CN110484479A - 一株Paracoccus kondratievae及其在降解白酒有害酯中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种Paracoccus kondratievae BJQ0001、该菌的培养方法及其应用。该保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18604，分离自酒曲，具有催化降解邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸双(2‑乙基己)酯的能力，对改善白酒的品质具有重要意义，具有较好的应用潜力。

Description

一株Paracoccus kondratievae及其在降解白酒有害酯中的 应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种Paracoccus kondratievae及其高效催化降解白酒有害酯中的应用。

技术背景

邻苯二甲酸酯(又称酞酸酯，phthalic acid esters，PAEs)，是邻苯二甲酸形成的酯的统称，俗称塑化剂、增塑剂。常见PAEs包括邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DOP)、邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯(DEHP)和邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)。其中邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)在实际的使用中占比最高，约37.1％，每年超过300万吨。邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate，DBP)是聚氯乙烯最常用的增塑剂，可使制品具有良好的柔软性。稳定性、耐挠曲性、黏结性和防水性均优于其他增塑剂，因而成为DEHP之外，使用最普遍的PAEs之一。

白酒生产过程中自身发酵环节不产生塑化剂，白酒产品中的塑化剂属于特定迁移，主要源于塑料接酒桶、塑料输酒管、酒泵进出乳胶管、封酒缸塑料布、成品酒塑料内盖等。塑化剂易溶于有机溶剂，而白酒中乙醇浓度大，会溶解塑料制品中的塑化剂成分而污染白酒。基于PAEs的使用以及目前已知的白酒中塑化剂的可能来源，白酒生产过程易于受到DBP和DEHP的迁移污染，目前研究已经认识到DBP和DEHP对白酒产品潜在的迁移污染，且已经有专利针对白酒中的DBP和DEHP进行专门的检测(申请号201710038033.9)。因此，本发明选定DBP和DEHP作为代表性的PAEs，筛选可能的降解菌株，以为白酒中邻苯二甲酸酯的降解提供优选的微生物资源。

发明内容

本发明的目的是提供一株自酒曲中筛选出的可以同时高效降解DMP、DEP、DBP和DEHP的菌株及其应用。

本发明的菌株经鉴定为Paracoccus kondratievae，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCCNo.18604，保藏日期为2019年9月19日。

本发明所述菌株由酒曲中分离和筛选获得。进一步地，所述Paracoccuskondratievae BJQ0001菌株的16S rRNA序列如SEQ ID No.1所示。由上述序列构建系统发育树分析进化亲缘关系，如图1所示。该结果表明菌株与Paracoccus kondratievae的进化关系最近，应属于Paracoccus kondratievae。

实验检测结果表明，该菌株可以DBP或者DEHP作为唯一碳源生长和繁殖，且在培养基中存在DBP和DEHP时可以同时降解，降解率分别达到99.43％±0.53％和33.13％±5.96％，同时研究发现该菌株对DEP和DMP的降解率均达到99％以上；在含有DMP和/或DEP和/或DBP和/或DEHP的培养基中生长时，对DMP、DEP、DBP、DEHP的最高降解率分别达99.87％、99.36％、99.43％和33.13％。这充分说明该菌株在处理邻苯二甲酸酯污染的白酒产品方面独特的应用潜力。目前尚未发现降解邻苯二甲酸酯的Paracoccus kondratievae菌株。本发明可以为白酒中邻苯二甲酸酯的降解提供优选的微生物资源。

本发明还提供所述的Paracoccus kondratievae BJQ0001在催化降解白酒有害酯中的应用。

其中，所述有害酯为邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯和/或邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯。

具体应用时，在白酒发酵制备过程中，将所述的Paracoccus kondratievaeBJQ0001或其粗酶制剂适量添加到白酒发酵的酒醅中。其中，所述粗酶制剂是将Paracoccuskondratievae BJQ0001的培养液，经破碎菌体细胞后，离心取上清液得到的。优选地，所述粗酶制剂是使用超声波细胞破碎仪破碎菌体细胞，6000×g，离心10min，取上清液，作为粗酶制剂。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所述Paracoccus kondratievae BJQ0001可以高效降解邻苯二甲酸酯DMP、DEP、DBP和DEHP，能利用DMP、DEP、DBP和DEHP作为唯一碳源生长和繁殖，将该菌株应用于白酒产品中邻苯二甲酸酯DBP和DEHP的处理，对改善白酒的品质具有重要意义，具有较好的应用潜力。

本发明的分散泛菌(Paracoccus kondratievae)BJQ0001，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.18604，保藏日期为2019年9月19日。

附图说明

图1Paracoccus kondratievae BJQ0001基因16S rRNA系统发育分析

图2Paracoccus kondratievae BJQ0001对DMP、DEP、DBP和DEHP的降解率，其中，NEG，空白对照。

具体实施方式

结合具体实施方式对本发明进行详细说明，但应理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。本发明以下实施例中，若没有特殊说明，所用试剂皆可在市场上购买得到，若没有特殊说明，所涉及方法皆为常规方法。

实施例1菌株BJQ0001的分离

取浓香白酒酿造用中温大曲酒曲样品1g，加入10mL生理盐水，搅拌10min，静置10分钟，取上清液加入筛选培养基30℃富集培养24h，取富集培养菌液涂布筛选培养基平板，30℃过夜培养。对生长菌落，进行筛选培养基平板划线分纯，重复划线5次，以获得菌种的纯培养，将这些菌落分别进行进一步测试其是否确实具有降解有害酯的能力(具体方法参照下述实施例3)，其中两个菌落具有较明显的降解有害酯的能力，其中一个菌落编号为BJQ0001。随后本发明人对这个菌落做了进一步的研究。

该菌在筛选培养基平板过夜培养为半透明菌落，表面湿润，边缘光滑，易被接种环挑起，直径0.5–0.8mm。

所述筛选培养基，其组成包括：酵母粉5.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.0g/L，MgSO₄·7H₂O，CaCl₂·2H₂O 0.01g/L，FeSO₄·7H₂O 0.001g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 1.5g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，固体加入2％琼脂粉，115℃灭菌20min，加入终浓度800mg/L的邻苯二甲酸酯。

实施例2菌株BJQ0001的鉴定

为了对菌株BJQ0001进行分子生物学鉴定，以确定其分类，设计了下述引物用于PCR扩增16S rRNA序列：

27F：5’-agagtttgatcmtggctcag-3’；1492R：5’-ggttaccttgttacgactt-3’。

提取菌株BJQ0001的基因组DNA，然后按下述参数进行PCR扩增，以获得知其16SrRNA序列。

表1 PCR反应体系扩增16S rRNA基因

试剂组成	使用量(μl)
		ddH<sub>2</sub>O	21.0
dNTP Mixture(2.5mM each)	3.0
		10×Ex Taq Buffer	3.0
正向引物(10μM)	0.6
		反向引物(10μM)	0.6
模板基因组DNA	0.8
		Ex Taq(5U/μl)	1.0
Total	30.0

PCR扩增循环

PCR扩增所得DNA片段，经DNA凝胶电泳，条带大小为1.5Kb左右，符合预期，后送至测序公司进行序列解析。根据测序序列，通过EzBioCloud专业细菌分类鉴定网站进行序列比对，选取近源序列，利用软件MEGA构建系统发育树(见图1)，分析BJQ0001与已知序列的相似性，确定该菌株属于Paracoccus kondratievae。

实施例3菌株BJQ0001对DMP、DEP、DEHP和DBP的降解

Paracoccus kondratievae BJQ0001的培养方法，其特征在于，培养基组成包括：(NH₄)₂SO₄ 2.0g/L，MgSO₄·7H₂O，CaCl₂·2H₂O 0.01g/L，FeSO₄·7H₂O 0.001g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 1.5g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，115℃灭菌20min，加入终浓度200mg/L的DBP和DEHP。10mL培养基放入100mL三角瓶中，接种量1–3％。培养条件为：30±2℃，150±50rpm，培养3–7天。

培养完毕，将10mL发酵液移入50mL离心管，加入2mL正己烷，剧烈震荡混匀30秒，离心，取上清过滤离心进行气相色谱内标法定量检测。检测条件如下：

色谱柱：Agilent 19091N-213I；检测条件：80℃，保持5min；以20℃/min的速度升至250℃，保持23.5min。进样量1μl，不分流。载气为氮气，流速为1mL/min，FID检测器。

结果证实，菌株BJQ0001具有在水相体系催化降解DMP、DEP、DBP和DEHP的能力，降解率分别为99.87％±0.08％、99.36％±0.76％、99.43％±0.53％和33.13％±5.96％(图2)。

序列表

<110> 北京工商大学

<120>一株Paracoccus kondratievae及其在降解白酒有害酯中的应用

<160> 3

<170> Patent-In 3.3

<210> 1

<211> 1436

<212> DNA

<213>Paracoccus kondratievae 16S rDNA

<220>

<223>

<400> 1

taccttgtta cgacttcacc ccagtcgctg agcctaccgt ggtccgctgc ctccattgct 60

ggttagcgca cggccgtcgg gtagacccaa ctcccatggt gtgacgggcg gtgtgtacaa 120

ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gttccgcgat tactagcgat tccaacttca 180

tggggtcgag ttgcagaccc caatccgaac tgagatggct tttggggatt aacccactgt 240

caccaccatt gtagcacgtg tgtagcccaa cccgtaaggg ccatgaggac ttgacgtcat 300

ccacaccttc ctccgaccta tcatcggcag ttctcctaga gtgcccaacc aaatgatggc 360

aactaggagt gtgggttgcg ctcgttgccg gacttaaccg aacatctcac gacacgagct 420

gacgacagcc atgcagcacc tgtctccagg ccaccgaagt ggagacccgg tctctcgggc 480

tgtcctggga tgtcaagggt tggtaaggtt ctgcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc 540

tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt taatcttgcg accgtactcc 600

ccaggcggaa tgcttaatcc gttaggtgtg tcaccgaaca gcatgctgcc cgacgactgg 660

cattcatcgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgtttgctc cccacgcttt 720

cgcacctcag cgtcagtatc gagccagtga gccgccttcg ccactggtgt tcctccgaat 780

atctacgaat ttcacctcta cactcggaat tccactcacc tctctcgaac tccagaccga 840

tagttttgaa ggcagttccg gggttgagcc ccgggatttc acccccaact ttccggtccg 900

cctacgtgcg ctttacgccc agtaattccg aacaacgcta gccccctccg tattaccgcg 960

gctgctggca cggagttagc cggggcttct tctgctggta cagtcattat cttcccagct 1020

gaaagagctt tacaacccta gggccttcat cactcacgcg gcatggctag atcagggttg 1080

cccccattgt ctaagattcc ccactgctgt ctcccgtagg agtctgggcc gtgtctcagt 1140

cccagtgtgg ctgatcatcc tctcaaacca gctatggatc gtcggcttgg taggccatta 1200

ccccaccaac tacctaatcc aacgcgggcc gatcccttgc cgataaatct ttgcccccag 1260

atctccatga tcagggggat catgcggtat taatcccagt ttcccggggc tattccgcag 1320

caaggggcac gttcccacgc gttactcacc cgtccgccgc taggaccgaa gtcctcgctc 1380

gacttgcatg tgttaggcct gccgccagcg ttcgttctga gccaggatca aactct 1436

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 2

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (6)

1.一种Paracoccus kondratievae BJQ0001，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18604。

2.根据权利要求1所述的Paracoccus kondratievae BJQ0001在催化降解白酒有害酯中的应用。

3.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述有害酯为邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯和/或邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：在白酒发酵制备过程中，将所述的Paracoccus kondratievae BJQ0001或其粗酶制剂适量添加到白酒发酵的酒醅中。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述粗酶制剂是将Paracoccuskondratievae BJQ0001的培养液，经破碎菌体细胞后，离心取上清液得到的。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述粗酶制剂是使用超声波细胞破碎仪破碎菌体细胞，6000×g，离心10min，取上清液，作为粗酶制剂。