt ggcaagcgtt 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

tccgatgcac ttcttcggtt 20

Claims

1.多微固态发酵中产乙醇和产乳酸关键微生物的定量分析方法，其特征在于：以酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌的DNA为模板，对酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌的特异性片段进行定量PCR分析；

所述的酿酒酵母特异性片段为HIS3；

所述粟酒裂殖酵母特异性片段为ADH1；

所述乳酸菌特异性片段为16SrRNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，定量PCR分析时，

扩增酿酒酵母的引物对如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

扩增粟酒裂殖酵母的引物对如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

扩增乳酸菌的引物对如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

优选地，酿酒酵母的扩增特异性片段HIS3的序列如SEQ ID NO.7所示；

优选地，粟酒裂殖酵母的扩增特异性片段ADH1的序列如SEQ ID NO.8所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，扩增酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸菌可以在同一反应体系内进行多重定量PCR，也可以在不同的体系中进行定量PCR。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，多微固态发酵为酒醅和大曲发酵。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，具体包含以下步骤：

(2)、定量PCR扩增：采用酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌的特异性引物，以酒醅微生物总基因组DNA为模板，对酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌的特异性片段进行特异性扩增；

(3)、定量分析：通过待测样品的CT值对酒醅中酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸菌进行定量分析。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，扩增时，定量PCR反应程序为：95℃预变性30s，进入40个循环，95℃5s，55℃30s，溶解曲线：95℃5s，60℃1min，95℃5s 1个循环。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，采用绝对定量PCR，所述的绝对定量PCR还包括标准曲线的制备；

优选地，标准曲线的制备方法为：分别对酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸菌的特异性片段进行PCR扩增，得到特异性目的片段，将目的片段与质粒载体连接，获得重组质粒，再将质粒转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆转化子，提取得到高浓度质粒，将此质粒做10倍比稀释，作为荧光定量PCR的标准样品，从而进行荧光定量PCR获得标准曲线；

优选地，荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性30s，进入40个循环，95℃5s，55℃30s，溶解曲线：95℃5s，60℃1min，95℃5s 1个循环。

8.一种多微固态发酵中产乙醇和产乳酸关键微生物的定量检测引物，其特征在于，至少含有以下引物对中的一对：

如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的扩增粟酒裂殖酵母特异性片段的引物；

如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的扩增乳酸菌特异性片段的引物；

优选地，所述的酿酒酵母特异性片段为HIS3；更优选地，所述HIS3的序列如SEQ IDNO.7所示；优选地，粟酒裂殖酵母特异性片段为ADH1；更优选地，所述ADH1的序列如SEQ IDNO.8所示。

9.一种多微固态发酵中产乙醇和产乳酸关键微生物的检测试剂盒，其特征在于含有权利要求8所述的引物中的至少一对或一条。

10.一种多微固态发酵中产乙醇和产乳酸关键微生物的检测芯片，其特征在于含有权利要求8所述的引物中的至少一对。