CN112538520B - 一种微生物绝对定量方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微生物绝对定量方法及其应用，属于生物领域、发酵领域、检测领域。本发明为避免使用高额设备，如PCR仪，通过信号探针和淬灭探针组合的方式实现微生物定量。本发明的方法用于检测和微生物定量时，不需要昂贵仪器的检测流程，解决了目前的微生物定量手段均依赖较昂贵的仪器，在实际用于过程中十分受限制的问题。进一步，本发明能够实现快速微生物检测，样品不必须进行核酸提取，仅需要将样本中的微生物洗脱于缓冲液中，直接进行后续实验。基于本发明的方法、探针、检测试剂盒用于不同类型的微生物定量，具有快速、方便、便宜、准确的特点。

Description

一种微生物绝对定量方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种微生物绝对定量方法及其应用，属于生物领域、发酵领域、检测领域。
背景技术
传统发酵食品酿造过程中有复杂的微生物菌群参与，包括乳酸菌杆菌属，芽孢杆菌属在内的细菌，酿酒酵母等在内的真菌。这些微生物与最终产品的品质密切相关，在发酵过程中，微生物发挥各自的作用，经过一系列的降解和合成相关的生理生化反应，将原料中的淀粉，蛋白质等大分子转化为醇类，醛类，酸类，酯类等风味成分，赋予产品独特的风味和感官特征。因此，实时跟踪发酵过程中不同功能微生物的生长变化趋势对发酵过程控制，酿造工艺优化具有重要的指导意义。
目前，解析食品酿造样本中微生物的主要方法为扩增子测序技术，使用相对保守的16S rRNA基因以及ITS基因序列设计引物，通过扩增、二代测序的方法研究细菌群落和真菌群落微生物组成。但是目前该方法在生产应用中存在以下问题：第一、实时性。扩增子测序流程复杂，需要进行样本DNA提取、DNA质控、扩增、建库、测序、分析等步骤，整个过程需要数天来完成；第二、便捷性。扩增子测序流程需要繁琐的操作步骤，而且需要保证中间环节不能出现任何问题。第三、价格昂贵。扩增子测序流程中建库试剂、测序仪器均较为昂贵，在每个生产工厂实现测序平台的搭建较为困难。四、准确性。扩增子测序所得到的数据只能通过相对定量的形式表征微生物的含量，根据文献报道(Vandeputte D,Kathagen G,D’hoeH,Vieira-Silva S,Colomer M,Sabino J,Wang J,Tito R,Commer L,Darzi Y,VermeireS,Falony G,Raes J.2017.Quantitative microbiome profiling links gut communityvariation to microbial load.Nature 551:507-511.)，相对定量所观测到的微生物动态变化趋势与绝对定量结果并不相符，将会对下游的数据分析和结果判断产生误差。
也有一些方法是对传统发酵食品酿造过程中单一微生物进行定量，但是通常主要通过平板涂布技术、荧光定量PCR等方法进行定量跟踪，均存在不足之处，例如平板涂布法时效性较差、荧光定量PCR法依赖高额的仪器以及精密的实验操作环境。
发明内容
本发明的一种用于微生物绝对定量的方法、试剂盒及应用，解决了如下的至少一个技术问题：(1)现有的方法无法实现微生物的实时检测；(2)现有定量方法在操作流程复杂；(3)现有定量方法需要高额的仪器设备和/或严格的操作环境；(4)现有定量方法无法实现微生物的绝对定量。
本发明的第一个目的是提供一种微生物定量方法，所述方法包括：待测样品中DNA发生解链；加入过量信号探针，与待测样本的目标核苷酸片段结合形成双链，使G四链体裸漏在序列之外；加入足量淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构；利用裸漏在外G四链体与血红素反应形成具有过氧化氢酶活性的G四链体/血红素模拟酶，结合过氧化氢酶的活性表征微生物的生物量；其中，所述方法中不需要使用仪器使待测样品中DNA发生扩增。
在一种实施方式中，所述待测样品为含有菌体、基因组或宏基因组等的样品。可选地，所述待测样品为发酵食品成品或者取自发酵食品发酵过程中的样品；可选地，待测样本进行离心、收集菌体等预处理后再进行后续测定。
优选地，收集该样品中的菌体后不经基因组提取，直接进行DNA解链处理。
在一种实施方式中，所述方法为绝对定量方法，还包括：建立过氧化氢酶活性(或者与过氧化氢酶活性呈相关性的指标，比如催化过氧化氢氧化ABTS生成ABTS+后溶液在波长420nm下的吸光值)与微生物的生物量的标准曲线；检测待测样品时，将检测到的过氧化氢酶活性代入标准曲线，即获得待测样品中的微生物的生物量。
在一种实施方式中，所述方法为相对定量方法，还包括：检测多个样品，根据不同样本检测得到的过氧化氢酶活性的相对比值确定该多个不同样本中微生物的生物量的相对值。
在一种实施方式中，所述样品为发酵食品或者取自发酵食品发酵过程中的样品，或者肠道、土壤、水体等环境样本。
在一种实施方式中，所述发酵食品为以下任意一种以上：白酒、黄酒、酱油、啤酒、葡萄酒、食醋、发酵茶、传统发酵蔬菜、发酵饮料、酒精饮品、酸奶、干酪、果醋、酒酿、豆豉、乳腐、发酵米面食品等。
在一种实施方式中，所述待测样品中DNA发生解链，是采用高温方式进行。可选地，是将待测样品在高于90℃温度下处理。可以是金属浴、水浴、烘箱、保温仪等任意一种能提供对应温度的环境。
在一种实施方式中，所述解链是在缓冲液中进行。可选地，所述缓冲液可以是Tris-HCl缓冲液，还含有KCl、NH4Cl、NaCl中的任意一种或者多种。可选地，所述缓冲液为Tris-HCl，KCl，pH＝7.9。
在一种实施方式中，所述过量是指，加入量高于能与待测样本的目标核苷酸片段全部结合形成双链时所需要的信号探针的量。具体用量，本领域技术人员可以结合本领域常识或具体的待测样本来确定，或者通过预实验来确定。
在一种实施方式中，所述过量是指，超过1010个拷贝的信号探针。
在一种实施方式中，所述信号探针与待测样本的目标核苷酸片段结合形成双链，是在50-60℃温度范围下进行的。
在一种实施方式中，所述足量是指，加入量足以与全部未结合的信号探针形成双链时所需要的淬灭探针的量。具体用量，本领域技术人员可以结合本领域常识来确定或具体的待测样本来确定，或者通过预实验来确定。
在一种实施方式中，所述足量是指，信号探针的双倍量。
在一种实施方式中，所述加入足量淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，是在能使淬灭探针与未结合的信号探针形成双链的温度下进行；本领域技术人员可以结合本领域常识来确定或具体的待测样本来确定。
在一种实施方式中，所述利用裸漏在外G四链体与血红素反应形成具有过氧化氢酶活性的G四链体/血红素模拟酶，结合过氧化氢酶的活性表征微生物的生物量，是指在体系中加入血红素反应后，再加入ABTS和H2O2，然后通过反应物的吸光值来表征过氧化氢酶活性。
在一种实施方式中，所述吸光值是在波长420nm下的吸光值。
在一种实施方式中，所述定量方法，具体是：
(1)待测样品进行DNA解链处理；
(2)加入信号探针，于55℃反应30min；
(3)加入淬灭探针，于55℃反应30min；
(4)加入血红素，于37℃反应30min；
(5)加入2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和H2O2，于37℃温度反应30min；
(6)检测反应物在波长420nm下的吸光值；
(7)结合吸光值对样品中微生物进行定量。
在一种实施方式中，所述定量方法，还包括：配置不同已知微生物含量的样品，测定不同样品经上述方法处理后得到的吸光值；绘制吸光值与不同微生物含量的标准曲线；将待测样品经经上述方法处理后得到的吸光值代入标准曲线，即获得待测样品中微生物含量。
在一种实施方式中，所述微生物为以下任意一种或者多种类型：细菌、真菌、酿酒酵母、芽孢杆菌属、乳杆菌属。
在一种实施方式中，所述微生物定量方法，是指待测样品中所有细菌微生物的定量方法、所有真菌微生物的定量方法、所有酿酒酵母的定量方法、所有芽孢杆菌属微生物的定量方法、和/或所有乳杆菌属微生物的定量方法。
在一种实施方式中，当定量细菌微生物时，信号探针序列为SEQ ID NO.1所示(GGGTGGGTGGGTGGGTACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGG)或SEQ ID NO.3所示(GGGATTGGGATTGGGATTGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGG)；对应的淬灭探针序列分别为SEQ ID NO.2所示(CCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTACCCA)或SEQ ID NO.4所示(CCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCCCAA)。
当定量芽孢杆菌属微生物时，信号探针序列为SEQ ID NO.5所示(GGGTGGGTGGGTGGGTAAAGCTGATTTGAAAGTCATTGGAGAT)或SEQ ID NO.7所示(GGGATTGGGATTGGGATTGGGAAAGCTGATTTGAAAGTCATTGGAGAT)；对应的淬灭探针序列分别为SEQ ID NO.6所示(ATCTCCAATGACTTTCAAATCAGCTTTACCCA)或SEQ ID NO.8所示(ATCTCCAATGACTTTCAAATCAGCTTTCCCAA)。
当定量乳杆菌属微生物时，信号探针序列为SEQ ID NO.9所示(GGGTGGGTGGGTGGGTGGGTTAACAAGGTAGCCGTAG)或SEQ ID NO.11所示(GGGATTGGGATTGGGATTGGGTAACAAGGTAGCCGTAG)；对应的淬灭探针序列分别为SEQ ID NO.10所示(CTACGGCTACCTTGTTAACCCAACCCA)或SEQ ID NO.12所示(CTACGGCTACCTTGTTACCCAA)。
当定量酿酒酵母时，信号探针序列为SEQ ID NO.13所示(GGGTGGGTGGGTGGGTGGACTCTGGACATGC)或SEQ ID NO.15所示(GGGATTGGGATTGGGATTGGGGGACTCTGGACATGC)；对应的淬灭探针序列分别为SEQ ID NO.14所示(GCATGTCCAGAGTCCACCCA)或SEQ ID NO.16所示(GCATGTCCAGAGTCCCCCAA)。
当定量真菌微生物时，信号探针序列为SEQ ID NO.17所示(GGGTGGGTGGGTGGGTGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG)或SEQ ID NO.19所示(GGGATTGGGATTGGGATTGGGGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG)；对应的淬灭探针序列分别为SEQ ID NO.18所示(CTTTTCCTCCGCTTATTGATATGCACCCA)或SEQ ID NO.20所示(CTTTTCCTCCGCTTATTGATATGCCCCAA)。
本发明的第二个目的是提供一种用于多种微生物绝对定量的检测试剂盒，所述检测试剂盒能够用于实现待测样本中如下至少两种类型的微生物的检测：所有的细菌微生物、所有的真菌、所有的酿酒酵母、所有的芽孢杆菌属、所有的乳杆菌属。
所述检测试剂盒中，至少含有如下2套可以检测不同种属的探针；每套探针中包括信号探针和淬灭探针；
(1)细菌探针：信号探针序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3，对应的淬灭探针序列为SEQ ID NO.2所示或SEQ ID NO.4所示。
(2)芽孢杆菌探针：信号探针序列为SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7，对应的淬灭探针序列为SEQ ID NO.6所示或SEQ ID NO.8所示。
(3)乳杆菌属探针：信号探针序列为SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.11，对应的淬灭探针序列为SEQ ID NO.10所示或SEQ ID NO.12所示。
(4)酿酒酵母探针：信号探针序列为SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.15，对应的淬灭探针序列为SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16。
(5)真菌探针：信号探针序列为SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.19，对应的淬灭探针序列为SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.20。
在一种实施方式中，所述检测试剂盒还含有如下任意一种或多种：血红素、缓冲液、2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、H2O2。也可以不含有这些试剂，在使用试剂盒时，有操作人员另行准备。
在一种实施方式中，所述检测试剂盒中，缓冲液可以是Tris-HCl缓冲液，还含有KCl、NH4Cl、NaCl中的任意一种或者多种。可选地，所述缓冲液为Tris-HCl，KCl，pH＝7.9。
在一种实施方式中，所述检测试剂盒是微生物绝对定量试剂盒，所述试剂盒同时包括四种试剂(试剂1，试剂2，试剂3，试剂4)和两套以上微生物定量探针(信号探针，淬灭探针)；所述的试剂1包括血红素；所述的试剂2包括缓冲液；所述的试剂3包括2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)；所述的试剂4包括H2O2。
在一种实施方式中，所述检测试剂盒中，试剂或探针可以是液体状态或者固体状态，使用时本领域技术人员可以常规地调整到适合的浓度。
本发明的第三个目的是提供所述试剂盒的使用方法。
在一种实施方式中，所述使用方法包括：在DNA解链的待测样本中加入检测对应微生物的过量的信号探针反应一段时间，使信号探针与待测样本中的目标片段结合；然后在加入对应微生物的足量淬灭探针使之与未结合的信号探针的形成双链；再加入血红素，反应一段时间后加入ABTS和H2O2，反应一段时间，检测反应物的吸光值，结合吸光值对样品中对应微生物进行定量。
在一种实施方式中，所述方法包括，将试剂和探针调整到适合使用的浓度。
(1)待测样品进行DNA解链处理；(2)加入信号探针，于55℃反应30min；(3)加入淬灭探针，于55℃反应30min；(4)加入血红素，于37℃反应30min；(5)加入2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和H2O2，于37℃温度反应30min；(6)检测反应物在波长420nm下的吸光值；(7)结合吸光值对样品中微生物进行定量。
本发明的第四个目的是提供所述检测方法或试剂盒在微生物定量中的应用。
在一种实施方式中，所述应用是用于发酵食品技术领域，或者肠道、土壤、水体等环境微生物检测领域；可选地，所述发酵食品为以下任意一种以上：白酒、黄酒、酱油、啤酒、葡萄酒、食醋、发酵茶、传统发酵蔬菜、发酵饮料、酒精饮品、酸奶、干酪、果醋、酒酿、豆豉、乳腐、发酵米面食品等。
在一种实施方式中，所述应用时，待测样本可以为含有菌体、基因组或宏基因组等的样品。可选地，所述待测样品为发酵食品成品或者取自发酵食品发酵过程中的样品；可选地，待测样本进行离心、收集菌体等预处理后再进行后续测定。优选地，收集该样品中的菌体后不经基因组提取，直接进行DNA解链处理。
有益效果：
本发明为避免使用高额设备，如PCR仪，通过信号探针和淬灭探针组合的方式实现微生物定量。本发明的方法用于检测和微生物定量时，不需要昂贵仪器的检测流程，解决了目前的微生物定量手段均依赖较昂贵的仪器，在实际用于过程中十分受限制的问题。
进一步，本发明能够实现快速微生物检测，样品不必须进行核酸提取，仅需要将样本中的微生物洗脱于缓冲液中，直接进行后续实验。同时，与荧光定量PCR定量结果相比，本发明所得到的定量结果无显著性差异。
进一步，本发明还提供一种用于五类微生物绝对定量试剂盒，利用该试剂盒采用本发明的方法进行检测，可在2.5h内完成定量工作。
综上，基于本发明的方法、探针及检测试剂盒，用于微生物定量，具有快速、便捷、便宜、准确的特点。
附图说明
图1：基于基因组提取的细菌微生物定量的标准曲线。(A)以Escherichia coli基因组为梯度稀释标准品；(B)以Bacillus velezensis基因组为梯度稀释标准品。
图2：基于基因组提取的芽孢杆菌属微生物定量的标准曲线。(A)以Bacilluscoagulans基因组为梯度稀释标准品；(B)以Bacillus licheniformis基因组为梯度稀释标准品。
图3：基于基因组提取的乳杆菌属微生物定量的标准曲线。(A)以Lactobacillusbuchneri基因组为梯度稀释标准品；(B)以Lactobacillusplantarum基因组为梯度稀释标准品。
图4：基于基因组提取的酿酒酵母微生物定量试剂盒的标准曲线。
图5：基于基因组提取的真菌微生物定量的标准曲线。(A)以Saccharomycescerevisiae基因组为梯度稀释标准品；(B)以Saccharomycopsisfibuligera基因组为梯度稀释标准品。
图6：基于不提取样本基因组的细菌微生物定量的标准曲线。(A)以Escherichiacoli基因组为梯度稀释标准品；(B)以Bacillus velezensis基因组为梯度稀释标准品。
图7：基于不提取样本基因组的芽孢杆菌属微生物定量的标准曲线。(A)以Bacillus coagulans基因组为梯度稀释标准品；(B)以Bacillus licheniformis基因组为梯度稀释标准品。
图8：基于不提取样本基因组的乳杆菌属微生物定量的标准曲线。(A)以Lactobacillus buchneri基因组为梯度稀释标准品；(B)以Lactobacillusplantarum基因组为梯度稀释标准品。
图9：基于不提取样本基因组的酿酒酵母定量的标准曲线。
图10：基于不提取样本基因组的真菌菌微生物定量的标准曲线。(A)以Saccharomyces cerevisiae基因组为梯度稀释标准品；(B)以Saccharomycopsisfibuligera基因组为梯度稀释标准品。
图11：细菌qPCR标准曲线。
图12：芽孢杆菌qPCR标准曲线。
图13：乳杆菌qPCR标准曲线。
图14：酿酒酵母qPCR标准曲线。
图15：真菌qPCR标准曲线。
图16：比较基于基因组提取的细菌微生物定量实验、基于不提取样本基因组的细菌微生物定量实验和qPCR细菌微生物定量实验；其中，(A)基于基因组提取的细菌微生物定量实验，(B)基于不提取样本基因组的细菌微生物定量实验，(C)qPCR细菌微生物定量实验。
图17：比较基于基因组提取的芽孢杆菌属微生物定量实验、基于不提取样本基因组的芽孢杆菌属微生物定量实验和qPCR芽孢杆菌属微生物定量实验；其中，(A)基于基因组提取的芽孢杆菌属微生物定量实验，(B)基于不提取样本基因组的芽孢杆菌属微生物定量实验，(C)qPCR芽孢杆菌属微生物定量实验。
图18：比较基于基因组提取的乳酸杆菌属微生物定量试剂盒定量实验、基于不提取样本基因组的乳酸杆菌属微生物定量实验和qPCR乳酸杆菌属微生物定量实验；其中，(A)基于基因组提取的乳酸杆菌属微生物定量实验，(B)基于不提取样本基因组的乳酸杆菌属微生物定量实验，(C)qPCR乳酸杆菌属微生物定量实验。
图19：比较基于基因组提取的酿酒酵母定量实验、基于不提取样本基因组的酿酒酵母定量实验和qPCR酿酒酵母定量实验；其中，(A)基于基因组提取的酿酒酵母定量实验，(B)基于不提取样本基因组的酿酒酵母定量实验，(C)qPCR酿酒酵母定量实验。
图20：比较基于基因组提取的真菌微生物定量实验、基于不提取样本基因组的真菌微生物定量实验和qPCR真菌微生物定量实验；其中，(A)基于基因组提取的真菌微生物定量实验，(B)基于不提取样本基因组的真菌微生物定量实验，(C)qPCR真菌微生物定量实验。
图21：比较基于SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(A)和SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4(B)探针检测结果的稳定性(细菌探针)。
图22：比较基于SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6(A)和SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8(B)探针检测结果的稳定性(芽孢杆菌探针)。
图23：比较基于SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10(A)和SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12(B)探针检测结果的稳定性(乳杆菌属探针)。
图24：比较基于SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14(A)和SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16(B)探针检测结果的稳定性(酿酒酵母探针)。
图25：比较基于SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18(A)和SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20(B)探针检测结果的稳定性(真菌探针)。
图26：细菌探针特异性验证。
图27：芽孢杆菌属探针特异性验证。
图28：乳杆菌属探针特异性验证。
图29：酿酒酵母探针特异性验证。
图30：真菌探针特异性验证。
具体实施方式：
实施例1：酒醅样本中微生物的绝对定量
(1)样本基因组提取：
参考Song Z W,Du H,ZhangY,XuY.Unraveling core functional microbiota intraditional solid-state fermentationby high-throughput amplicons andmetatranscriptomics sequencing.Frontiers in microbiology 2017；8:1294的MATERIALS AND METHODS中的方法，提取来源于山东省景芝镇的酒醅样本中的宏基因组，基因组浓度为100.02ng/μL。
(2)使用多组探针对样本进行显色反应
细菌域的探针：信号探针的序列为GGGTGGGTGGGTGGGTACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGG(SEQ ID NO.1)，淬灭探针的序列为CCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTACCCA(SEQ ID NO.2)。
芽孢杆菌属的探针：信号探针序列为SEQ ID NO.5所示(GGGTGGGTGGGTGGGTAAAGCTGATTTGAAAGTCATTGGAGAT)，淬灭探针序列为SEQ ID NO.6所示(ATCTCCAATGACTTTCAAATCAGCTTTACCCA)。
乳杆菌属的探针：信号探针序列为SEQ ID NO.9所示(GGGTGGGTGGGTGGGTGGGTTAACAAGGTAGCCGTAG)；淬灭探针序列为SEQ ID NO.10所示(CTACGGCTACCTTGTTAACCCAACCCA)。
酿酒酵母的探针：信号探针序列为SEQ ID NO.13所示(GGGTGGGTGGGTGGGTGGACTCTGGACATGC)；淬灭探针序列为SEQ ID NO.14所示(GCATGTCCAGAGTCCACCCA)。
真菌的探针：信号探针序列为SEQ ID NO.17所示(GGGTGGGTGGGTGGGTGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG)；淬灭探针序列为SEQ ID NO.18所示(CTTTTCCTCCGCTTATTGATATGCACCCA)。
其中，显色反应的具体步骤如下：
(A)信号探针与样本DNA形成双链。向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入4μL酒醅宏基因组DNA(不加样本DNA为空白对照)。于90℃下水浴处理10min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。
(B)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(A)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。
(C)形成血红素/G四链体结构。向(B)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM试剂1(血红素)，37℃处理30min。
(D)显色反应。向(C)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H2O2),37℃处理30min。利用紫外分光光度计测定在波长420nm下的吸光值，以不加样本DNA的实验组作为空白对照。
同时，还可以通过测定吸光值与不同已知浓度的微生物菌浓之间的线性关系，根据吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线。
(3)定量结果
细菌微生物定量结果。显示的吸光值为0.678，根据吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，可换算得到样本中总细菌微生物的含量。根据实施例2(一)所得的标准曲线，计算得样本中细菌微生物总量为6.42log10CFU/mL，根据实施例2(二)所得的标准曲线，计算得样本中细菌微生物总量为6.37log10CFU/mL。通过荧光定量PCR法(实验方法和步骤同实施例13(10))对上述同一样本中的细菌进行定量，结果显示细菌微生物总量为6.33log10CFU/mL，与上述方法测定的两组数据基本一致(变异系数，CV＝0.007)。
芽孢杆菌属微生物定量结果。显示的吸光值为0.425，根据吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，可换算得到样本中芽孢杆菌的含量。根据实施例3(一)所得的标准曲线，计算得样本中芽孢杆菌属微生物总量为4.13log10CFU/mL，根据实施例3(二)所得的标准曲线，计算得样本中芽孢杆菌属微生物总量为3.96log10CFU/mL。通过荧光定量PCR法(实验方法和步骤同实施例13(11))对上述同一样本中的芽孢杆菌属微生物进行定量，结果显示芽孢杆菌属微生物总量为4.06log10CFU/mL，与上述方法测定的两组数据基本一致(变异系数，CV＝0.02)。
乳杆菌属微生物定量结果。显示的吸光值为0.62，根据吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，可换算得到样本中乳杆菌属的含量。根据实施例4(一)所得的标准曲线，计算得样本中乳杆菌属微生物总量为5.53log10CFU/mL，根据实施例4(二)所得的标准曲线，计算得样本中乳杆菌属微生物总量为5.78log10CFU/mL。通过荧光定量PCR法(实验方法和步骤同实施例13(12))对上述同一酒醅样本中的乳杆菌属微生物进行定量，结果显示乳杆菌属微生物总量为5.62log10CFU/mL，与上述方法测定的两组数据基本一致(变异系数，CV＝0.016)。
酿酒酵母定量结果。显示的吸光值为0.623，根据吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，可换算得到样本中酿酒酵母的含量。根据实施例5(一)所得的标准曲线，计算得样本中酿酒酵母总量为6.10log10CFU/mL。通过荧光定量PCR法(实验方法和步骤同实施例13(13))对上述同一酒醅样本中的酿酒酵母进行定量，结果显示酿酒酵母总量为6.12log10CFU/mL，与上述方法测定的两组数据基本一致(变异系数，CV＝0.0028)。
真菌微生物定量结果。显示的吸光值为0.75，根据吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，可换算得到样本中真菌微生物的含量。根据实施例6(一)所得的标准曲线，计算得样本中真菌微生物总量为6.89log10CFU/mL，根据实施例6(二)所得的标准曲线，计算得样本中真菌微生物总量为7.04log10CFU/mL。通过荧光定量PCR(实验方法和步骤同实施例13(14))法对上述同一酒醅样本中的真菌进行定量，结果显示真菌微生物总量为6.95log10CFU/mL，与上述方法测定的两组数据基本一致(变异系数，CV＝0.01)。
实施例2：细菌微生物定量方法准确性评估
一、对Escherichia coli的定量准确性
(1)Escherichia coli菌液根据实施例30中的培养方法获得，细菌浓度通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例30。
(2)通过10倍梯度稀释Escherichia coli基因组DNA。
(3)使用细菌域的探针，以不同浓度的Escherichia coli基因组DNA进行显色反应。信号探针序列为GGGTGGGTGGGTGGGTACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGG(SEQ ID NO.1)，淬灭探针序列为CCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTACCCA(SEQ ID NO.2)。
其中，显色反应的具体步骤如下：
(A)信号探针与样本DNA形成双链。将向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入4μL不同稀释度的基因组DNA(不加样本DNA为空白对照)。于90℃下水浴处理10min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。
(B)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(A)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。
(C)形成血红素/G四链体结构。向(B)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM的试剂1(血红素)，37℃处理30min。
(D)显色反应。向(C)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H2O2),37℃处理30min。利用紫外分光光度计测定在波长420nm下的吸光值，以不加样本DNA的实验组作为空白对照。
(4)通过计算吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，如图1A所示，R2＝0.99(x的单位是log10 CFU/mL，y的单位是OD420，线性范围为103～107)。证明本发明所提供的试剂盒定量方法的准确性。
二、对Bacillus velezensis的定量准确性
(1)Bacillus velezensis菌液根据实施例30中的培养方法获得，细菌浓度通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例30。
(2)通过10倍梯度稀释Bacillus velezensis基因组DNA。
(3)使用细菌域的探针，以不同浓度的Bacillus velezensis基因组DNA进行显色反应。信号探针序列为GGGTGGGTGGGTGGGTACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGG(SEQ ID NO.1)，淬灭探针序列为CCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTACCCA(SEQ ID NO.2)。
其中，显色反应的具体步骤参照上述的(A)、(B)、(C)、(D)。
(4)通过计算吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，如图1B所示，R2＝0.99(x的单位是lg(CFU/mL)，y的单位是OD420，线性范围为103～107)。证明本发明所提供的试剂盒定量方法的准确性。
实施例3：芽孢杆菌属微生物定量方法准确性评估
一、对Bacillus coagulans的定量准确性
(1)根据实施例30中的培养方法获得Bacillus coagulans菌液，微生物浓度通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例30。
(2)通过10倍梯度稀释Bacillus coagulans基因组DNA。
(3)选择芽孢杆菌属的探针，以不同浓度的Bacillus coagulans基因组DNA为模板进行显色反应。信号探针序列为
GGGTGGGTGGGTGGGTAAAGCTGATTTGAAAGTCATTGGAGAT(SEQ ID NO.5)，淬灭探针序列为TCTCCAATGACTTTCAAATCAGCTTTACCCA(SEQ ID NO.6)。
其中，显色反应的具体步骤参照上一实施例的(A)、(B)、(C)、(D)。
(4)通过计算吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，如图2A所示，R2＝0.99(x的单位是log10 CFU/mL，y的单位是OD420，线性范围为103～107)。证明本发明所提供的试剂盒定量方法的准确性。
二、对Bacillus licheniformis的定量准确性
(1)根据实施例30中的培养方法获得Bacillus licheniformis菌液，微生物浓度通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例30。
(2)通过10倍梯度稀释Bacillus licheniformis基因组DNA。
(3)使用芽孢杆菌属的探针，以不同浓度的Bacillus licheniformis基因组DNA进行显色反应。信号探针序列为GGGTGGGTGGGTGGGTAAAGCTGATTTGAAAGTCATTGGAGAT(SEQ IDNO.5)，淬灭探针序列为TCTCCAATGACTTTCAAATCAGCTTTACCCA(SEQ ID NO.6)。
其中，显色反应的具体步骤参照上述的(A)、(B)、(C)、(D)。
(4)通过计算吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，如图2B所示，R2＝0.99(x的单位是log 10(CFU/mL)，y的单位是OD420，线性范围为103～107)。证明本发明所提供的试剂盒定量方法的准确性。
实施例4：乳杆菌属微生物定量方法准确性评估
一、对Lactobacillus buchneri的定量准确性
(1)Lactobacillus buchneri菌液根据实施例30中的培养方法获得，微生物菌浓通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例30。
(2)通过10倍梯度稀释Lactobacillus buchneri基因组DNA。
(3)使用乳杆菌属的探针，以不同浓度的Lactobacillus buchneri基因组DNA进行显色反应。信号探针的序列为GGGTGGGTGGGTGGGTGGGTTAACAAGGTAGCCGTAG(SEQ ID NO.9)，淬灭探针的序列为CTACGGCTACCTTGTTAACCCAACCCA(SEQ ID NO.10)。
其中，显色反应的具体步骤参照上述的(A)、(B)、(C)、(D)。
(4)通过计算吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，如图3A所示，R2＝0.99(x的单位是log10 CFU/mL，y的单位是OD420，线性范围为103～107)。证明本发明所提供的试剂盒定量方法的准确性。
二、对Lactobacillusplantarum的定量准确性
(1)Lactobacillusplantarum菌液根据实施例30中的培养方法获得，乳杆菌属浓度通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例30。
(2)通过10倍梯度稀释Lactobacillusplantarum基因组DNA。
(3)使用乳杆菌属的探针，以不同浓度的Lactobacillusplantarum基因组DNA进行显色反应。信号探针的序列为GGGTGGGTGGGTGGGTGGGTTAACAAGGTAGCCGTAG(SEQ ID NO.9)，淬灭探针的序列为CTACGGCTACCTTGTTAACCCAACCCA(SEQ ID NO.10)。
其中，显色反应的具体步骤参照上述的(A)、(B)、(C)、(D)。
(4)通过计算吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，如图3B所示，R2＝0.99(x的单位是log10(CFU/mL)，y的单位是OD420，线性范围为103～107)。证明本发明所提供的试剂盒定量方法的准确性。
实施例5：酿酒酵母定量方法准确性评估
(1)酿酒酵母菌液根据实施例30中的培养方法获得，微生物菌浓通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例30。
(2)通过10倍梯度稀释酿酒酵母基因组DNA。
(3)使用酿酒酵母的探针，以不同浓度的酿酒酵母基因组DNA进行显色反应。信号探针的序列为GGGTGGGTGGGTGGGTGGACTCTGGACATGC(SEQ ID NO.13)，淬灭探针的序列为GCATGTCCAGAGTCCACCCA(SEQ ID NO.14)。
其中，显色反应的具体步骤参照上述的(A)、(B)、(C)、(D)。
(4)通过计算吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，如图4所示，R2＝0.99(x的单位是log10 CFU/mL，y的单位是OD420，线性范围为103～107)。证明本发明所提供的试剂盒定量方法的准确性。
实施例6：真菌微生物定量方法准确性评估
一、对Saccharomyces cerevisiae的定量准确性
(1)Saccharomyces cerevisiae菌液根据实施例30中的培养方法获得，微生物菌浓通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例30。
(2)通过10倍梯度稀释Saccharomyces cerevisiae基因组DNA。
(3)使用真菌域的探针，以不同浓度的Saccharomyces cerevisiae基因组DNA进行显色反应。信号探针序列为GGGTGGGTGGGTGGGTGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG(SEQ IDNO.17)，淬灭探针序列为CTTTTCCTCCGCTTATTGATATGCACCCA(SEQ ID NO.18)。
其中，显色反应的具体步骤参照上述的(A)、(B)、(C)、(D)。
(4)通过计算吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，如图5A所示，R2＝0.99(x的单位是log10 CFU/mL，y的单位是OD420，线性范围为103～107)。证明本发明所提供的试剂盒定量方法的准确性。
二、对Saccharomycopsisfibuligera的定量准确性
(1)Saccharomycopsisfibuligera菌液根据实施例30中的培养方法获得，微生物菌浓通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例30。
(2)通过10倍梯度稀释Saccharomycopsisfibuligera基因组DNA。
(3)使用真菌域的探针，以不同浓度的Saccharomycopsisfibuligera基因组DNA进行显色反应。信号探针序列为GGGTGGGTGGGTGGGTGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG(SEQ IDNO.17)，淬灭探针序列为CTTTTCCTCCGCTTATTGATATGCACCCA(SEQ ID NO.18)。
其中，显色反应的具体步骤参照上述的(A)、(B)、(C)、(D)。
(4)通过计算吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，如图5B所示，R2＝0.99(x的单位是log10(CFU/mL)，y的单位是OD420，线性范围为103～107)。证明本发明所提供的试剂盒定量方法的准确性。
实施例7：基于不提取样本基因组的细菌域微生物绝对定量方法
一、对Escherichia coli的定量准确性
(1)Escherichia coli菌液根据实施例30中的培养方法获得，细菌浓度通过平板计数法测定。
(2)通过10倍梯度稀释(1)中的Escherichia coli菌液
(3)使用细菌域的探针进行显色反应。信号探针的序列为GGGTGGGTGGGTGGGTACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGG(SEQ ID NO.1)，淬灭探针的序列为CCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTACCCA(SEQ ID NO.2)。
其中，显色反应的具体步骤参照上述的(A)、(B)、(C)、(D)。
(4)通过计算吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，如图6A所示，R2＝0.99(x的单位是log10 CFU/mL，y的单位是OD420，线性范围为103～107)。证明本发明所提供的试剂盒定量方法的准确性
二、对Bacillus velezensis的定量准确性
(1)Bacillus velezensis菌液根据实施例30中的培养方法获得，细菌浓度通过平板计数法测定。
(2)通过10倍梯度稀释(1)中的Bacillus velezensis菌液
(3)使用细菌域的探针进行显色反应。信号探针的序列为GGGTGGGTGGGTGGGTACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGG(SEQ ID NO.1)，淬灭探针的序列为CCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTACCCA(SEQ ID NO.2)。
其中，显色反应的具体步骤参照上述的(A)、(B)、(C)、(D)。
(4)通过计算吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，如图6B所示，R2＝0.99(x的单位是log10 CFU/mL，y的单位是OD420，线性范围为103～107)。证明本发明所提供的试剂盒定量方法的准确性
实施例8：基于不提取样本基因组的芽孢杆菌绝对定量方法
一、对Bacillus coagulans的定量准确性
(1)根据实施例30中的培养方法获得Bacillus coagulans菌液，微生物浓度通过平板计数法测定。
(2)通过10倍梯度稀释(1)中的Bacillus coagulans菌液
(3)使用芽孢杆菌属的探针进行显色反应。信号探针序列为
GGGTGGGTGGGTGGGTAAAGCTGATTTGAAAGTCATTGGAGAT(SEQ ID NO.5)，淬灭探针序列为TCTCCAATGACTTTCAAATCAGCTTTACCCA(SEQ ID NO.6)。
其中，显色反应的具体步骤参照上述的(A)、(B)、(C)、(D)。
(4)通过计算吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，如图7A所示，R2＝0.99(x的单位是log10 CFU/mL，y的单位是OD420，线性范围为103～107)。证明本发明所提供的试剂盒定量方法的准确性
二、对Bacillus velezensis的定量准确性
(1)Bacillus velezensis菌液根据实施例30中的培养方法获得，芽孢杆菌浓度通过平板计数法测定。
(2)通过10倍梯度稀释(1)中的Bacillus velezensis菌液
(3)使用芽孢杆菌属的探针进行显色反应。信号探针序列为
GGGTGGGTGGGTGGGTAAAGCTGATTTGAAAGTCATTGGAGAT(SEQ ID NO.5)，淬灭探针序列为TCTCCAATGACTTTCAAATCAGCTTTACCCA(SEQ ID NO.6)。
其中，显色反应的具体步骤参照上述的(A)、(B)、(C)、(D)。
(4)通过计算吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，如图7B所示，R2＝0.99(x的单位是log10 CFU/mL，y的单位是OD420，线性范围为103～107)。证明本发明所提供的试剂盒定量方法的准确性。
实施例9：基于不提取样本基因组的乳杆菌属微生物绝对定量方法
一、对Lactobacillus buchneri的定量准确性
(1)Lactobacillus buchneri菌液根据实施例30中的培养方法获得，微生物菌浓通过平板计数法测定。
(2)通过10倍梯度稀释(1)中的Lactobacillus buchneri菌液
(3)使用乳杆菌域的探针进行显色反应。信号探针的序列为
GGGTGGGTGGGTGGGTGGGTTAACAAGGTAGCCGTAG(SEQ ID NO.9)，淬灭探针的序列为CTACGGCTACCTTGTTAACCCAACCCA(SEQ ID NO.10)。
其中，显色反应的具体步骤参照上述的(A)、(B)、(C)、(D)。
(4)通过计算吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，如图8A所示，R2＝0.99(x的单位是log10 CFU/mL，y的单位是OD420，线性范围为103～107)。证明本发明所提供的试剂盒定量方法的准确性
二、对Lactobacillusplantarum的定量准确性
(1)Lactobacillusplantarum菌液根据实施例30中的培养方法获得，微生物菌浓通过平板计数法测定。
(2)通过10倍梯度稀释(1)中的Lactobacillusplantarum菌液
(3)使用乳杆菌属的探针进行显色反应。信号探针的序列为
GGGTGGGTGGGTGGGTGGGTTAACAAGGTAGCCGTAG(SEQ ID NO.9)，淬灭探针的序列为CTACGGCTACCTTGTTAACCCAACCCA(SEQ ID NO.10)。
其中，显色反应的具体步骤参照上述的(A)、(B)、(C)、(D)。
(4)通过计算吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，如图8B所示，R2＝0.99(x的单位是log10 CFU/mL，y的单位是OD420，线性范围为103～107)。证明本发明所提供的试剂盒定量方法的准确性。
实施例10：基于不提取样本基因组的酿酒酵母绝对定量方法
(1)酿酒酵母菌液根据实施例30中的培养方法获得，微生物菌浓通过平板计数法测定。
(2)通过10倍梯度稀释(1)中的酿酒酵母菌液
(3)使用酿酒酵母的探针进行显色反应。信号探针的序列为
GGGTGGGTGGGTGGGTGGACTCTGGACATGC(SEQ ID NO.13)，淬灭探针的序列为GCATGTCCAGAGTCCACCCAA(SEQ ID NO.14)。
其中，显色反应的具体步骤参照上述的(A)、(B)、(C)、(D)。
(4)通过计算吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，如图9所示，R2＝0.99(x的单位是log10 CFU/mL，y的单位是OD420，线性范围为103～107)。证明本发明所提供的试剂盒定量方法的准确性
实施例11：基于不提取样本基因组的真菌域微生物绝对定量方法
一、对Saccharomyces cerevisiae的定量准确性
(1)Saccharomyces cerevisiae菌液根据实施例30中的培养方法获得，真菌浓度通过平板计数法测定。
(2)通过10倍梯度稀释(1)中的Saccharomyces cerevisiae菌液。
(3)使用真菌域的探针进行显色反应。信号探针序列为
GGGTGGGTGGGTGGGTGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG(SEQ ID NO.17)，淬灭探针序列为CTTTTCCTCCGCTTATTGATATGCACCCA(SEQ ID NO.18)。
其中，显色反应的具体步骤参照上述的(A)、(B)、(C)、(D)。
(4)通过计算吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，如图10A所示，R2＝0.99(x的单位是log10 CFU/mL，y的单位是OD420，线性范围为103～107)。证明本发明所提供的试剂盒定量方法的准确性。
二、对Saccharomycopsisfibuligera的定量准确性
(1)Saccharomycopsisfibuligera菌液根据实施例30中的培养方法获得，真菌浓度通过平板计数法测定。
(2)通过10倍梯度稀释(1)中的Saccharomycopsisfibuligera菌液。
(3)使用真菌域的探针进行显色反应。信号探针序列为
GGGTGGGTGGGTGGGTGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG(SEQ ID NO.17)，淬灭探针序列为CTTTTCCTCCGCTTATTGATATGCACCCA(SEQ ID NO.18)。
其中，显色反应的具体步骤参照上述的(A)、(B)、(C)、(D)。
(4)通过计算吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，如图10B所示，R2＝0.99(x的单位是log10 CFU/mL，y的单位是OD420，线性范围为103～107)。证明本发明所提供的试剂盒定量方法的准确性。
实施例12：基于不提取样本基因组的微生物绝对定量方法测定酒醅样本中微生物的含量
(1)样本菌体的获取：
样本来源于山东景芝镇某酒厂的发酵酒醅，样本处理方法如下：1g样本中加入5mL磷酸缓冲液，3000×g离心10min收集菌体。
洗涤。向(1)中所获得的菌体中加入5mL磷酸缓冲液，12000×g离心2min收集菌体，重复一次。
菌体重悬，将向(2)中所获得的菌体中加入1mL试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)，吹吸混匀。
(2)使用多组探针对样本进行显色反应
细菌域的探针：信号探针的序列为
GGGTGGGTGGGTGGGTACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGG(SEQ ID NO.1)，淬灭探针的序列为CCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTACCCA(SEQ ID NO.2)。
芽孢杆菌属的探针：信号探针序列为SEQ ID NO.5所示(GGGTGGGTGGGTGGGTAAAGCTGATTTGAAAGTCATTGGAGAT)，淬灭探针序列为SEQ ID NO.6所示(ATCTCCAATGACTTTCAAATCAGCTTTACCCA)。
乳杆菌属的探针：信号探针序列为SEQ ID NO.9所示(GGGTGGGTGGGTGGGTGGGTTAACAAGGTAGCCGTAG)；淬灭探针序列为SEQ ID NO.10所示(CTACGGCTACCTTGTTAACCCA)。
酿酒酵母的探针：信号探针序列为SEQ ID NO.13所示(GGGTGGGTGGGTGGGTGGACTCTGGACATGC)；淬灭探针序列为SEQ ID NO.14所示(GCATGTCCAGAGTCCACCCA)。
真菌的探针：信号探针序列为SEQ ID NO.17所示(GGGTGGGTGGGTGGGTGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG)；淬灭探针序列为SEQ ID NO.18所示(CTTTTCCTCCGCTTATTGATATGCACCCA)。
其中，显色反应的具体步骤如下：
(A)信号探针与样本DNA形成双链。将向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入10μL酒醅菌液(不加样本菌液为空白对照)。于沸水水浴下处理20min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。
(B)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(A)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。
(C)形成血红素/G四链体结构。向(B)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM的试剂1(血红素)，37℃处理30min。
(D)显色反应。向(C)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H2O2),37℃处理30min。利用紫外分光光度计测定在波长420nm下的吸光值，以不加样本DNA的实验组作为空白对照。
(3)定量结果
细菌微生物定量结果。显示的吸光值为0.772，根据实施例7(一)所得的标准曲线，计算得样本中细菌微生物总量为7.60log10CFU/mL，根据实施例7(二)所得的标准曲线，计算得样本中细菌微生物总量为7.17log10CFU/mL。通过荧光定量PCR法(实验方法和步骤同实施例13(10))对上述同一酒醅样本中的细菌进行定量，结果显示细菌微生物总量为7.40log10CFU/mL，与上述方法测定的两组数据基本一致(变异系数，CV＝0.029)。
芽孢杆菌属微生物定量结果。显示的吸光值为0.422，根据实施例8(一)所得的标准曲线，计算得样本中芽孢杆菌属微生物总量为3.95log10CFU/mL，根据实施例8(二)所得的标准曲线，计算得样本中芽孢杆菌属微生物总量为3.79log10CFU/mL。通过荧光定量PCR法(实验方法和步骤同实施例13(11))对上述同一样本中的芽孢杆菌属微生物进行定量，结果显示芽孢杆菌属微生物总量为3.85log10CFU/mL，与上述方法测定的两组数据基本一致(变异系数，CV＝0.02)。
乳杆菌属微生物定量结果。显示的吸光值为0.61，根据实施例9(一)所得的标准曲线，计算得样本中乳杆菌属微生物总量为5.57log10CFU/mL，根据实施例9(二)所得的标准曲线，计算得样本中乳杆菌属微生物总量为5.77log10CFU/mL。通过荧光定量PCR法(实验方法和步骤同实施例13(12))对上述同一酒醅样本中的乳杆菌属微生物进行定量，结果显示乳杆菌属微生物总量为5.86log10CFU/mL，与上述方法测定的两组数据基本一致(变异系数，CV＝0.02)。
酿酒酵母定量结果。显示的吸光值为0.622，根据实施例10(一)所得的标准曲线，计算得样本中酿酒酵母总量为6.28log10CFU/mL。通过荧光定量PCR法(实验方法和步骤同实施例13(13))对上述同一酒醅样本中的酿酒酵母进行定量，结果显示酿酒酵母总量为6.12log10CFU/mL，与上述方法测定的两组数据基本一致(变异系数，CV＝0.018)。
真菌微生物定量结果。显示的吸光值为0.722，根据实施例11(一)所得的标准曲线，计算得样本中真菌微生物总量为6.77log10CFU/mL，根据实施例11(二)所得的标准曲线，计算得样本中真菌微生物总量为6.87log10CFU/mL。通过荧光定量PCR(实验方法和步骤同实施例13(14))法对上述同一酒醅样本中的真菌进行定量，结果显示真菌微生物总量为0.01log10CFU/mL，与上述方法测定的两组数据基本一致(变异系数，CV＝0.009)。
实施例13：微生物定量检测试剂盒与荧光定量PCR检测的结果比较
(1)样本选择来自山东景芝某酒厂发酵终点的三个白酒酒醅样本。
(2)样本处理：
(i)提取三个样本中的总基因组，提取方法同实施例1(1)，提取得到的酒醅基因组浓度分别为369ng/μL、590ng/μL、321.89ng/μL。
(ii)酒醅菌液提取。同实施例12(1)。
(3)使用细菌域的探针进行显色反应。信号探针的序列为GGGTGGGTGGGTGGGTACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGG(SEQ ID NO.1)，淬灭探针的序列为CCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTACCCA(SEQ ID NO.2)。
(4)使用芽孢杆菌属的探针进行显色反应。信号探针序列为SEQ ID NO.5所示(GGGTGGGTGGGTGGGTAAAGCTGATTTGAAAGTCATTGGAGAT)，淬灭探针序列为SEQ ID NO.6所示(ATCTCCAATGACTTTCAAATCAGCTTTACCCA)。
(5)使用乳杆菌属的探针进行显色反应。信号探针序列为SEQ ID NO.9所示(GGGTGGGTGGGTGGGTGGGTTAACAAGGTAGCCGTAG)；淬灭探针序列为SEQ ID NO.10所示(CTACGGCTACCTTGTTATTGGG)。
(6)使用酿酒酵母的探针进行显色反应。信号探针序列为SEQ ID NO.13所示(GGGTGGGTGGGTGGGTGGACTCTGGACATGC)；淬灭探针序列为SEQ ID NO.14所示(GCATGTCCAGAGTCCACCCA)。
(7)使用真菌域的探针进行显色反应。信号探针序列为SEQ ID NO.17所示(GGGTGGGTGGGTGGGTGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG)；淬灭探针序列为SEQ ID NO.18所示(CTTTTCCTCCGCTTATTGATATGCACCCA)。
(8)基于不提取基因组的试剂盒定量方法测定。
(i)信号探针与样本DNA形成双链。将向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入10μL酒醅菌液(不加样本菌液为空白对照)。于沸水浴中处理20min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。
(ii)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(i)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。
(iii)形成血红素/G四链体结构。向(ii)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100mM的试剂1(血红素)，37℃处理30min。
(iv)显色反应。向(iii)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H2O2),37℃处理30min。利用紫外分光光度计测定在波长420nm下的吸光值，以不加样本DNA的实验组作为空白对照。
(v)根据实施例7(一)所得的标准曲线，计算得样本中细菌微生物总量为7.52±0.28log10CFU/mL。根据实施例8(一)所得的标准曲线，计算得样本中芽孢杆菌属微生物总量为4.31±0.35log10CFU/mL。根据实施例9(一)所得的标准曲线，计算得样本中乳酸杆菌属微生物总量为6.74±0.18log10CFU/mL。根据实施例10(一)所得的标准曲线，计算得样本中酿酒酵母总量为6.37±0.12log10CFU/mL。根据实施例11(一)所得的标准曲线，计算得样本中真菌菌微生物总量为6.97±0.13log10CFU/mL。
(9)基于提基因组的试剂盒定量方法测定
(i)信号探针与样本DNA形成双链。向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入4μL酒醅宏基因组DNA(不加样本DNA为空白对照)。于90℃下水浴处理10min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。
(ii)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(i)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。
(iii)形成血红素/G四链体结构。向(ii)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM试剂1(血红素)，37℃处理30min。
(iv)显色反应。向(5)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H2O2),37℃处理30min。利用紫外分光光度计测定在波长420nm下的吸光值，以不加样本DNA的实验组作为空白对照。
(v)根据实施例2(一)所得的标准曲线，计算得样本中细菌微生物总量为7.50±0.22log10CFU/mL。根据实施例3(一)所得的标准曲线，计算得样本中芽孢杆菌属微生物总量为4.44±0.34log10CFU/mL。根据实施例4(一)所得的标准曲线，计算得样本中乳酸杆菌属微生物总量为6.60±0.08log10CFU/mL。根据实施例5(一)所得的标准曲线，计算得样本中酿酒酵母总量为6.30±0.11log10CFU/mL。根据实施例6(一)所得的标准曲线，计算得样本中真菌菌微生物总量为6.85±0.12log10CFU/mL。
(10)qPCR定量样本中细菌微生物含量
(i)Escherichia coli菌液根据实施例16中的培养方法获得，细菌浓度通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例2。
(ii)通过10倍梯度稀释Escherichia coli基因组DNA。
(iii)qPCR的体系为SYBR Green 10μL，上下游引物0.4μL，模板DNA0.5μL，无菌水补齐20μL。
(iv)qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃5s，60℃20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。
(v)使用细菌特异性引物对提取的基因组进行qPCR，引物序列下游序列为ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGG(SEQ ID NO.21)，下游序列为GACTACHVGGGTWTCTAAT(SEQ IDNO.22)。
(vi)通过10倍梯度稀释基因组DNA，建立CT值与Escherichia coli菌浓的标准曲线，如图11所示，R2＝0.99。
(vii)qPCR体系和反应条件同(iii)，(iv)。根据反应结束的CT值，通过所建立的标准曲线计算细菌微生物在样本中的浓度为7.52±0.39Lg(CFU/g)。
(11)qPCR定量样本中芽孢杆菌属微生物含量
(i)根据实施例30中的培养方法获得Bacillus velezensis菌液，微生物菌浓通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例30。
(ii)通过10倍梯度稀释Bacillus velezensis基因组DNA。
(iii)qPCR的体系为SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA0.5μL，无菌水补齐20μL。
(iv)qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃5s，60℃20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。
(v)使用芽孢杆菌属特异性引物对提取的基因组进行qPCR，引物序列下游序列为AAAGCTGATTTGAAAGTCATTGGAGAT(SEQ ID NO.23)，下游序列为GAGTGGCGAGCGTATCATAGTC(SEQ ID NO.24)。
(vi)通过10倍梯度稀释基因组DNA，建立CT值与Bacillus velezensis菌浓的标准曲线，如图12所示，R2＝0.99。
(vii)qPCR体系和反应条件同(iii)，(iv)。根据反应结束的CT值，通过所建立的标准曲线计算芽孢杆菌微生物在样本中的浓度为4.45±0.46Lg(CFU/g)。
(12)qPCR定量样本中乳杆菌属微生物含量
(i)Lactobacillus buchneri菌液根据实施例30中的培养方法获得，微生物菌浓通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例30。
(ii)通过10倍梯度稀释Lactobacillus buchneri基因组DNA。
(iii)qPCR的体系为SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA0.5μL，无菌水补齐20μL。
(iv)qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃5s，60℃20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。
(v)使用乳杆菌属特异性引物对提取的基因组进行qPCR，引物序列下游序列为CGTAACAAGGTAGCCGTAGG(SEQ ID NO.25)，下游序列为GTYVCGTCCTTCWTCGSC(SEQ IDNO.26)。
(vi)通过10倍梯度稀释基因组DNA，建立CT值与Lactobacillus buchneri菌浓的标准曲线，如图13所示，R2＝0.99。
(vii)qPCR体系和反应条件同(iii)，(iv)。根据反应结束的CT值，通过所建立的标准曲线计算乳杆菌属微生物在样本中的浓度为6.60±0.08Lg(CFU/g)。
(13)qPCR定量样本中酿酒酵母含量
(i)酿酒酵母菌液根据实施例30中的培养方法获得，微生物菌浓通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例30。
(ii)通过10倍梯度稀释酿酒酵母基因组DNA。
(iii)qPCR的体系为SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA0.5μL，无菌水补齐20μL。
(iv)qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃5s，60℃20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。
(v)使用酿酒酵母特异性引物对提取的基因组进行qPCR，引物序列下游序列为GGACTCTGGACATGC(SEQ ID NO.27)，下游序列为ATACCCTTCTTAACACCTGGC(SEQID NO.28)。
(vi)通过10倍梯度稀释基因组DNA，建立CT值与酿酒酵母菌浓的标准曲线，如图14所示，R2＝0.99。
(vii)qPCR体系和反应条件同(iii)，(iv)。根据反应结束的CT值，通过所建立的标准曲线计算酿酒酵母在样本中的浓度为6.32±0.081log10 CFU/g。
(14)qPCR定量样本中真菌微生物含量
(i)Saccharomyces cerevisiae菌液根据实施例16中的培养方法获得，真菌浓度通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例16。
(ii)通过10倍梯度稀释Saccharomyces cerevisiae基因组DNA。
(iii)qPCR的体系为SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA0.5μL，无菌水补齐20μL。
(iv)qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃5s，60℃20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。
(v)使用真菌特异性引物对提取的基因组进行qPCR，引物序列下游序列为GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG(SEQ ID NO.29)，下游序列为GGTCCGTGTTTCAAGACGG(SEQ IDNO.30)。
(vi)通过10倍梯度稀释基因组DNA，建立CT值与真菌菌浓的标准曲线，如图15所示，R2＝0.99。
(vii)qPCR体系和反应条件同(iii)，(iv)。根据反应结束的CT值，通过所建立的标准曲线计算真菌微生物在样本中的浓度为6.92±0.13Lg(CFU/g)。
(15)通过显著性差异分析，结果如图16、17、18、19、20所示，三种定量方法检测五种微生物的结果之间无显著性差异(P<0.05)
实施例14：应用两种不同序列信号探针进行检测的细菌微生物检出限
分别用不同序列的信号探针进行定量。
(1)Escherichia coli菌液根据实施例30中的培养方法获得，细菌浓度通过平板计数法测定，浓度为8.2log10 CFU/mL基因组的提取同实施例30。
(2)通过10倍梯度稀释Escherichia coli基因组DNA，得到3.2log10 CFU/mL的DNA模板。
(3)利用细菌信号探针序列为SEQ ID NO.1，淬灭探针序列为SEQ ID NO.2。加入(2)中得到的3.2log10 CFU/mLEscherichia coli基因组DNA进行显色反应。或者采用信号探针序列为SEQ ID NO.3且淬灭探针序列为SEQ ID NO.4。加入(2)中得到的3.2log10 CFU/mL Escherichia coli基因组DNA进行显色反应，具体是：
(A)信号探针与样本DNA形成双链。将向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入4μLEscherichia coli基因组DNA(不加样本DNA为空白对照)。于90℃下水浴处理10min。分别加入4μL 20μM的不同信号探针之后于55℃下反应30min。
(B)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(A)步骤反应之后的体系中加入分别8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。
(C)形成血红素/G四链体结构。向(B)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM的试剂1(血红素)，37℃处理30min。
(D)显色反应。向(C)反应结束的体系中分别加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H2O2),37℃处理30min。利用紫外分光光度计测定在波长420nm下的吸光值，以不加样本DNA的实验组作为空白对照。
(4)重复(A)(B)(C)(D)步骤9次，比较检测结果的稳定性，如图21所示。基于SEQ IDNO.3的信号序列定量结果的变异系数(CV)为11.33％，基本可以实现检测；基于SEQ IDNO.1的信号序列的定量结果变异系数为0.95％，检测效果稳定。
实施例15：应用两种不同序列信号探针进行检测的芽孢杆菌属检出限
分别用不同序列的信号探针进行定量。
(1)根据实施例30中的培养方法获得Bacillus velezensis菌液，微生物菌浓通过平板计数法测定，浓度为7.08log10 CFU/mL基因组的提取同实施例30。
(2)通过10倍梯度稀释Bacillus velezensis基因组DNA，得到2.08log10 CFU/mL的DNA模板。
(3)利用芽孢杆菌属信号探针序列为SEQ ID NO.5且淬灭探针序列为SEQ IDNO.6，或者信号探针序列为SEQ ID NO.7且淬灭探针序列为SEQ ID NO.8。加入(2)中得到的2.08log10CFU/mLBacillus velezensis基因组DNA进行显色反应；显色反应的具体操作步骤同上一实施例的步骤(A)、(B)、(C)、(D)，仅将步骤(A)中基因组替换成Bacillusvelezensis基因组DNA。
(4)重复(A)(B)(C)(D)步骤9次，比较检测结果的稳定性，如图22所示，基于SEQ IDNO.7的信号序列定量结果的变异系数(CV)为24.92％基本可以实现检测；基于SEQ ID NO.5的信号序列定量结果变异系数为0.84％，检测效果稳定。
实施例16：应用两种不同序列信号探针进行检测的乳杆菌属检出限
(1)Lactobacillus buchneri菌液根据实施例30中的培养方法获得，乳杆菌属浓度通过平板计数法测定，浓度为7.45log10 CFU/mL基因组的提取同实施例30。
(2)通过10倍梯度稀释Lactobacillus buchneri基因组DNA，得到2.45log10 CFU/mL的DNA模板。
(3)本发明所提供的乳杆菌属的信号探针的序列为SEQ ID NO.9且淬灭探针的序列为SEQ ID NO.10，或者信号探针序列为SEQ ID NO.11且淬灭探针序列为SEQ ID NO.12。加入(2)中得到的2.45log10 CFU/mLLactobacillus buchneri基因组DNA进行显色反应；显色反应的具体操作步骤同上一实施例的步骤(A)、(B)、(C)、(D)，仅将步骤(A)中基因组替换成Lactobacillus buchneri基因组DNA。
(4)重复(A)(B)(C)(D)步骤9次，比较检测结果的稳定性，如图23所示。基于SEQ IDNO.11的信号序列定量结果的变异系数(CV)为58.6％，基本可以实现检测；基于SEQ IDNO.9的信号序列的定量结果变异系数为5.42％，检测效果稳定。
实施例17：应用两种不同序列信号探针进行检测的酿酒酵母检出限
(1)酿酒酵母菌液根据实施例30中的培养方法获得，微生物菌浓通过平板计数法测定，浓度为7.49log10 CFU/mL基因组的提取同实施例30。
(2)通过10倍梯度稀释酿酒酵母基因组DNA，得到2.49log10 CFU/mL的DNA模板。
(3)本发明所提供的酿酒酵母信号探针的序列为SEQ ID NO.13且淬灭探针的序列为SEQ ID NO.14，或者信号探针序列为SEQ ID NO.15且淬灭探针序列为SEQ ID NO.16。加入(2)中得到的3.2log10 CFU/mL酿酒酵母基因组DNA进行显色反应；显色反应的具体操作步骤同上一实施例的步骤(A)、(B)、(C)、(D)，仅将步骤(A)中基因组替换成酿酒酵母基因组DNA。
(4)重复(A)(B)(C)(D)步骤9次，比较检测结果的稳定性，如图24所示。基于SEQ IDNO.15的信号序列定量结果的变异系数(CV)为68.92％，基本可以实现检测；基于SEQ IDNO.13的信号序列的定量结果变异系数为7.44％，检测效果稳定。
实施例18：应用两种不同序列信号探针进行检测的真菌微生物检出限
(1)Saccharomyces cerevisiae菌液根据实施例30中的培养方法获得，微生物菌浓通过平板计数法测定，浓度为8.63log10 CFU/mL基因组的提取同实施例30。
(2)通过10倍梯度稀释Saccharomyces cerevisiae基因组DNA，得到2.63log10CFU/mL的DNA模板。
(3)本发明所提供的真菌信号探针序列为SEQ ID NO.17且淬灭探针序列为SEQ IDNO.18，或者信号探针序列为SEQ ID NO.19且淬灭探针序列为SEQ ID NO.20。加入(2)中得到的3.2log10 CFU/mL Saccharomyces cerevisiae基因组DNA进行显色反应；显色反应的具体操作步骤同上一实施例的步骤(A)、(B)、(C)、(D)，仅将步骤(A)中基因组替换成酿酒酵母基因组DNA。
(4)重复(A)(B)(C)(D)步骤9次，比较检测结果的稳定性，如图25所示。基于SEQ IDNO.19的信号序列定量结果的变异系数(CV)为53.35％，基本可以实现检测；基于SEQ IDNO.17的信号序列的定量结果变异系数为6.95％，检测效果稳定
实施例19：细菌微生物定量探针组合试剂
探针组合试剂；含有独立包装的信号探针试剂和淬灭探针试剂；其中，信号探针序列如SEQ ID NO.1所示或SEQ ID NO.3所示的，淬灭探针序列为SEQ ID NO.2所示或SEQ IDNO.4所示的。其中，SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2为一组，SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4为一组。
信号探针试剂和淬灭探针试剂，为干粉或者液体状；为干粉时，可以在实验之前稀释到合适的浓度，比如，使用无菌水或者缓冲液稀释至浓度为20μM；为液体状时，浓度可以是20-200μM，试剂使用前可以进行稀释，或者直接使用。
实施例20：芽孢杆菌定量探针组合试剂
探针组合试剂；含有独立包装的信号探针试剂和淬灭探针试剂；其中，信号探针序列如SEQ ID NO.5所示或SEQ ID NO.7所示的，淬灭探针序列为SEQ ID NO.6所示或SEQ IDNO.8所示的。其中，SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6为一组，SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8为一组。
信号探针试剂和淬灭探针试剂，为干粉或者液体状；为干粉时，可以在实验之前稀释到合适的浓度，比如，使用无菌水或者缓冲液稀释至浓度为20μM；为液体状时，浓度可以是20-200μM，试剂使用前可以进行稀释，或者直接使用。
实施例21：乳杆菌属定量探针组合试剂
探针组合试剂；含有独立包装的信号探针试剂和淬灭探针试剂；其中，信号探针序列如SEQ ID NO.9所示或SEQ ID NO.11所示的，淬灭探针序列为SEQ ID NO.10所示或SEQID NO.12所示的。其中，SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10为一组，SEQ ID NO.11与SEQ IDNO.12为一组。
信号探针试剂和淬灭探针试剂，为干粉或者液体状；为干粉时，可以在实验之前稀释到合适的浓度，比如，使用无菌水或者缓冲液稀释至浓度为20μM；为液体状时，浓度可以是20-200μM，试剂使用前可以进行稀释，或者直接使用。
实施例22：酿酒酵母定量探针组合试剂
探针组合试剂；含有独立包装的信号探针试剂和淬灭探针试剂；其中，信号探针序列如SEQ ID NO.13所示或SEQ ID NO.15所示的，淬灭探针序列为SEQ ID NO.14所示或SEQID NO.16所示的。其中，SEQ ID NO.13与SEQ ID NO.14为一组，SEQ ID NO.15与SEQ IDNO.16为一组。
信号探针试剂和淬灭探针试剂，为干粉或者液体状；为干粉时，可以在实验之前稀释到合适的浓度，比如，使用无菌水或者缓冲液稀释至浓度为20μM；为液体状时，浓度可以是20-200μM，试剂使用前可以进行稀释，或者直接使用。
实施例23：真菌微生物定量探针组合试剂
探针组合试剂；含有独立包装的信号探针试剂和淬灭探针试剂；其中，信号探针序列如SEQ ID NO.17所示或SEQ ID NO.19所示的，淬灭探针序列为SEQ ID NO.18所示或SEQID NO.20所示的。其中，SEQ ID NO.17与SEQ ID NO.18为一组，SEQ ID NO.19与SEQ IDNO.20为一组。
信号探针试剂和淬灭探针试剂，为干粉或者液体状；为干粉时，可以在实验之前稀释到合适的浓度，比如，使用无菌水或者缓冲液稀释至浓度为20μM；为液体状时，浓度可以是20-200μM，试剂使用前可以进行稀释，或者直接使用。
实施例24：联合定量检测试剂盒
微生物联合定量检测试剂盒，可用于待测样本中如下至少两种类型的对应微生物的检测：所有的细菌微生物、所有的真菌、所有的酿酒酵母、所有的芽孢杆菌属、所有的乳杆菌属。
该定量检测试剂盒中，含有如下两套以上能检测不同类型的对应微生物的独立包装的探针试剂，每套探针中包括信号探针和淬灭探针：
(1)细菌：信号探针序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3，分别对应淬灭探针序列为SEQ ID NO.2所示或SEQ ID NO.4所示。
(2)芽孢杆菌：信号探针序列为SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7，分别对应淬灭探针序列为SEQ ID NO.6所示或SEQ ID NO.8所示。
(3)乳杆菌属：信号探针序列为SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.11，分别对应淬灭探针序列为SEQ ID NO.10所示或SEQ ID NO.12所示。
(4)酿酒酵母：信号探针序列为SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.15，分别对应淬灭探针序列为SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16。
(5)真菌：信号探针序列为SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.19，分别对应淬灭探针序列为SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.20。
该试剂盒使用时，可以与血红素、缓冲液、2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、H2O2配合使用。
实施例25：细菌和真菌联合定量检测试剂盒及其使用
微生物联合定量检测试剂盒，可用于待测样本中总细菌微生物、总真菌的检测，含有用于总细菌检测的探针组和用于总真菌检测的探针组。其中，细菌探针组：信号探针序列为SEQ ID NO.1(或SEQ ID NO.3)，对应的淬灭探针序列为SEQ ID NO.2所示(或SEQ IDNO.4所示)；真菌探针组：信号探针序列为SEQ ID NO.17，淬灭探针序列为SEQ ID NO.18。
联合定量检测时，分别使用细菌探针组、真菌探针组进行如下步骤：
(1)溶液配置。配置100nM的血红素溶液(试剂1)；配置终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9(试剂2)；7mM的2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)(试剂3)以及7mM的H2O2溶液(试剂4)；溶剂均为无菌水。
(2)信号探针与样本DNA形成双链。向2mL的试剂2加入4μL的样本基因组DNA，于90℃下水浴处理10min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。
(3)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链。淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(2)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。
(4)形成血红素/G四链体结构。向(3)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM试剂1，37℃处理30min。
(5)显色反应。向(4)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4，37℃处理30min，进行显示反应(绿色)。
检测反应物在波长420nm下的吸光值；结合吸光值对样品中微生物进行定量。
当然，在进行绝对定量时，可以自行绘制吸光值与对应微生物生物量的标准曲线，或者根据试剂盒推荐的使用方法和标准曲线直接换算得到对应微生物的生物量。
实施例26：芽孢杆菌属和乳杆菌属联合定量检测试剂盒及其使用
微生物联合定量检测试剂盒，可用于待测样本中总芽孢杆菌属、总乳杆菌属的检测，含有用于总芽孢杆菌检测的探针组和用于总乳杆菌检测的探针组。其中，芽孢杆菌属探针组：信号探针序列为SEQ ID NO.5(或SEQ ID NO.7)，对应的淬灭探针序列为SEQ ID NO.6所示(或SEQ ID NO.8所示)；乳杆菌属探针组：信号探针序列为SEQ ID NO.9(或SEQ IDNO.11)，淬灭探针序列为SEQ ID NO.10(或SEQ ID NO.12)。
联合定量检测时，分别使用芽孢杆菌属探针组、乳杆菌属探针组进行。步骤可以参考实施例1。
实施例27：乳杆菌属和酿酒酵母联合定量试剂盒及其使用
微生物联合定量检测试剂盒，可用于待测样本中总酿酒酵母、总乳杆菌属的检测，含有用于总酿酒酵母检测的探针组和用于总乳杆菌检测的探针组。其中，酿酒酵母探针组：信号探针序列为SEQ ID NO.13(或SEQ ID NO.15)，对应的淬灭探针序列为SEQ ID NO.14所示(或SEQ ID NO.16所示)；乳杆菌属探针组：信号探针序列为SEQ ID NO.9(或SEQ IDNO.11)，淬灭探针序列为SEQ ID NO.10(或SEQ ID NO.12)。
联合定量检测时，分别使用酿酒酵母探针组、乳杆菌属探针组进行，步骤可以参考实施例1，对不同的样本进行检测。
实施例28：微生物定量试剂盒
微生物联合定量检测试剂盒，可用于待测样本中如下至少两种类型的对应微生物的检测：所有的细菌微生物、所有的真菌、所有的酿酒酵母、所有的芽孢杆菌属、所有的乳杆菌属。
该定量检测试剂盒中，含有血红素、缓冲液、2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、H2O2。
还含有如下两组以上的独立包装的探针试剂，每组探针中包括信号探针和淬灭探针：
(1)细菌：信号探针序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3，分别对应淬灭探针序列为SEQ ID NO.2所示或SEQ ID NO.4所示。
(2)芽孢杆菌：信号探针序列为SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7，分别对应淬灭探针序列为SEQ ID NO.6所示或SEQ ID NO.8所示。
(3)乳杆菌属：信号探针序列为SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.11，分别对应淬灭探针序列为SEQ ID NO.10所示或SEQ ID NO.12所示。
(4)酿酒酵母：信号探针序列为SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.15，分别对应淬灭探针序列为SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16。
(5)真菌：信号探针序列为SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.19，分别对应淬灭探针序列为SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.20。
实施例29：微生物定量试剂盒
微生物联合定量检测试剂盒，可用于待测样本中如下至少两种类型的对应微生物的检测：所有的细菌微生物、所有的真菌、所有的酿酒酵母、所有的芽孢杆菌属、所有的乳杆菌属。
该定量检测试剂盒中，含有100nM的血红素溶液、Tris-HCL缓冲液、7mM的2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、7mM的H2O2溶液。
还含有如下两组以上的独立包装的探针试剂，每组探针中包括信号探针和淬灭探针：
(1)细菌：信号探针序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3，淬灭探针序列为SEQ IDNO.2所示或SEQ ID NO.4所示。
(2)芽孢杆菌：信号探针序列为SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7，淬灭探针序列为SEQID NO.6所示或SEQ ID NO.8所示。
(3)乳杆菌属：信号探针序列为SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.11，淬灭探针序列为SEQID NO.10所示或SEQ ID NO.12所示。
(4)酿酒酵母：信号探针序列为SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.15，淬灭探针序列为SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16。
(5)真菌：信号探针序列为SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.19，淬灭探针序列为SEQ IDNO.18或SEQ ID NO.20。
实施例30：细菌微生物定量探针、试剂盒的特异性
(1)选择发酵食品样本中广泛存在的36个细菌种微生物作为阳性对照，分别为Lactobacillus buchneri,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillus brevis,Lactobacillus crustorum,Lactobacillusplantarum,Lactobacillus harbinensis,Lactobacillus acidiliscis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcusacidilactici,Pediococcuspentosaceus,Lactobacillus murinus,Lactobacilluscurvatus,Lactobacillus casei,Lactobacillus reuteri,Lactobacilluspanis,Lactobacillusfermentum,Lactobacillusjohnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissella confusa,Weissellaparamesenteroides,Weissellaviridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostocpseudomesenteroides,Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcusfaecalis,Bacillus coagulans,Bacillus licheniformis,Bacillustequilensis,Bacillus subtilis,Bacillus velezensis,Acetobacterpasteurianus,Enterococcus faecium。选择发酵食品样本中广泛存在的7个真菌种作为阴性对照，分别为Aspergillus tubingensis，Mucor rouxianus，Schizosaccharomycespombe，Zygosaccharomyces bailii，Pichia kudriavzevii，Saccharomycopsisfibuligera，Saccharomyces cerevisiae。
(2)以上微生物选择不同的培养基进行培养，其中Lactobacillus buchneri,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillus brevis,Lactobacillus crustorum,Lactobacillusplantarum,Lactobacillus harbinensis,Lactobacillus acidiliscis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcus acidilactici,Pediococcuspentosaceus,Lactobacillus murinus,Lactobacillus curvatus,Lactobacillus casei,Lactobacillus reuteri,Lactobacilluspanis,Lactobacillusfermentum,Lactobacillusjohnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissellaconfusa,Weissellaparamesenteroides,Weissella viridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostocpseudomesenteroides使用MRS培养基，培养基配方为胰蛋白胨10.0g/L，牛肉浸膏8.0g/L，酵母提取物4.0g/L，葡萄糖18.0g/L，无水山梨醇油酸酯0.8mL/L，K2HPO42.5 g/L，三水合乙酸钠6.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，MnSO4·4H2O 0.08g/L。培养条件为30℃48h。Enterococcusitalicus,Enterococcus lactis,Enterococcusfaecalis,Bacillus coagulans,Bacilluslicheniformis,Bacillus tequilensis,Bacillus subtilis,Bacillus velezensis,Acetobacterpasteurianus,Enterococcusfaecium，Escherichia coli使用LB培养基，培养基配方为蛋白胨10.0g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。培养条件为37℃24h。Aspergillustubingensis，Mucor rouxianus，Schizosaccharomycespombe，Zygosaccharomycesbailii，Pichia kudriavzevii，Saccharomycopsisfibuligera，Saccharomycescerevisiae使用YPD培养基，培养基配方为酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。培养条件为：霉菌30℃下培养5天，酵母菌30℃条件下培养2天。
(3)单菌基因组提取。上述菌液在12000rpm条件下处理2min，收集沉淀。43种微生物纯培养物的基因组使用基因抽提试剂盒DNeasy Tissue Kit提取。
(4)探针选择为细菌探针，信号探针的序列为GGGTGGGTGGGTGGGTACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGG(SEQ ID NO.1)，淬灭探针的序列为CCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTACCCA(SEQID NO.2)。
(4)信号探针与样本DNA形成双链。分别向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入4μL不同微生物的基因组DNA，于90℃下水浴处理10min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。
(5)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(4)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。
(6)形成血红素/G四链体结构。向(5)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM试剂1(血红素)，37℃处理30min。
(7)显色反应。向(6)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H2O2),37℃处理30min。结果如图26所示添加细菌基因组的实验组出现显色反应，添加真菌基因组的实验组和空白对照组没有出现显色反应，证明检测细菌域微生物的特异性。
实施例31：芽孢杆菌属微生物定量探针、试剂盒的特异性
(1)选择发酵食品样本中广泛存在的5个芽孢杆菌属微生物作为阳性对照，分别为Bacillus coagulans,Bacillus licheniformis,Bacillus tequilensis,Bacillussubtilis,Bacillus velezensis。选择发酵样本中广泛存在的31个非芽孢杆菌细菌微生物和7个真菌微生物作为阴性对照，其中31个非芽孢杆菌细菌微生物包括Lactobacillusbuchneri,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillus brevis,Lactobacilluscrustorum,Lactobacillusplantarum,Lactobacillus harbinensis,Lactobacillusacidiliscis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcus acidilactici,Pediococcuspentosaceus,Lactobacillus murinus,Lactobacillus curvatus,Lactobacillus casei,Lactobacillus reuteri,Lactobacilluspanis,Lactobacillusfermentum,Lactobacillusjohnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissellaconfusa,Weissellaparamesenteroides,Weissella viridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostoc pseudomesenteroides,Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcusfaecalis,Acetobacterpasteurianus,Enterococcusfaecium。7个真菌微生物包括Aspergillustubingensis，Mucor rouxianus，Schizosaccharomycespombe，Zygosaccharomycesbailii，Pichia kudriavzevii，Saccharomycopsisfibuligera，Saccharomycescerevisiae。
(2)上述微生物根据习性不同，培养方式有所不同，具体实施方法同实施例30。
(3)微生物纯培养物基因组DNA的提取。将上述菌液在12000rpm条件下离心2min，采集沉淀。根据基因抽提试剂盒DNeasy Tissue Kit说明书，提取43种微生物纯培养物的基因组。
(4)探针选择为芽孢杆菌属探针，信号探针序列为GGGTGGGTGGGTGGGTAAAGCTGATTTGAAAGTCATTGGAGAT(SEQ ID NO.5)，淬灭探针序列为TCTCCAATGACTTTCAAATCAGCTTTACCCA(SEQ ID NO.6)。
(4)信号探针与样本DNA形成双链。分别向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入4μL不同微生物的基因组DNA，于90℃下水浴处理10min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。
(5)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(4)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。
(6)形成血红素/G四链体结构。向(5)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM试剂1(血红素)，37℃处理30min。
(7)显色反应。向(6)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H2O2),37℃处理30min。结果如图27所示，添加芽孢杆菌属菌种基因组的实验组出现显色反应，添加非芽胞杆菌微生物基因组DNA的实验组和空白对照组没有出现显色反应，证明检测芽孢杆菌属微生物的特异性。
实施例32：乳杆菌属微生物定量探针、试剂盒的特异性
(1)选择发酵食品样本中广泛存在的15个乳杆菌属微生物作为阳性对照，分别为Lactobacillus buchneri,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillus brevis,Lactobacillus crustorum,Lactobacillusplantarum,Lactobacillus harbinensis,Lactobacillus acidiliscis,Lactobacillus murinus,Lactobacillus curvatus,Lactobacillus casei,Lactobacillus reuteri,Lactobacilluspanis,Lactobacillusfermentum,Lactobacillusjohnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis。选择发酵食品样本中广泛存在的21个非乳杆菌细菌微生物和7个真菌微生物作为阴性对照，21个非乳杆菌细菌微生物包括Pediococcus ethanolidurans,Pediococcus acidilactici,Pediococcus pentosaceus,Weissella confusa,Weissellaparamesenteroides,Weissella viridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostocpseudomesenteroides,Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcusfaecalis,Bacilluscoagulans,Bacillus licheniformis,Bacillus tequilensis,Bacillus subtilis,Bacillus velezensis,Acetobacterpasteurianus,Enterococcusfaecium。7个真菌种包括Aspergillus tubingensis，Mucor rouxianus，Schizosaccharomycespombe，Zygosaccharomyces bailii，Pichia kudriavzevii，Saccharomycopsis fibuligera，Saccharomyces cerevisiae。
(2)上述微生物根据习性不同，培养方式有所不同，具体实施方法同实施例30。
(3)微生物纯培养物基因组DNA提取。上述菌液在12000rpm条件下处理2min，收集沉淀。
43种微生物纯培养物的基因组使用基因抽提试剂盒DNeasy Tissue Kit提取。
(4)探针选择为乳杆菌属探针，信号探针的序列为
GGGTGGGTGGGTGGGTGGGTTAACAAGGTAGCCGTAG(SEQ ID NO.9)，淬灭探针的序列为CTACGGCTACCTTGTTAACCCAACCCA(SEQ ID NO.10)。
(4)信号探针与样本DNA形成双链。分别向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入4μL不同微生物的基因组DNA，于90℃下水浴处理10min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。
(5)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(4)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。
(6)形成血红素/G四链体结构。向(5)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM试剂1(血红素)，37℃处理30min。
(7)显色反应。向(6)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H2O2),37℃处理30min。结果如图28所示，添加乳杆菌基因组DNA的实验组出现显色反应，添加非乳杆菌微生物基因组DNA的实验组和空白对照组没有出现显色反应，证明检测乳杆菌属微生物的特异性。
实施例33：酿酒酵母定量探针、试剂盒的特异性
(1)选择来源于发酵谷物中的酿酒酵母作为阳性对照，选择发酵食品样本中广泛存在的36个细菌种微生物和6个真菌种微生物作为阴性对照，细菌微生物分别为Lactobacillus buchneri,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillus brevis,Lactobacillus crustorum,Lactobacillusplantarum,Lactobacillus harbinensis,Lactobacillus acidiliscis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcusacidilactici,Pediococcuspentosaceus,Lactobacillus murinus,Lactobacilluscurvatus,Lactobacillus casei,Lactobacillus reuteri,Lactobacilluspanis,Lactobacillusfermentum,Lactobacillusjohnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissella confusa,Weissella paramesenteroides,Weissellaviridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostocpseudomesenteroides,Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcusfaecalis,Bacillus coagulans,Bacillus licheniformis,Bacillustequilensis,Bacillus subtilis,Bacillus velezensis,Acetobacterpasteurianus,Enterococcusfaecium。真菌微生物分别为Aspergillus tubingensis，Mucor rouxianus，Schizosaccharomycespombe，Zygosaccharomyces bailii，Pichia kudriavzevii，Saccharomycopsisfibuligera。
(2)上述微生物根据习性不同，培养方式有所不同，具体实施方法同实施例30。
(3)单菌基因组提取。上述菌液在12000rpm条件下处理2min，收集沉淀。43种微生物纯培养物的基因组使用基因抽提试剂盒DNeasy Tissue Kit提取。
(4)探针选择为酿酒酵母特异性探针，信号探针的序列为
GGGTGGGTGGGTGGGTGGACTCTGGACATGC(SEQ ID NO.13)，淬灭探针的序列为GCATGTCCAGAGTCCACCCAA(SEQ ID NO.14)。
(4)信号探针与样本DNA形成双链。分别向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入4μL不同微生物的基因组DNA，于90℃下水浴处理10min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。
(5)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(4)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。
(6)形成血红素/G四链体结构。向(5)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM试剂1(血红素)，37℃处理30min。
(7)显色反应。向(6)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H2O2),37℃处理30min。结果如图29所示，添加酿酒酵母基因组的实验组出现显色反应，添加非酿酒酵母的实验组和空白对照组没有出现显色反应，证明检测酿酒酵母的特异性。
实施例34：真菌微生物定量探针、试剂盒的特异性
(1)选择发酵食品样本中广泛存在的7个真菌种微生物作为阳性对照，分别为Aspergillus tubingensis，Mucor rouxianus，Schizosaccharomycespombe，Zygosaccharomyces bailii，Pichia kudriavzevii，Saccharomycopsisfibuligera，Saccharomyces cerevisiae。选择发酵食品样本中广泛存在的36个细菌种微生物作为阴性对照，分别为Lactobacillus buchneri,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillusbrevis,Lactobacillus crustorum,Lactobacillusplantarum,Lactobacillusharbinensis,Lactobacillus acidiliscis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcusacidilactici,Pediococcuspentosaceus,Lactobacillus murinus,Lactobacilluscurvatus,Lactobacillus casei,Lactobacillus reuteri,Lactobacilluspanis,Lactobacillusfermentum,Lactobacillusjohnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissella confusa,Weissellaparamesenteroides,Weissellaviridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostocpseudomesenteroides,Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcus faecalis,Bacillus coagulans,Bacillus licheniformis,Bacillustequilensis,Bacillus subtilis,Bacillus velezensis,Acetobacterpasteurianus,Enterococcusfaecium。
(2)上述微生物根据习性不同，培养方式有所不同，具体实施方法同实施例30。
(3)单菌基因组提取。上述菌液在12000rpm条件下处理2min，收集沉淀。43种微生物纯培养物的基因组使用基因抽提试剂盒DNeasy Tissue Kit提取。
(4)探针选择为真菌探针，信号探针序列为GGGTGGGTGGGTGGGTGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG(SEQ ID NO.17)，淬灭探针序列为CTTTTCCTCCGCTTATTGATATGCACCCA(SEQ IDNO.18)。
(4)信号探针与样本DNA形成双链。分别向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入4μL不同微生物的基因组DNA，于90℃下水浴处理10min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。
(5)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(4)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。
(6)形成血红素/G四链体结构。向(5)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM试剂1(血红素)，37℃处理30min。
(7)显色反应。向(6)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H2O2),37℃处理30min。结果如图30所示，添加真菌基因组的实验组出现显色反应，添加细菌基因组的实验组和空白对照组没有出现显色反应，证明检测真菌域微生物的特异性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种微生物绝对定量方法及其应用
<160> 30
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<213> 人工合成
<400> 27
ggactctgga catgc 15
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 28
atacccttct taacacctgg c 21
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 29
gcatatcaat aagcggagga aaag 24
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 30
ggtccgtgtt tcaagacgg 19

Claims (15)

1.一种微生物定量方法，其特征在于，所述方法包括：待测样品中DNA发生解链；加入过量信号探针，与待测样本的目标核苷酸片段结合形成双链，使G四链体裸漏在序列之外；加入足量淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构；利用裸漏在外G四链体与血红素反应形成具有过氧化氢酶活性的G四链体/血红素模拟酶，结合过氧化氢酶的活性表征微生物的生物量；其中，所述方法中不需要使用仪器使待测样品中DNA发生扩增；
当定量细菌微生物时，信号探针序列为SEQ ID NO.1所示，对应的淬灭探针序列分别为SEQ ID NO.2所示；当定量芽孢杆菌属微生物时，信号探针序列为SEQ ID NO.5所示，对应的淬灭探针序列分别为SEQ ID NO.6所示；当定量乳杆菌属微生物时，信号探针序列为SEQ IDNO.9所示，对应的淬灭探针序列分别为SEQ ID NO.10所示；当定量酿酒酵母时，信号探针序列为SEQ ID NO.13所示，对应的淬灭探针序列分别为SEQ ID NO.14所示；当定量真菌微生物时，信号探针序列为SEQ ID NO.17所示，对应的淬灭探针序列分别为SEQ ID NO.18所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品为含有菌体、基因组或宏基因组的样品。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品是收集该样品中的菌体后不经基因组提取，直接进行DNA解链处理。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法为绝对定量方法，还包括：建立过氧化氢酶活性和微生物的生物量的标准曲线，或者与过氧化氢酶活性呈相关性的指标和微生物的生物量的标准曲线；检测待测样品时，将检测到的过氧化氢酶活性或者指标代入标准曲线，即获得待测样品中的微生物的生物量。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品为发酵食品或者取自发酵食品发酵过程中的样品，或者肠道、土壤、水体等环境样本。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵食品为以下任意一种以上：白酒、黄酒、酱油、啤酒、葡萄酒、食醋、发酵茶、传统发酵蔬菜、发酵饮料、酸奶、干酪、果醋、酒酿、豆豉、乳腐。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵食品为酒精饮品、发酵米面食品。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述微生物为以下任意一种或者多种类型：酿酒酵母、芽孢杆菌属、乳杆菌属。
9.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述微生物为以下任意一种或者多种类型：细菌、真菌。
10.一种用于多种微生物绝对定量的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒能够用于实现待测样本中如下至少两种类型的微生物的检测：所有的细菌微生物、所有的真菌、所有的酿酒酵母、所有的芽孢杆菌属、所有的乳杆菌属；所述检测试剂盒中，至少含有如下2套能检测不同种属的探针，每套探针中包括信号探针和淬灭探针；
（1）细菌探针：信号探针序列为SEQ ID NO.1，对应的淬灭探针序列为SEQ ID NO.2所示；
（2）芽孢杆菌探针：信号探针序列为SEQ ID NO.5，对应的淬灭探针序列为SEQ ID NO.6所示；
（3）乳杆菌属探针：信号探针序列为SEQ ID NO.9，对应的淬灭探针序列为SEQ IDNO.10所示；
（4）酿酒酵母探针：信号探针序列为SEQ ID NO.13，对应的淬灭探针序列为SEQ IDNO.14；
（5）真菌探针：信号探针序列为SEQ ID NO.17，对应的淬灭探针序列为SEQ ID NO.18。
11.一种权利要求10所述试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括：在DNA解链的待测样本中加入检测对应微生物的过量的信号探针反应一段时间，使信号探针与待测样本中的目标片段结合；然后在加入对应微生物的足量淬灭探针使之与未结合的信号探针的形成双链；再加入血红素，反应一段时间后加入ABTS和H2O2，反应一段时间，检测反应物的吸光值，结合吸光值对样品中对应微生物进行定量。
12.权利要求1-9任一所述的检测方法或权利要求10所述的试剂盒在微生物定量中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述应用是用于发酵食品技术领域，或者肠道、土壤、水体等环境微生物检测领域。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述发酵食品为以下任意一种以上：白酒、黄酒、酱油、啤酒、葡萄酒、食醋、发酵茶、传统发酵蔬菜、发酵饮料、酸奶、干酪、果醋、酒酿、豆豉、乳腐。
15.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述发酵食品为以下任意一种以上：酒精饮品、发酵米面食品。
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