CN102304586A - 一种水环境微生物鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种水环境微生物鉴定方法，属于生物环境技术领域。发明对常规的PCR-DGGE的工艺方法进行了优化，在第一次得到PCR产物是不是直接用于测序，而是将产物克隆，再次进行PCR检测，得到的阳性质粒再用于测序，可清楚地鉴定出种类繁多的水环境微生物优势类群。而且优化后的方法适用范围广，在不同水体类型、不同污染程度的水环境中均可以发挥预期的功能。
Description
技术领域
本发明涉及水处理领域，具体地说是一种广适性的水环境微生物鉴定方法。
背景技术
变性梯度凝胶电泳技术(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)是由Fischer和Lerman于1979年最先提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术。1993年，Muzyer等首次将DGGE技术应用于微生物生态学研究，证实了这种技术在研究自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性。现在，DGGE被认为是研究微生物遗传多样性和种群动态最有力的分子生物学技术(姜昕等，2007)。
DGGE不是基于核酸分子量的不同将DNA序列分开，而是根据序列的不同、将片段大小相同的DNA序列分开。双链DNA分子中，A、T碱基之间有2个氢键，而G、C碱基之间有3个氢键连接，因此A、T碱基对对变性剂的耐受性要低于G、C碱基对。由于这4种碱基的组成和排列差异，使不同序列双链DNA分子具有不同的解链温度。当双链DNA片段在含有梯度变性剂(尿素、甲酞胺)的聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，解链的速度、程度与其序列密切相关，当某一双链DNA序列迁移到变性凝胶的一定位置、并达到解链温度时，即开始部分解链，部分解链的DNA片段的迁移速度随解链程度的增大而减小，从而使不同序列的DNA片段滞留于凝胶的不同位置，经过染色后凝胶形成为指纹带谱。理论上，只要选择的电泳条件(变性剂梯度、电泳时间、电压等)足够精细，仅有单一碱基差异的DNA片段也可被分开。
DGGE作为一种分子生物学技术，也具有多数分子技术所固有的缺点。除了如在PCR过程中产生的偏差等之外，其本身还有一些很难克服的缺点。Vallaeys等(1997)发现，有些细菌具有多操纵子，DGGE能将其在PCR时形成的不同序列分离开，这样就可能导致过高的估计环境中的微生物多样性；DGGE只能检测到环境中优势菌群的存在。Muyer等(1993)的研究也表明，只有占整个群落细菌数量约1％或以上的类群能够通过DGGE检测到。
发明内容
为了进一步提高PCR-DGGE工艺对水环境微生物的鉴定效果，本发明的技术方案为：采用新的核心设备-DGGE电泳槽，优化了PCR-DGGE技术流程，从而实现对水环境中种类繁多、好/厌氧类型混杂的微生物类群进行精确鉴定。
1、一种水环境微生物鉴定方法，包括如下步骤：
(1)提取底泥中的微生物DNA，
(2)用采用通用引物对GC-F338和R518，PCR扩增目的片段，
所述引物GC-F338：5′-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCACGG GGG GTAC GGG AGG CAG CAG-3′，
R518：5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’；
(3)DGGE电泳分离PCR产物，
(4)DGGE条带的切胶回收后重新PCR，所述引物为F338和R518，
所述引物F338：5’-TAC GGGAGG CAG CAG-3′，
R518：5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’；
(5)回收二次PCR产物，与表达载体连接，转化，培养，提取质粒，PCR检测，
(6)阳性质粒测序，确定所含微生物的种类。
所述表达载体为Pmd18-T载体。
所述转化所用生物体为DH5α感受态细胞。
所述PCR检测中所述引物为M13-47和RV-M，
所述引物M13-47：5′-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3′，
RV-M：5′-GAG CGGATAACAATT TCA CAC ACA AGG-3′。
由于污泥成分的复杂性，和微生物种类的多样性，常规的PCT-DGGE对污泥样本的检测杂乱，无法判断优势类群，本发明对常规的PCR-DGGE的工艺方法进行了优化，在第一次得到PCR产物是不是直接用于测序，而是将产物克隆，再次进行PCR检测，得到的阳性质粒再用于测序，可清楚地鉴定出种类繁多的水环境微生物优势类群。如实施例所述，对于某水域中某个点的测定，其表层优势微生物种类为10种，而其亚表层为16类。
本发明优化后PCR-DGGE方法适用范围广，在不同水体类型、不同污染程度的水环境中均可以发挥预期的功能。
附图说明
图1基因组提取：从左至右94# 97# 20# 76# 83# 86# 78# 62# 175a 64a 79a 67# 77#|#表示样点包括表层和亚表层，a表示表层b表示亚表层
图2基因组PCR：从左至右20# 62# 76#
图3液体纯化：从左至右39# 123# 20# 35# 62# 64# 76# 79# 83# 86# 94# 97# 175a
图4DGGE电泳图谱
图5DGGE后PCR：从左至右62#(b1 b2 b3 b4 ab1 ab2 ab3 ab4 ab5 ab6 ab7 ab8 ab9 ab10)64#(1a-8a)
括号内与DGGE切胶条带对应，a代表表层b代表亚表层ab表示表层和亚表层共有。
图6固体纯化：从左至右35#(ab1 ab2 b1 b2 ab3 b3 ab4)62#(b1 b2 b3 b4 ab1 ab2 ab3 ab4 ab5 ab6ab7 ab8 ab9 ab10)括号内与DGGE切胶条带对应，a代表表层b代表亚表层ab表示表层和亚表层共有。
图7克隆后菌落
图8菌落PCR：从左至右175#(1a-6a)62#(b1 b2 b3 b4 ab1 ab2 ab3 ab4 ab5 ab6 ab7 ab8 ab9ab10)括号内与DGGE切胶条带对应，a代表表层b代表亚表层ab表示表层和亚表层共有
图9测序图谱(北京博迈得生物公司)
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
采得某水域的底泥样品经车载冰箱运回并放入-20℃冰箱保存待用
提取底泥中的微生物基因组DNA
参照FastDNA SPIN Kit for Soil试剂盒步骤(www.mpbio.com)，其结果如图1所示。
2.PCR扩增目的片段
通过PCR将所需16SRNA片段扩增出来，所得PCR产物为长度在180bp左右片段见图2，其中引物设计参照文献中通用引物F338 R518，由博迈得生物公司设计合成由于DGGE电泳的分离特点在F338端加入一段GC夹子得到GC-F338引物。
引物GC-F338：5′-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGGGTAC GGGAGG CAG CAG-3′，
R518：5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’。
3.PCR产物的纯化
纯化步骤参照博迈得生物公司PCR产物纯化试剂盒步骤操作，其结果见图3。
4.DGGE电泳分离PCR产物
DGGE是基序列的不同、将DNA序列分开。双链DNA分子中，A、T碱基之间有2个氢键，而G、C碱基之间有3个氢键连接，因此A、T碱基对对变性剂的耐受性要低于G、C碱基对。由于这4种碱基的组成和排列差异，使不同序列双链DNA分子具有不同的解链温度。当双链DNA片段在含有梯度变性剂(尿素、甲酞胺)的聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，解链的速度、程度与其序列密切相关，当某一双链DNA序列迁移到变性凝胶的一定位置、并达到解链温度时，即开始部分解链，部分解链的DNA片段的迁移速度随解链程度的增大而减小，从而使不同序列的DNA片段滞留于凝胶的不同位置，经过染色后凝胶形成为指纹带谱。理论上，只要选择的电泳条件(变性剂梯度、电泳时间、电压等)足够精细，仅有单一碱基差异的DNA片段也可被分开。见图4。
5.DGGE条带的切胶回收
将DGGE凝胶中的清晰条带，用干净的镊子切下，条带尽量切得细腻均匀，将切胶条带置于一个干净的EP管中，并加入40μL的无菌水，4℃，放置12-24h。
6.DGGE条带的切胶回收后的重新PCR
以第5步的无菌水为模板，扩增引物使用F338和R518，PCR结果如图5所示。
引物F338：5′-TAC GGGAGG CAG CAG-3′，
R518：5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’。
7.重新PCR产物的回收(使用博迈得试剂盒纯化)
步骤参照北京博迈得生物公司凝胶回收纯化试剂盒，如图6所示。
8.第7步回收产物与Pmd18-T载体(从Takara公司购买，本申请人的大学实验室有保存，可以对公众发放)的连接
9.转化DH5α感受态细胞，见图7。
10.挑取白色的单菌落，摇菌，提取质粒，PCR检测，设计引物M13-47和RV-M。结果见图8。
引M13-475′-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3′，
RV-M：5′-GAG CGG ATAACAATT TCA CAC ACAAGG-3′。
11.阳性样品送公司测序
测序工作由北京博迈得生物公司完成
测序图谱(部分见图9)
菌种查询(经genbank比对得出菌种查询序号以及部分经纯培养菌种)
Claims (4)
1.一种水环境微生物鉴定方法，包括如下步骤：
(1)提取底泥中的微生物DNA，
(2)用采用通用引物对GC-F338和R518，PCR扩增目的片段，
所述引物GC-F338：5′-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCACGG GGG GTAC GGG AGG CAG CAG-3′，
R518：5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’；
(3)DGGE电泳分离PCR产物，
(4)DGGE条带的切胶回收后重新PCR，所述引物为F338和R518，
所述引物F338：5’-TAC GGGAGG CAG CAG-3′，
R518：5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’；
(5)回收二次PCR产物，与表达载体连接，转化，培养，提取质粒，PCR检测，
(6)阳性质粒测序，确定所含微生物的种类。
2.根据权利要求1所述的方法，所述表达载体为Pmd18-T载体。
3.根据权利要求1所述的方法，所述转化所用生物体为DH5α感受态细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，所述PCR检测中所述引物为M13-47和RV-M，
所述引物M13-47：5′-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3′，
RV-M：5′-GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC ACA AGG-3′。
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|---|---|---|---|---|
| WO2018012011A1 (ja) * | 2016-07-11 | 2018-01-18 | 三菱ケミカル株式会社 | 口腔内検査方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101475987A (zh) * | 2009-01-13 | 2009-07-08 | 南京大学 | 废水生物处理反应器中微生物群落组成的快速分子检测方法 |
| CN101570786A (zh) * | 2009-06-11 | 2009-11-04 | 江南大学 | 用变性梯度电泳鉴定白酒大曲或酒醅酵母群落结构的方法 |
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- 2011-09-28 CN CN201110295515A patent/CN102304586A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN101570786A (zh) * | 2009-06-11 | 2009-11-04 | 江南大学 | 用变性梯度电泳鉴定白酒大曲或酒醅酵母群落结构的方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| ALEJANDRO LÓPEZ-CORTÉS 等: "Screening and Isolation of PHB-Producing Bacteria n a Polluted Marine Microbial Mat", 《MICROB ECOL》 * |
| GERARD MUYZER 等: "Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
| JUAN C.LOPEZ-GUTIERREZ 等: "Quantification of a novel group of nitrate-reducing bacteria in the environment by real-time PCR", 《JOURNAL OF MICROBIOLOGICAL METHODS》 * |
| MASSIMO MARZORATI等: "How to get more out of molecular fingerprints:practical tools for microbial ecology", 《ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
| 刑德峰 等: "不同16S rDNA靶序列对DGGE分析活性污泥群落的影响", 《环境科学》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018012011A1 (ja) * | 2016-07-11 | 2018-01-18 | 三菱ケミカル株式会社 | 口腔内検査方法 |
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