CN112831546A - 一种大曲中关键功能微生物的定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大曲中关键功能微生物的定量检测方法，属于生物工程技术领域。本发明是一种根据关键功能微生物的看家基因设计特异性引物，并利用特异性引物对关键功能微生物的定量检测方法。该方法包括如下步骤：（1）关键功能微生物标准菌株特异性引物的设计；（2）用上述引物对关键功能微生物标准菌株进行荧光定量PCR，绘制标准曲线；（3）大曲样品总DNA提取；（4）利用特异性引物对关键功能微生物进行特异性扩增；根据标准曲线，从而对大曲中关键功能微生物进行定量检测。本发明基于关键功能微生物设计的特异性引物绘制的标准曲线适用于定量检测大曲中关键功能微生物以及变化趋势。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种大曲中关键功能微生物的定量检测方法。
背景技术
大曲是一种重要的糖化和发酵剂，为中国白酒的生产提供丰富的微生物菌群，水解酶，风味化合物及其前体物质，并起着至关重要的作用。大曲质量好坏直接关系到白酒的出酒率和酒质。由于大曲的传统开放发酵特点，制曲环境、制曲工艺和制曲原料等微生物菌群均影响着大曲的质量。所以，大曲制作过程中关键功能微生物种类和数量对大曲质量以及酒质尤为重要。前期研究者表明，大曲中微生物类群主要是霉菌，其次是细菌和酵母菌。霉菌以根霉和曲霉为主，细菌则以乳酸菌和芽孢杆菌为主，而酵母菌以酿酒酵母和扣囊覆膜孢酵母为主。
米根霉含有极为丰富的糖化型淀粉酶，糖化型淀粉酶能破坏原料中淀粉的α-1,4和α-1,6糖苷键，从而将绝大多数淀粉转变为可发酵性糖，如葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖等。此外，米根霉在发酵过程中能产生乙酸乙酯、丙酸乙酯、正丙醇、3-甲基丁醇、乙醛等芳香性成分，米根霉的细胞中还含有少量代谢产生乳酸等物质的独特有机酸酶，对曲和酒的品质起着重要作用。
米曲霉的菌丝由多细胞组成，是一类产复合的菌株，除产淀粉酶外，还可产蛋白酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；米曲霉产生的蛋白酶包括中性蛋白酶、酸性蛋白酶和碱性蛋白酶，其酶活力的高低将直接影响原料的利用率及产品品质，在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，还有研究表明米曲霉发酵产酒、产酸、产酯及还原糖。
大曲中的乳酸菌在生长和繁殖的过程中，会消耗和利用环境中的糖类进行发酵并且产生大量的乳酸，并在酯化酶的作用下形成乳酸乙酯，从而导致酒中乳酸乙酯的含量较高，以致严重影响酒体风格和质量。乳酸菌既调节着窖池微环境，影响其他功能微生物的繁殖，又对酯类、醇类、酸类等风味物质的合成有贡献。大曲中乳酸菌的含量是衡量大曲品质的一个重要标志，决定着大曲的质量。
芽孢杆菌在大曲中的功能较多，前人研究发现它是芳香味物质的主要来源，具有产芳香族化合物、酚类、酯类等白酒风味物质的能力以及吡嗪类物质、愈创木酚和苯甲醛等多种重要的大曲风味物质，在风味物质形成与酒体风格和质量等方面起着不可或缺的重要作用。
酿酒酵母是大曲众多微生物中的一种，在随大曲进入酒醅参与发酵后，能够通过糖酵解途径，将发酵环境中的糖类分解为二氧化碳和酒精，是发酵过程中主要的产酒类微生物。在生成酒精的同时，酿酒酵母还能够生成多种有机酸、高级醇及酯类物质，这些物质在基酒的风味中发挥重要作用。其中酸类中的乙酸、2-甲基丙酸，醇类中的3-甲基丁醇、苯乙醇、2-甲基丙醇，酯类中的壬酸乙酯和亚油酸乙酯是生成量增长较多的化合物。另外，应用于白酒酿造过程中，可以作为功能强化菌调控白酒的风味。
研究表明，扣囊覆膜孢酵母所产淀粉酶能够在大曲发酵的酸性高温环境中发挥作用，高效降解大曲中的淀粉颗粒，产生大量小分子糖，既能参与到美拉德反应中，生成白酒风味成分或前体物质，丰富大曲风味，又能供其他微生物的生长繁殖，避免曲块死板，起到促进大曲微生物群落结构更替的作用，具有应用于大曲生产的潜力。
因此，阐明大曲发酵过程中关键功能微生物的定量检测对于大曲和中国白酒的质量、风味具有重要的理论和应用价值。传统培养法和传统PCR法对于大曲中关键功能微生物定量检测时具有耗时耗力，且缺乏准确性和可靠性等确定，所以，建立一种大曲中关键功能微生物的定量检测方法是十分必要并且具有重要意义。
发明内容
1. 本发明的目的是提供一种大曲中关键功能微生物的定量检测方法。
2. 为实现上述发明目的，本发明所采取的技术方案为：
（1）根据大曲中关键功能微生物标准菌株的看家基因设计、合成特异性引物，其中，所述用于乳酸乳杆菌检测的特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物L-F：5′—TACGCATGATATCGCGCAT—3′
下游引物L-R：5′—CCATCGTATTATGCATGTCAA—3′；
所述用于枯草芽孢杆菌检测的特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物B-F：5′—GCCCTGGTATGTATATTGGATCTAC—3′
下游引物B-R：5′—GGTCATCCTGACTTCTACAGCAGGA—3′；
所述用于扣囊覆膜孢酵母检测的特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物Sfi-F：5′—ACTCTTTGTGGGATTCTAT—3′
下游引物Sfi-R：5′—GTTCCGTATCCCACT—3′；
所述用于酿酒酵母检测的特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物Sc-F：5′—ACATATGTTGTATGAATCTATCCA ACGGTG—3′
下游引物Sc-R：5′—TGGTCGTGGTCGATATCTA—3′；
所述用于米曲霉检测的特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物Ao-F：5′—GTCGTAATCTCTTCGG—3′
下游引物Ao-R：5′—CTGGATCAAGATCTATTTGCG—3′；
所述用于米根霉检测的特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物Ro-F：5′—GTACCATAGTGGGATAA—3′
下游引物Ro-R：5′—AGCTAGCCACACTGAA—3′。
（2）菌株标准曲线的制备
采用试剂盒法提取自大曲样品中分离筛选鉴定的标准菌株培养至菌落总数为106~107 CFU/mL的DNA，梯度稀释后，采用上述特异性引物进行荧光定量PCR，根据菌落总数与CT值绘制的标准曲线。
（3）大曲中总DNA提取
称取大曲样品2 g置于50 mL离心管中，加入30 mL磷酸缓冲盐溶液，2500 r/min低速离心10 min，使微生物自大曲中分离，取上清，8000 r/min高速离心10 min，取沉淀提取大曲总DNA。
（4）大曲中关键功能微生物的定量检测
以（3）中所述大曲总DNA为模板，采用（1）所述特异性引物进行扩增，根据标准曲线计算大曲中关键功能微生物的量。
3. 荧光定量PCR反应程序
预变性 95℃ 10 min；变性 95℃ 15 s，退火 60℃ 60 s，40个循环；熔解曲线：95℃15 s，60℃ 60 s，95℃ 30 s。同时设立阴性和平行性对照。
4. 荧光定量PCR方法的体系组成
总体系20 μL，2×mix 10 μL，50×ROX 0.16 μL，DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 6.84 μL。
5. 本发明建立了快速、准确、方便的大曲中关键功能微生物的定量检测方法，简化了大曲中功能微生物的检测程序，并提高检测效率，加强对大曲中关键功能微生物的监控，为大曲风味物质的形成、理化指标的变化于微生物菌群的变化机理提供了技术支持。本发明运用实时荧光定量PCR技术对大曲生产过程中关键功能微生物进行定量分析，并可以观察这些微生物在大曲制作过程中或者白酒酿造过程的生物量变化情况。本发明的目的是提供一种大曲中关键功能微生物的定量检测方法。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，下述实施例中，如无特别说明，均为常规方法。
实施例一 特异性引物的设计
根据关键功能微生物的看家基因设计特异性引物，其中用于乳酸乳杆菌检测的特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物L-F：5′—TACGCATGATATCGCGCAT—3′
下游引物L-R：5′—CCATCGTATTATGCATGTCAA—3′；
用于枯草芽孢杆菌检测的特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物B-F：5′—GCCCTGGTATGTATATTGGATCTAC—3′
下游引物B-R：5′—GGTCATCCTGACTTCTACAGCAGGA—3′；
用于扣囊覆膜孢酵母检测的特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物Sfi-F：5′—ACTCTTTGTGGGATTCTAT—3′
下游引物Sfi-R：5′—GTTCCGTATCCCACT—3′；
用于酿酒酵母检测的特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物Sc-F：5′—ACATATGTTGTATGAATCTATCCA ACGGTG—3′
下游引物Sc-R：5′—TGGTCGTGGTCGATATCTA—3′；
用于米曲霉检测的特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物Ao-F：5′—GTCGTAATCTCTTCGG—3′
下游引物Ao-R：5′—CTGGATCAAGATCTATTTGCG—3′；
用于米根霉检测的特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物Ro-F：5′—GTACCATAGTGGGATAA—3′
下游引物Ro-R：5′—AGCTAGCCACACTGAA—3′。
实施例二 菌株标准曲线的制备
（1）测定标准菌株生长曲线
将纯菌株乳酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、扣囊覆膜孢酵母和酿酒酵母分别接种至25 mL的MRS、NB、PDB和PDB液体培养基中，测定培养基的吸光值（2 h/次），直到吸光值趋于稳定，确定对数期及菌落总数为106-107 CFU/mL之间的吸光值和培养时间。
（2）提取标准菌株的DNA
将菌落总数调整为106-107 CFU/mL的乳酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、扣囊覆膜孢酵母和酿酒酵母，以及细胞数调整为106-107 个/mL的米曲霉和米根霉提取标准菌株的DNA。
（3）标准曲线的制备
以系列梯度稀释的标准菌株的DNA为模板，利用实施例一的特异性引物进行PCR扩增，根据菌落总数和CT值绘制标准曲线。
（4）荧光定量PCR反应程序
预变性 95℃ 10 min；变性 95℃ 15 s，退火 60℃ 60 s，40个循环；熔解曲线：95℃15 s，60℃ 60 s，95℃ 30 s。同时设立阴性和平行性对照。
（5）荧光定量PCR的体系组成
总体系20 μL，2×mix 10 μL，50×ROX 0.16 μL，DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 6.84 μL。
实施例三 大曲样品中关键功能微生物的定量检测
（1）大曲样品总DNA提取
称取大曲样品2 g置于50 mL离心管中，加入30 mL磷酸缓冲盐溶液，2500 r/min低速离心10 min，使微生物自大曲中分离，取上清，8000 r/min高速离心10 min，取沉淀提取大曲总DNA。
（2）大曲样品中关键功能微生物的特异性扩增和定量检测
以大曲总DNA为模板，利用实施例一的特异性引物分别进行PCR扩增，按照实施例二荧光定量PCR的体系和反应程序进行特异性扩增，根据实施例二的标准曲线，计算大曲中关键功能微生物的量。
Claims (6)
1.一种大曲中关键功能微生物的定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）设计、合成针对关键功能微生物标准菌株的特异性引物；
（2）提取标准菌株DNA，利用上述得到特异性引物依次进行荧光定量PCR，以标准菌株菌落总数为横坐标，以CT值为纵坐标绘制标准曲线；
（3）称取适量大曲样品，采用试剂盒法提取大曲样品中总DNA；
（4）对大曲样品中关键功能微生物进行特异性扩增，将扩增得到的CT值带入标准曲线进行定量检测。
2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，大曲关键功能微生物为采用传统分离筛选方法从大曲中分离得到的，有益于提升大曲和中国白酒品质的微生物菌株，应包括乳酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、扣囊覆膜孢酵母、酿酒酵母、米曲霉和米根霉6种关键功能微生物。
3.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，根据关键功能微生物标准菌株的看家基因设计、合成特异性引物，其中，所述用于乳酸乳杆菌检测的特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物L-F：5′—TACGCATGATATCGCGCAT—3′
下游引物L-R：5′—CCATCGTATTATGCATGTCAA—3′；
所述用于枯草芽孢杆菌检测的特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物B-F：5′—GCCCTGGTATGTATATTGGATCTAC—3′
下游引物B-R：5′—GGTCATCCTGACTTCTACAGCAGGA—3′；
所述用于扣囊覆膜孢酵母检测的特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物Sfi-F：5′—ACTCTTTGTGGGATTCTAT—3′
下游引物Sfi-R：5′—GTTCCGTATCCCACT—3′；
所述用于酿酒酵母检测的特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物Sc-F：5′—ACATATGTTGTATGAATCTATCCA ACGGTG—3′
下游引物Sc-R：5′—TGGTCGTGGTCGATATCTA—3′；
所述用于米曲霉检测的特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物Ao-F：5′—GTCGTAATCTCTTCGG—3′
下游引物Ao-R：5′—CTGGATCAAGATCTATTTGCG—3′；
所述用于米根霉检测的特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物Ro-F：5′—GTACCATAGTGGGATAA—3′
下游引物Ro-R：5′—AGCTAGCCACACTGAA—3′。
4.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，采用试剂盒法提取标准菌株DNA，提取前其菌液培养量须满足106~107 CFU/mL。
5.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，荧光定量PCR反应程序为：预变性 95℃10 min；变性 95℃ 15 s，退火 60℃ 60 s，40个循环；熔解曲线：95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 30 s；同时设立阴性和平行性对照，荧光定量PCR方法的体系组成为：总体系20 μL：2×mix 10 μL，50×ROX 0.16 μL，DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 6.84 μL。
6.权利要求1所述的大曲中关键功能微生物的定量检测方法适用于监测大曲制作过程中关键功能微生物的定量检测，便于阐述大曲中关键功能微生物与理化指标、风味化合物等代谢物之间的相关性。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20210525 |