CN112553362B - 一种酿酒酵母绝对定量的探针及其应用 - Google Patents

一种酿酒酵母绝对定量的探针及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酿酒酵母绝对定量的探针及其应用，属于生物领域、发酵领域、检测领域。本发明的酿酒酵母定量探针和试剂盒，能够实现酿酒酵母的总量检测，用于检测和酿酒酵母定量时不需要使用昂贵仪器，可在2.5h内快速完成定量工作。同时，本发明所使用的样品不必须进行核酸提取。基于本发明的探针、检测试剂盒用于酿酒酵母定量，具有快速、方便、便宜、准确的特点。

Description

一种酿酒酵母绝对定量的探针及其应用
技术领域
本发明涉及一种酿酒酵母绝对定量的探针及其应用，属于生物领域、发酵领域、检测领域。
背景技术
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有悠久的食品发酵使用历史，被广泛应用于酒精类食品的生产过程，例如中国白酒、葡萄酒、白兰地、朗姆酒等。发酵过程中酒精的生产效率决定了工业化生产的效益，同时酒精属于初级代谢产物，发酵过程中酒精随着酿酒酵母的生长而代谢积累，因此实时跟踪酿酒酵母的生物量对判断发酵批次稳定性以及发酵参数调控具有重要的指导意义。但目前传统发酵食品体系多多数是多菌种共发酵体系，通过简单的OD比色法无法判断样本中酿酒酵母的含量，虽然荧光定量PCR法结合特异性引物或探针可以实现混菌系统中酿酒酵母的定量，但是需要高额的设备和高要求的操作环境。因此，为方便、快速、准确地跟踪样本中酿酒酵母的生长变化趋势，有必要开发相应的酿酒酵母定量方法以及试剂盒。
G四链体/血红素模拟酶活检测的原理在于G四链体可以与血红素形成具有过氧化氢酶活性的DNA模拟酶，可催化过氧化氢氧化ABTS生成ABTS+，呈现绿色的显色反应，可在波长420nm下检测特征吸光值。G四链体结构的稳定性对整个检测过程至关重要，如果设计不当，当G四链体序列与其他碱基形成二聚体时，会导致G四链体序列无法形成G四链体，以此原理为基础的定量方法在使用中会导致低估样本中目标基因的含量，降低检测方法的灵敏度和准确性。
目前，基于G四链体/血红素模拟酶活检测的原理有被用于微生物的特异性检测的报道；例如文献Wang Y,Li X,Xi D,Wang X.Visual detection of Fusariumproliferatum based on asymmetric recombinase polymerase amplification andhemin/G-quadruplex DNAzyme.Rsc Advances 2019；9:37144-37147.中，使用了不对称特异性引物(上游引物添加G四链体的反向序列修饰，下游不修饰)，该方法只能适用于样本中特定细菌Fusarium proliferatum的检测，无法实现酿酒酵母的总量检测；此外，该文献利用该不对称特异性引物进行检测时，是在PCR体系中添加不同浓度的上下游引物(上游引物浓度低，下游引物浓度高)，通过重组聚合酶扩增(RPA)扩增形成双链产物，随着PCR反应的进行，上游引物被消耗殆尽，下游引物使用新合成的双链DNA为模板扩增，从而形成带有G四链体末端的单链DNA，从而使用G四链体/血红素模拟酶活检测检测样本中的Fusariumproliferatum。但该定量方法依然需要PCR步骤产生G四链体，而PCR过程依然需要高额PCR设备以及严格的操作环境。
发明内容
本发明的一种用于酿酒酵母绝对定量的探针、试剂盒及应用，解决了如下的至少一个技术问题：(1)现有的方法无法实现所有酿酒酵母的总量检测；(2)现有定量方法在物种分辨率较低和/或检测准确性不足；(3)现有定量方法需要高额的仪器设备和/或严格的操作环境，不适用于生产采样后的及时检测；(4)现有定量方法操作繁琐等。
本发明的第一个目的是提供一组探针，包括信号探针和淬灭探针；信号探针序列为SEQ ID NO.1所示(GGGTGGGTGGGTGGGTGGACTCTGGACATGC)。
在一种实施方式中，淬灭探针序列为SEQ ID NO.2所示(GCATGTCCAGAGTCCACCCA)。
本发明的第二个目的是提供酿酒酵母定量方法，所述方法包括使用本发明的探针。
所述方法包括：待测样品中DNA发生解链；加入过量信号探针(序列如SEQ IDNO.1)，与待测样本的目标核苷酸片段结合形成双链，使G四链体裸漏在序列之外；加入足量淬灭探针(序列如SEQ ID NO.2)与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构；利用裸漏在外G四链体与血红素反应形成具有过氧化氢酶活性的G四链体/血红素模拟酶，结合过氧化氢酶的活性表征酿酒酵母的生物量。
在一种实施方式中，所述方法为绝对定量方法，还包括：建立过氧化氢酶活性(或者与过氧化氢酶活性呈相关性的指标，比如催化过氧化氢氧化ABTS生成ABTS+后溶液在波长420nm下的吸光值)与酿酒酵母的生物量的标准曲线；检测待测样品时，将检测到的过氧化氢酶活性代入标准曲线，即获得待测样品中的酿酒酵母的生物量。
在一种实施方式中，所述方法为相对定量方法，还包括：检测多个样品，根据不同样本检测得到的过氧化氢酶活性的相对比值确定该多个不同样本中酿酒酵母的生物量的相对值。
在一种实施方式中，所述待测样品为含有菌体、基因组或宏基因组等的样品。可选地，所述待测样品为发酵食品成品或者取自发酵食品发酵过程中的样品；可选地，待测样本进行离心、收集菌体等预处理后再进行后续测定。优选地，收集该样品中的菌体后不经基因组提取，直接进行DNA解链处理。
在一种实施方式中，所述样品为发酵食品或者取自发酵食品发酵过程中的样品，或者肠道、土壤、水体等环境样本。
在一种实施方式中，所述发酵食品为以下任意一种以上：白酒、黄酒、酱油、啤酒、葡萄酒、食醋、发酵茶、传统发酵蔬菜、发酵饮料、酒精饮品、酸奶、干酪、果醋、酒酿、豆豉、乳腐、发酵米面食品等。
在一种实施方式中，所述待测样品中DNA发生解链，是采用高温方式进行。可选地，是将待测样品在高于90℃温度下处理。可以是金属浴、水浴、烘箱、保温仪等任意一种能提供对应温度的环境。
在一种实施方式中，所述解链是在缓冲液中进行。可选地，所述缓冲液可以是Tris-HCl缓冲液，还含有KCl、NH4Cl、NaCl中的任意一种或者多种。可选地，所述缓冲液为Tris-HCl，KCl，pH＝7.9。
在一种实施方式中，所述过量是指，加入量高于能与待测样本的目标核苷酸片段全部结合形成双链时所需要的信号探针的量。具体用量，本领域技术人员可以结合本领域常识或具体的待测样本来确定，或者通过预实验来确定。
在一种实施方式中，所述过量是指，超过1010个拷贝的信号探针。
在一种实施方式中，所述信号探针与待测样本的目标核苷酸片段结合形成双链，是在50-60℃温度范围下进行的。
在一种实施方式中，所述足量是指，加入量足以与全部未结合的信号探针形成双链时所需要的淬灭探针的量。具体用量，本领域技术人员可以结合本领域常识来确定或具体的待测样本来确定，或者通过预实验来确定。
在一种实施方式中，所述足量是指，信号探针的双倍量。
在一种实施方式中，所述加入足量淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，是在能使淬灭探针与未结合的信号探针形成双链的温度下进行；本领域技术人员可以结合本领域常识来确定或具体的待测样本来确定。
在一种实施方式中，所述利用裸漏在外G四链体与血红素反应形成具有过氧化氢酶活性的G四链体/血红素模拟酶，结合过氧化氢酶的活性表征酿酒酵母的生物量，是指在体系中加入血红素反应后，再加入ABTS和H2O2，然后通过反应物的吸光值来表征过氧化氢酶活性。
在一种实施方式中，所述吸光值是在波长420nm下的吸光值。
在一种实施方式中，所述定量方法，具体是：
(1)待测样品进行DNA解链处理；
(2)加入信号探针，于55℃反应30min；
(3)加入淬灭探针，于55℃反应30min；
(4)加入血红素，于37℃反应30min；
(5)加入2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和H2O2，于37℃温度反应30min；
(6)检测反应物在波长420nm下的吸光值；
(7)结合吸光值对样品中酿酒酵母进行定量。
在一种实施方式中，所述定量方法，还包括：配置不同已知酿酒酵母含量的样品，测定不同样品经上述方法处理后得到的吸光值；绘制吸光值与不同酿酒酵母含量的标准曲线；将待测样品经经上述方法处理后得到的吸光值代入标准曲线，即获得待测样品中酿酒酵母含量。
本发明的第三个目的是提供一种用于酿酒酵母绝对定量的检测试剂盒，含有本发明的序列如SEQ ID NO.1的信号探针。
在一种实施方式中，所述检测试剂盒还含有序列如SEQ ID NO.2的淬灭探针。
在一种实施方式中，所述检测试剂盒还含有如下任意一种或多种：血红素、缓冲液、2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、H2O2。也可以不含有这些试剂，在使用试剂盒时，有操作人员另行准备。
在一种实施方式中，所述检测试剂盒中，缓冲液可以是Tris-HCl缓冲液，还含有KCl、NH4Cl、NaCl中的任意一种或者多种。可选地，所述缓冲液为Tris-HCl，KCl，pH＝7.9。
在一种实施方式中，所述检测试剂盒是酿酒酵母绝对定量试剂盒，所述试剂盒同时包括四种试剂(试剂1，试剂2，试剂3，试剂4)和一套酿酒酵母定量探针(信号探针，淬灭探针)；所述的试剂1包括血红素；所述的试剂2包括缓冲液(Tris-HCl，KCl，pH＝7.9；其中KCl可替换为NH4Cl、NaCl)；所述的试剂3包括2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)；所述的试剂4包括H2O2。
在一种实施方式中，所述检测试剂盒中，试剂或探针可以是液体状态或者固体状态，使用时本领域技术人员可以常规地调整到适合的浓度。
本发明的第四个目的是提供所述试剂盒的使用方法。
在一种实施方式中，所述使用方法包括：在DNA解链的待测样本中加入过量的信号探针反应一段时间，使信号探针与待测样本中的目标片段结合；然后在加入足量淬灭探针使之与未结合的信号探针的形成双链；再加入血红素，反应一段时间后加入ABTS和H2O2，反应一段时间，检测反应物的吸光值，结合吸光值对样品中酿酒酵母进行定量。
在一种实施方式中，所述方法包括，将试剂和探针调整到适合使用的浓度。
(1)待测样品进行DNA解链处理；(2)加入信号探针，于55℃反应30min；(3)加入淬灭探针，于55℃反应30min；(4)加入血红素，于37℃反应30min；(5)加入2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和H2O2，于37℃温度反应30min；(6)检测反应物在波长420nm下的吸光值；(7)结合吸光值对样品中酿酒酵母进行定量。
本发明的第五个目的是提供所述试剂盒在酿酒酵母定量中的应用。
在一种实施方式中，所述应用是用于发酵食品技术领域或者肠道、土壤、水体等环境微生物检测领域；可选地，所述发酵食品为以下任意一种以上：白酒、黄酒、酱油、啤酒、葡萄酒、食醋、发酵茶、传统发酵蔬菜、发酵饮料、酒精饮品、酸奶、干酪、果醋、酒酿、豆豉、乳腐、发酵米面食品等。
在一种实施方式中，所述应用时，待测样本可以为含有菌体、基因组或宏基因组等的样品。可选地，所述待测样品为发酵食品成品或者取自发酵食品发酵过程中的样品；可选地，待测样本进行离心、收集菌体等预处理后再进行后续测定。优选地，收集该样品中的菌体后不经基因组提取，直接进行DNA解链处理。
有益效果：
本发明将G四链体与特异性性序列结合形成信号探针，信号探针与目标序列结合使得G四链体裸漏在序列之外，加入足量淬灭探针与未反应信号探针形成双链，破坏G四链体结构，通过与血红素反应形成G四链体/血红素模拟酶，表现出过氧化氢酶活性，以过氧化氢酶活性表征微生物的生物量。本发明的酿酒酵母定量探针，能够实现酿酒酵母的总量检测；进一步地，对信号探针进行优化，信号探针序列为GGGTGGGTGGGTGGGTGGACTCTGGACATGC(SEQ ID NO.1)，淬灭探针为GCATGTCCAGAGTCCACCCA(SEQ ID NO.2)。与SEQ ID NO.3的信号序列相比，SEQ ID NO.1的信号探针中G四链体序列不与特异性序列产生额外的空间结构(图1)，检测的准确性更高、最低检出限改善。
本发明的探针用于检测和酿酒酵母定量时，不需要昂贵仪器的检测流程。还首次提供一种用于微生物绝对定量试剂盒，可在2.5h内完成定量工作。本发明为避免使用高额设备，如PCR仪，通过信号探针和淬灭探针组合的方式实现微生物定量。本发明解决了目前的微生物定量手段均依赖较昂贵的仪器，在实际用于过程中十分受限制的问题。
进一步，本发明能够实现快速酿酒酵母检测，样品不必须进行核酸提取，仅需要将样本中的微生物洗脱于缓冲液中，直接进行后续实验。同时，与荧光定量PCR定量结果相比，本发明所得到的定量结果无显著性差异。
综上，基于本发明所提供的探针及检测试剂盒，用于酿酒酵母定量，具有快速、便宜、准确的特点。
附图说明
图1：信号探针二聚体结构。(A)SEQ ID NO.1的G四链体序列不与特异性序列自成环；(B)已报道的SEQ ID NO.3用于微生物定量的G四链体序列与特异性序列自成环.
图2：酿酒酵母探针的特异性。
图3：基于基因组提取的酿酒酵母定量探针的标准曲线。
图4：基于不提取样本基因组的酿酒酵母定量探针的标准曲线。
图5：qPCR标准曲线。
图6：比较基于基因组提取的酿酒酵母探针定量实验、基于不提取样本基因组的酿酒酵母探针定量实验和qPCR酿酒酵母定量实验；其中，(A)基于基因组提取的酿酒酵母探针定量实验，(B)基于不提取样本基因组的酿酒酵母探针定量实验，(C)qPCR酿酒酵母定量实验。
图7：比较基于SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2的探针(A)和SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4探针(B)的检测结果的稳定性。
具体实施方式：
实施例1：酿酒酵母定量探针组合试剂
探针组合试剂；含有独立包装的信号探针试剂和淬灭探针试剂；其中，信号探针序列如SEQ ID NO.1所示的，淬灭探针序列为SEQ ID NO.2所示的。
信号探针试剂和淬灭探针试剂，为干粉或者液体状；为干粉时，可以在实验之前稀释到合适的浓度，比如，使用无菌水或者缓冲液稀释至浓度为20μM；为液体状时，浓度可以是20-200μM，试剂使用前可以进行稀释，或者直接使用。
实施例2：酿酒酵母定量试剂盒及其使用
酿酒酵母定量试剂盒，含有独立包装的信号探针试剂和淬灭探针试剂；其中，信号探针序列如SEQ ID NO.1所示，淬灭探针序列为SEQ ID NO.2所示。
该试剂盒使用时，可以与血红素、缓冲液、2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、H2O2配合使用。
使用方法是：
(1)溶液配置。配置100nM的血红素溶液(试剂1)；配置终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9(试剂2)；7mM的2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)(试剂3)以及7mM的H2O2溶液(试剂4)；溶剂均为无菌水。
(2)信号探针与样本DNA形成双链。向2mL的试剂2加入4μL的样本基因组DNA，于90℃下水浴处理10min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。
(3)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链。淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(4)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。
(4)形成血红素/G四链体结构。向(5)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM试剂1，37℃处理30min。
(5)显色反应。向(4)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4，37℃处理30min，进行显示反应(绿色)。
检测反应物在波长420nm下的吸光值；结合吸光值对样品中酿酒酵母进行定量。
当然，在进行绝对定量时，可以自行绘制吸光值与酿酒酵母生物量的标准曲线，或者根据试剂盒推荐的使用方法和标准曲线直接换算得到酿酒酵母的生物量。
实施例3：酿酒酵母定量试剂盒
酿酒酵母定量试剂盒，含有独立包装的信号探针试剂和淬灭探针试剂；其中，信号探针序列如SEQ ID NO.1所示的，淬灭探针序列为SEQ ID NO.2所示。
该试剂盒中还含有100nM的血红素溶液(试剂1)、Tris-HCL缓冲液、7mM的2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、7mM的H2O2溶液。
实施例4：酿酒酵母定量试剂盒的特异性
(1)选择来源于发酵谷物中的酿酒酵母作为阳性对照，选择发酵食品样本中广泛存在的36个细菌种微生物和6个真菌种微生物作为阴性对照，细菌微生物分别为Lactobacillus buchneri,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillus brevis,Lactobacillus crustorum,Lactobacillus plantarum,Lactobacillus harbinensis,Lactobacillus acidiliscis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcusacidilactici,Pediococcus pentosaceus,Lactobacillus murinus,Lactobacilluscurvatus,Lactobacillus casei,Lactobacillus reuteri,Lactobacillus panis,Lactobacillus fermentum,Lactobacillus johnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissella confusa,Weissella paramesenteroides,Weissellaviridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostoc pseudomesenteroides,Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcus faecalis,Bacillus coagulans,Bacillus licheniformis,Bacillustequilensis,Bacillus subtilis,Bacillus velezensis,Acetobacter pasteurianus,Enterococcus faecium。真菌微生物分别为Aspergillus tubingensis，Mucor rouxianus，Schizosaccharomyces pombe，Zygosaccharomyces bailii，Pichia kudriavzevii，Saccharomycopsis fibuligera。
(2)以上微生物选择不同的培养基进行培养，其中Lactobacillus buchneri,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillus brevis,Lactobacillus crustorum,Lactobacillus plantarum,Lactobacillus harbinensis,Lactobacillus acidiliscis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcus acidilactici,Pediococcus pentosaceus,Lactobacillus murinus,Lactobacillus curvatus,Lactobacillus casei,Lactobacillus reuteri,Lactobacillus panis,Lactobacillus fermentum,Lactobacillus johnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissella confusa,Weissella paramesenteroides,Weissella viridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostocpseudomesenteroides使用MRS培养基，培养基配方为胰蛋白胨10.0g/L，牛肉浸膏8.0g/L，酵母提取物4.0g/L，葡萄糖18.0g/L，无水山梨醇油酸酯0.8mL/L，K2HPO4 2.5g/L，三水合乙酸钠6.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，MnSO4·4H2O 0.08g/L。培养条件为30℃48h。Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcus faecalis,Bacillus coagulans,Bacillus licheniformis,Bacillus tequilensis,Bacillussubtilis,Bacillus velezensis,Acetobacter pasteurianus,Enterococcus faecium，Escherichia coli使用LB培养基，培养基配方为蛋白胨10.0g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。培养条件为37℃24h。Aspergillus tubingensis，Mucor rouxianus，Schizosaccharomyces pombe，Zygosaccharomyces bailii，Pichia kudriavzevii，Saccharomycopsis fibuligera，Saccharomyces cerevisiae使用YPD培养基，培养基配方为酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。培养条件为：霉菌30℃下培养5天，酵母菌30℃条件下培养2天。
(3)单菌基因组提取。上述菌液在12000rpm条件下处理2min，收集沉淀。43种微生物纯培养物的基因组使用基因抽提试剂盒DNeasy Tissue Kit提取。
(4)探针选择为酿酒酵母特异性探针，信号探针的序列为GGGTGGGTGGGTGGGTGGACTCTGGACATGC(SEQ ID NO.1)，淬灭探针的序列为GCATGTCCAGAGTCCACCCA(SEQ ID NO.2)。
(4)信号探针与样本DNA形成双链。分别向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入4μL不同微生物的基因组DNA，于90℃下水浴处理10min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。
(5)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(4)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。
(6)形成血红素/G四链体结构。向(5)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM试剂1(血红素)，37℃处理30min。
(7)显色反应。向(6)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H2O2),37℃处理30min。结果如图2所示，添加酿酒酵母基因组的实验组出现显色反应，添加非酿酒酵母的实验组和空白对照组没有出现显色反应，证明本试剂盒中检测酿酒酵母的特异性。
实施例5：定量方法准确性评估
(1)酿酒酵母菌液根据实施例4中的培养方法获得，微生物菌浓通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例4。
(2)通过10倍梯度稀释酿酒酵母基因组DNA。
(3)使用酿酒酵母的探针，以不同浓度的酿酒酵母基因组DNA进行显色反应。信号探针的序列为GGGTGGGTGGGTGGGTGGACTCTGGACATGC(SEQ ID NO.1)，淬灭探针的序列为GCATGTCCAGAGTCCACCCA(SEQ ID NO.2)。
(4)信号探针与样本DNA形成双链。将向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入4μL不同稀释度的基因组DNA(不加样本DNA为空白对照)。于90℃下水浴处理10min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。
(5)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(4)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。
(6)形成血红素/G四链体结构。向(5)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM的试剂1(血红素)，37℃处理30min。
(7)显色反应。向(6)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H2O2),37℃处理30min。利用紫外分光光度计测定在波长420nm下的吸光值，以不加样本DNA的实验组作为空白对照。
(8)通过计算吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，如图3所示，R2＝0.99(x的单位是log10 CFU/mL，y的单位是OD420，线性范围为103～107)。证明本发明所提供的试剂盒定量方法的准确性。
实施例6：葡萄酒样本中酿酒酵母的定量实验
(1)参考Gayevskiy,V.,&Goddard,M.(2012).Geographic delineations ofyeast communities and populations associated with vines and wines in NewZealand.ISME J,6(7),1281-1290.的Materials and methods方法，样本采集于山东烟台某知名葡萄酒生产厂家。基因组浓度为658.39ng/μL。
(2)使用酿酒酵母的探针进行显色反应。信号探针的序列为GGGTGGGTGGGTGGGTGGACTCTGGACATGC(SEQ ID NO.1)，淬灭探针的序列为GCATGTCCAGAGTCCACCCA(SEQ ID NO.2)。
(4)信号探针与样本DNA形成双链。向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入4μL酸奶宏基因组DNA(不加样本DNA为空白对照)。于90℃下水浴处理10min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。
(5)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(4)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。
(6)形成血红素/G四链体结构。向(5)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM试剂1(血红素)，37℃处理30min。
(7)显色反应。向(6)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(7mM H2O2),37℃处理30min。利用紫外分光光度计测定在波长420nm下的吸光值，以不加样本DNA的实验组作为空白对照，显示吸光值是0.512。
(8)根据实施例5所得的标准曲线，计算得样本中酿酒酵母总量为4.99log10 CFU/mL。
(9)通过荧光定量PCR法(定量步骤和材料同实施例11(6))对上述同一样本中的酿酒酵母进行定量，结果显示酿酒酵母总量为5.15log10 CFU/mL，与上述方法测定的定量结果基本一致(变异系数，CV＝0.023)。
实施例7：酒醅样本中酿酒酵母的绝对定量
(1)参考Song Z W,Du H,Zhang Y,Xu Y.Unraveling core functionalmicrobiota in traditional solid-state fermentation by high-throughputamplicons and metatranscriptomics sequencing.Frontiers in microbiology 2017；8:1294的MATERIALS AND METHODS中的方法，提取来源于山东省景芝镇的酒醅样本中的宏基因组，基因组浓度为100.02ng/μL。
(2)使用酿酒酵母的探针进行显色反应。信号探针的序列为GGGTGGGTGGGTGGGTGGACTCTGGACATGC(SEQ ID NO.1)，淬灭探针的序列为GCATGTCCAGAGTCCACCCA(SEQ ID NO.2)。
(3)信号探针与样本DNA形成双链。向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入4μL酒醅宏基因组DNA(不加样本DNA为空白对照)。于90℃下水浴处理10min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。
(4)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(3)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。
(5)形成血红素/G四链体结构。向(4)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM试剂1(血红素)，37℃处理30min。
(6)显色反应。向(5)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H2O2),37℃处理30min。利用紫外分光光度计测定在波长420nm下的吸光值，以不加样本DNA的实验组作为空白对照，显示吸光值是0.623。
(7)根据实施例2所得的标准曲线，计算得样本中酿酒酵母的微生物总量为6.10log10CFU/mL。
(8)通过荧光定量法(定量步骤和材料同实施例11(6))对上述同一酒醅样本中的酿酒酵母进行定量，结果显示酿酒酵母的微生物总量为6.12log10 CFU/mL，与上述方法测定的定量结果基本一致(变异系数，CV＝0.003)。
实施例8：基于不提取样本基因组的酿酒酵母绝对定量方法
(1)酿酒酵母菌液根据实施例4中的培养方法获得，微生物菌浓通过平板计数法测定。
(2)通过10倍梯度稀释(1)中的酿酒酵母菌液
(3)使用酿酒酵母的探针进行显色反应。信号探针的序列为GGGTGGGTGGGTGGGTGGACTCTGGACATGC(SEQ ID NO.1)，淬灭探针的序列为GCATGTCCAGAGTCCACCCA(SEQ ID NO.2)。
(4)信号探针与样本DNA形成双链。将向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入10μL不同稀释度的菌液(不加样本菌液为空白对照)。于沸水浴中处理20min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。
(5)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(4)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。
(6)形成血红素/G四链体结构。向(5)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM的试剂1(血红素)，37℃处理30min。
(7)显色反应。向(6)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H2O2),37℃处理30min。利用紫外分光光度计测定在波长420nm下的吸光值，以不加样本DNA的实验组作为空白对照。
(8)通过计算吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，如图4所示，R2＝0.99(x的单位是log10 CFU/mL，y的单位是OD420，线性范围为103～107)。证明本发明所提供的试剂盒定量方法的准确性
实施例9：基于不提取样本基因组的微生物绝对定量方法测定葡萄酒样本中酿酒酵母的含量
(1)样本采集于山东烟台某知名葡萄酒生产厂家，样本处理方法如下：1mL样本中加入5mL磷酸缓冲液，3000×g离心10min收集菌体。
(2)洗涤。向(1)中所获得的菌体中加入5mL磷酸缓冲液，12000×g离心2min收集菌体，重复一次。
(3)菌体重悬，将向(2)中所获得的菌体中加入1mL试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)，吹吸混匀。
(4)使用酿酒酵母的探针进行显色反应。信号探针的序列为GGGTGGGTGGGTGGGTGGACTCTGGACATGC(SEQ ID NO.1)，淬灭探针的序列为GCATGTCCAGAGTCCACCCA(SEQ ID NO.2)。
(5)信号探针与样本DNA形成双链。将向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入10μL葡萄发酵菌液(不加样本菌液为空白对照)。于沸水水浴下处理20min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。
(6)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(5)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。
(7)形成血红素/G四链体结构。向(6)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM的试剂1(血红素)，37℃处理30min。
(8)显色反应。向(7)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H2O2),37℃处理30min。利用紫外分光光度计测定在波长420nm下的吸光值，以不加样本DNA的实验组作为空白对照，显示吸光值是0.496。
(9)根据实施例8所得的标准曲线，计算得样本中酿酒酵母总量为4.98log10 CFU/mL。
(10)通过荧光定量PCR(定量步骤和材料同实施例11(6))对上述同一样本中的酿酒酵母进行定量，结果显示酿酒酵母总量为5.15log10 CFU/mL，与上述方法测定的定量结果基本一致(变异系数，CV＝0.024)。
实施例10：基于不提取样本基因组的绝对定量方法测定酒醅样本中酿酒酵母的含量
(1)样本来源于山东景芝镇某酒厂的发酵酒醅，样本处理方法如下：1g样本中加入5mL磷酸缓冲液，3000×g离心10min收集菌体。
(2)洗涤。向(1)中所获得的菌体中加入5mL磷酸缓冲液，12000×g离心2min收集菌体，重复一次。
(3)菌体重悬，将向(2)中所获得的菌体中加入1mL试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)，吹吸混匀。
(4)使用酿酒酵母的探针进行显色反应。信号探针的序列为GGGTGGGTGGGTGGGTGGACTCTGGACATGC(SEQ ID NO.1)，淬灭探针的序列为GCATGTCCAGAGTCCACCCA(SEQ ID NO.2)。
(5)信号探针与样本DNA形成双链。将向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入10μL酒醅菌液(不加样本菌液为空白对照)。于沸水水浴下处理20min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。
(6)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(5)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。
(7)形成血红素/G四链体结构。向(6)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM的试剂1(血红素)，37℃处理30min。
(8)显色反应。向(7)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H2O2),37℃处理30min。利用紫外分光光度计测定在波长420nm下的吸光值，以不加样本DNA的实验组作为空白对照，显示吸光值是0.622。
(9)根据实施例8所得的标准曲线，计算得样本中酿酒酵母总量为6.28log10 CFU/mL，
(10)通过荧光定量PCR(定量步骤和材料同实施例11(6))对上述同一样本中的酿酒酵母进行定量，结果显示酿酒酵母总量为6.12log10 CFU/mL，与上述方法测定的两组数据基本一致(变异系数，CV＝0.018)。
实施例11：微生物定量检测试剂盒与荧光定量PCR检测的结果比较
(1)样本选择来自山东景芝某酒厂发酵终点的三个白酒酒醅样本。
(2)样本处理：
(i)提取三个样本中的总基因组，基因组浓度分别为369ng/μL、590ng/μL、321.89ng/μL。
(ii)1g样本中加入5mL磷酸缓冲液，3000×g离心10min收集菌体。向所获得的菌体中加入5mL磷酸缓冲液，12000×g离心2min收集菌体，重复一次。菌体重悬，将向所获得的菌体中加入1mL试剂2缓冲液，吹吸混匀。
(3)使用酿酒酵母的探针进行显色反应。信号探针的序列为GGGTGGGTGGGTGGGTGGACTCTGGACATGC(SEQ ID NO.1)，淬灭探针的序列为GCATGTCCAGAGTCCACCCA(SEQ ID NO.2)。
(4)基于不提取基因组的试剂盒定量方法测定。
(i)信号探针与样本DNA形成双链。将向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入10μL酒醅菌液(不加样本菌液为空白对照)。于沸水浴中处理20min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。
(ii)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(i)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。
(iii)形成血红素/G四链体结构。向(ii)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100mM的试剂1(血红素)，37℃处理30min。
(iv)显色反应。向(iii)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H2O2),37℃处理30min。利用紫外分光光度计测定在波长420nm下的吸光值，以不加样本DNA的实验组作为空白对照，显示吸光值是0.618，0.635，0.640。
(v)根据实施例8所得的标准曲线，计算得样本中酿酒酵母总量为6.36±0.12log10CFU/mL。
(5)基于提基因组的试剂盒定量方法测定
(i)信号探针与样本DNA形成双链。向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入4μL酒醅宏基因组DNA(不加样本DNA为空白对照)。于90℃下水浴处理10min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。
(ii)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(i)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。
(iii)形成血红素/G四链体结构。向(ii)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM试剂1(血红素)，37℃处理30min。
(iv)显色反应。向(5)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H2O2),37℃处理30min。利用紫外分光光度计测定在波长420nm下的吸光值，以不加样本DNA的实验组作为空白对照，显示吸光值是0.653，0.645，0.632。
(v)根据实施例5所得的标准曲线，计算得样本中酿酒酵母总量为6.30±0.11log10CFU/mL。
(6)qPCR定量样本中酿酒酵母含量
(i)酿酒酵母菌液根据实施例4中的培养方法获得，微生物菌浓通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例4。
(ii)通过10倍梯度稀释酿酒酵母基因组DNA。
(iii)qPCR的体系为SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA 0.5μL，无菌水补齐20μL。
(iv)qPCR的反应程序：预变性95℃ 5min，循环阶段：95℃ 5s，60℃ 20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。
(v)使用酿酒酵母特异性引物对提取的基因组进行qPCR，引物序列下游序列为GGACTCTGGACATGC(SEQ ID NO.5)，下游序列为ATACCCTTCTTAACACCTGGC(SEQ ID NO.6)。
(vi)通过10倍梯度稀释基因组DNA，建立CT值与酿酒酵母菌浓的标准曲线，如图4所示，R2＝0.99。
(vii)qPCR体系和反应条件同(iii)，(iv)。根据反应结束的CT值，通过所建立的标准曲线计算酿酒酵母在样本中的浓度为6.32±0.081log10 CFU/g。
(7)通过显著性差异分析，结果如图6所示，三种定量方法之间无显著性差异(P<0.05)
实施例12：应用两种不同序列信号探针进行检测的检出限
(1)酿酒酵母菌液根据实施例4中的培养方法获得，微生物菌浓通过平板计数法测定，浓度为7.49log10 CFU/mL基因组的提取同实施例4。
(2)通过10倍梯度稀释酿酒酵母基因组DNA，得到2.49log10 CFU/mL的DNA模板。
(3)本发明所提供的酿酒酵母信号探针的序列为GGGTGGGTGGGTGGGTGGACTCTGGACATGC(SEQ ID NO.1)，淬灭探针的序列为GCATGTCCAGAGTCCACCCA(SEQ ID NO.2)。加入(2)中得到的3.2log10 CFU/mL酿酒酵母基因组DNA进行显色反应。
(4)利用酿酒酵母信号探针序列为(SEQ ID NO.3)GGGATTGGGATTGGGATTGGGGGACTCTGGACATGC，淬灭探针序列为GCATGTCCAGAGTCCCCCAA(SEQ ID NO.4)。加入(2)中得到的3.2log10 CFU/mL酿酒酵母基因组DNA进行显色反应。
(5)信号探针与样本DNA形成双链。将向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入4μL酿酒酵母基因组DNA(不加样本DNA为空白对照)。于90℃下水浴处理10min。分别加入4μL 20μM的不同信号探针之后于55℃下反应30min。
(6)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(5)步骤反应之后的体系中加入分别8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。
(7)形成血红素/G四链体结构。向(6)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM的试剂1(血红素)，37℃处理30min。
(8)显色反应。向(7)反应结束的体系中分别加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H2O2),37℃处理30min。利用紫外分光光度计测定在波长420nm下的吸光值，以不加样本DNA的实验组作为空白对照。
(9)重复(5)(6)(7)(8)步骤9次，比较检测结果的稳定性，如图7所示。基于SEQ IDNO.3的信号序列定量结果的变异系数(CV)为68.92％；基于SEQ ID NO.1的信号序列的定量结果变异系数为7.44％，检测效果稳定。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种酿酒酵母绝对定量的探针及其应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gggtgggtgg gtgggtggac tctggacatg c 31
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gcatgtccag agtccaccca 20
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gggattggga ttgggattgg gggactctgg acatgc 36
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gcatgtccag agtcccccaa 20
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ggactctgga catgc 15
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
atacccttct taacacctgg c 21

Claims (12)

1.一组探针，其特征在于，包括信号探针和淬灭探针；信号探针序列为SEQ ID NO.1所示序列；淬灭探针序列为SEQ ID NO.2所示的序列。
2.检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的信号探针和淬灭探针。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还含有如下任意一种或多种：血红素、缓冲液、2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐、H2O2。
4.一种酿酒酵母定量方法，其特征在于，所述方法使用了权利要求1所述的探针，或者权利要求2-3任一所述的检测试剂盒。
5.根据权利要求4所述的定量方法，其特征在于，所述方法包括：待测样品中DNA发生解链；加入过量信号探针，与待测样本的目标核苷酸片段结合形成双链，使G四链体裸漏在序列之外；加入足量淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构；利用裸漏在外G四链体与血红素反应形成具有过氧化氢酶活性的G四链体/血红素模拟酶，结合过氧化氢酶的活性表征酿酒酵母的生物量。
6.根据权利要求4所述的定量方法，其特征在于，所述方法为绝对定量或者相对定量。
7.根据权利要求6所述的定量方法，其特征在于，所述方法为绝对定量时，还包括：建立过氧化氢酶活性或者与过氧化氢酶活性呈相关性的指标，与酿酒酵母的生物量的标准曲线；检测待测样品时，将检测到的过氧化氢酶活性或者与过氧化氢酶活性呈相关性的指标代入标准曲线，即获得待测样品中的酿酒酵母的生物量。
8.根据权利要求5~7任一所述的定量方法，其特征在于，所述待测样品为含有菌体、基因组或宏基因组等的样品，或者肠道、土壤、水体。
9.根据权利要求8所述的定量方法，其特征在于，所述样品为发酵食品或者取自发酵食品发酵过程中的样品。
10.根据权利要求9所述的定量方法，其特征在于，所述发酵食品为以下任意一种以上：白酒、黄酒、酱油、啤酒、葡萄酒、食醋、发酵茶、传统发酵蔬菜、发酵饮料、酒精饮品、酸奶、干酪、果醋、酒酿、豆豉、乳腐、发酵米面食品。
11.权利要求2-3任一所述试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括：在DNA解链的待测样本中加入过量的信号探针反应一段时间，使信号探针与待测样本中的目标片段结合；然后再加入足量淬灭探针使之与未结合的信号探针的形成双链；再加入血红素，反应一段时间后加入ABTS和H2O2，反应一段时间，检测反应物的吸光值，结合吸光值对样品中酿酒酵母进行定量。
12.一种检测发酵食品、肠道、土壤、水体中酿酒酵母含量的方法，包括利用权利要求1所述的探针，或者权利要求2-3所述的试剂盒；所述发酵食品为以下任意一种以上：白酒、黄酒、酱油、啤酒、葡萄酒、食醋、发酵茶、传统发酵蔬菜、发酵饮料、酒精饮品、酸奶、干酪、果醋、酒酿、豆豉、乳腐、发酵米面食品。
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