CN114606167A - 一种污水脱氮菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种污水脱氮菌剂及其制备方法和应用，属于环境微生物技术领域。本发明一方面提供了一种污水脱氮菌剂，其含有康德拉氏副球菌(Paracoccus kondratievae)ZJB21134和溶血不动杆菌(Acinetobacter haemolyticus strain)ZJB21135，本发明另一方面提供了该污水脱氮菌剂的制备方法和应用。本发明的菌剂可快速降解市政污水中的总氮、氨氮等组分，处理效果好，制备方法和应用工艺操作简单，能耗和成本低。

Description

一种污水脱氮菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种污水脱氮菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

在过去的几十年中，随着人类活动的加剧和含氮肥料的大规模使用，导致了严重的水污染问题。过度的氨氮排放入水体中，造成水体富营养化，引起藻类等生物大量繁殖，导致鱼类大量死亡及水质恶化。同时氨氮在水中可以被转化为有生物毒性的亚硝氮和硝氮，因此也成为了我国重点控制的水污染物指标。

生物脱氮是解决氮污染较为经济有效的方法之一。近年来，一类被称为异养硝化-好氧反硝化细菌的微生物逐渐进入人们的视野中，相较于其他脱氮微生物，其具有以下优点：(1)可以同时进行硝化和反硝化，脱氮效率高；(2)生长速度快，环境适应力强；(3)反硝化过程中产生的碱度可以部分补偿硝化过程中的碱度消耗，对脱氮过程中所需缓冲量较少。因此，异养硝化-好氧反硝化菌具有更为广泛的应用前景。

通常情况下，由于物种之间的共生、群体感应和协同作用等机制，微生物群落相比单菌有更好的适应性和稳定性。因此异养硝化-好氧反硝化细菌群落在实际应用中具有更好的脱氮性能，对复杂的污水环境有更加优异的耐受能力。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种污水脱氮菌剂及其制备方法和应用的技术方案。

本发明具体采用以下技术方案：

本发明一方面提供一种污水脱氮菌剂，其含有康德拉氏副球菌(Paracoccuskondratievae)ZJB21134和溶血不动杆菌(Acinetobacter haemolyticus strain)ZJB21135；

其中康德拉氏副球菌(Paracoccus kondratievae)ZJB21134，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，分类命名为康德拉氏副球菌ZJB21134(Paracoccus kondratievae ZJB21134)，保藏编号为CCTCC NO：M20211514，保藏日期2021年11月30日；

其中溶血不动杆菌(Acinetobacter haemolyticus strain)ZJB21135，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，分类命名为康德拉氏副球菌ZJB21135(Acinetobacter haemolyticus strain ZJB21135)，保藏编号为CCTCC NO：M20211543，保藏日期2021年12月06日。

本发明另一方面提供一种污水脱氮菌剂的制备方法，其包括以下步骤：

1)将康德拉氏副球菌ZJB21134和溶血不动杆菌ZJB21135分别以1％接种，在LB培养基中30℃、160rpm培养24h；

2)4℃、8000rpm离心10min以获得湿菌体；

3)取两个菌的湿菌体各10g，并加入20g硅藻土、20g活性炭、10g微孔淀粉以及少量水充分混匀，于37℃干燥箱烘干30h，得到固定化复合菌剂。

本发明另一方面提供一种污水脱氮菌剂在含氮污水脱氮处理中的应用。

进一步，所述的应用，其包括以下步骤：

将污水脱氮菌剂接种至含氮污水中，添加碳源和氮源至C/N比值为5～15,于30℃～40℃、80～200rpm下进行培养，去除废水中的氨氮。

进一步，所述碳源为丁二酸钠、乙酸钠和柠檬酸钠中的一种或几种。

进一步，所述氮源为硫酸铵、硝酸钾和亚硫酸钠中的一种或几种。

进一步，所述添加碳源和氮源至C/N比值为10，于30℃、160rpm下进行培养。

本发明的菌剂可快速降解市政污水中的总氮、氨氮等组分，处理效果好，制备方法和应用工艺操作简单，能耗和成本低。

附图说明

图1为康德拉氏副球菌ZJB21134的电镜图。

图2为溶血不动杆菌ZJB21135的电镜图。

图3是高浓度氨氮下单菌和复合菌剂的生长曲线图。

图4是高浓度氨氮下单菌和复合菌剂的氨氮降解示意图。

图5是高浓度氨氮下单菌和复合菌剂脱氮相关酶活力比较示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：异养硝化-好氧反硝化细菌的筛选及鉴定

取2～3g杭州某污水处理公司的生物转盘泥样加入到装有100mL无菌水的锥形瓶中，于摇床上震荡3h后，用移液枪吸取2mL液体接种于已灭菌的LB培养基中，于30℃，180rpm条件下培养2～3d。

上述LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水定容至1000mL，自然pH。

取菌种培养液接入装有无菌水的试管中，按比例进行稀释，分别得到菌种浓度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7和10^-8梯度的细菌悬浮液；然后采用平板涂布法，分别从各梯度细菌悬浮液中吸取100μL涂布于溴百里酚蓝(BTB)固体培养基上，30℃培养4d，挑取变蓝的菌落进行划线分离，分离纯化3次以上直至菌落特征基本一致，然后接种于斜面培养基上并保存于4℃冰箱。

所述溴百里酚蓝(BTB)固体培养基按如下组成配制：硝酸钾(KNO₃)1.01g，丁二酸钠(C₄H₄Na₂O₄)8.5g，七水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)1.0g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)1.0g，七水硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)0.59g，氯化钙(CaCl₂)0.09g，1％溴百里酚蓝乙醇溶液1mL，蒸馏水定容至1000mL，琼脂20g，用1mol/L NaOH调至pH 7.0-7.3。

从BTB固体培养基上筛选得到的两株异养硝化-好氧反硝化细菌，分别命名为ZJB21134和ZJB21135。

菌株ZJB21134的16S rDNA序列长度为1359bp，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。将菌株序列结果上传至NCBI数据库，与数据库中已有的细菌16S rDNA基因序列进行比对，结果表明该菌为Paracoccus kondratievae。

菌株ZJB21135的16S rDNA序列长度为1431bp，其基因序列如SEQ ID NO.2所示。将菌株序列结果上传至NCBI数据库，与数据库中已有的细菌16S rDNA基因序列进行比对，结果表明该菌为Acinetobacter haemolyticus strain。

对上述菌种进行保藏：菌株ZJB21134为康德拉氏副球菌(Paracoccuskondratievae)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20211514，保藏日期为2021年11月30日，地址为中国武汉市武汉大学。菌株ZJB21135为溶血不动杆菌(Acinetobacter haemolyticus strain)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20211543，保藏日期为2021年12月8日，地址为中国武汉市武汉大学。

菌株ZJB21134的电镜图如图1所示。其生物学特征为：革兰氏阴性菌，淡粉色圆形小菌落，边缘光滑，湿润，粘稠，易挑取。适宜pH为7.0～9.0，适宜生长温度为30～40℃。

菌株ZJB21135的电镜图如图2所示。其生物学特征为：革兰氏阴性菌，米黄色圆形小菌落，边缘光滑，湿润，粘稠，易挑取。适宜pH为7.0～9.0，适宜生长温度为30～40℃。

实施例2：高浓度氨氮下复合菌剂相较于单菌脱氮效果的提升

高浓度氨氮培养基配方为：硫酸铵[(NH₄)₂SO₄]2.36g，乙酸钠(CH₃COONa)17.08g，硫酸镁(MgSO₄)0.1g，三水合磷酸氢二钾(K₂HPO4·3H₂O)6.5g，磷酸二氢钾(KH₂PO4)1.5g，微量元素溶液2mL，蒸馏水定容至1000mL，pH值7.0-7.5；其中微量元素溶液包括：EDTA 50g，七水硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)3.92g，氯化钙(CaCl₂)5.5g，四水氯化锰(MnCl₂·4H₂O)5.1g，七水硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)5.0g，四水钼酸铵[(NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O]1.1g，五水硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)1.6g，六水氯化钴(CoCl₂·6H₂O)1.6g，用蒸馏水定容至1000mL。

处理方式为：ZJB21134和ZJB21135的种子液为分别在LB培养基30℃，160rpm培养12h的2mL菌悬液，复合菌剂的种子液为ZJB21134和ZJB21135种子液各1mL的混合菌悬液，30℃、160rpm培养。每隔12h取样分别测定OD₆₀₀和NH₄ ⁺-N值，结果见图3和4。

由图4可知，相较于单菌，复合菌剂有更高的氨氮降解效率，在48小时内将氨氮浓度从521.4mg/L降至5.8mg/L，基本实现了氨氮的全部去除。而ZJB21134和ZJB21135在48小时分别只降解了71.7％和67.2％的氨氮，表明复合菌剂提高了高浓度氨氮负载下的脱氮效率。

实施例3：复合菌剂与单菌的氮平衡分析

处理方式为：使用实施例2中的培养基，测定初始培养基中的氨氮浓度以及培养48h后不同组别中上清液的氨氮、硝氮、亚硝氮和细胞内氮浓度，并以此计算损失的气态氮浓度，绘制表格。

由表1可知，在初始的508.52mg/L氮中，ZJB21135利用了355.35mg/L，其中250.55mg/L通过同化作用转化为细胞内氮，转化率为70.51％，同时有28.37％通过异养硝化-好氧反硝化途径转化为气态氮。而在被ZJB21134利用的374.33mg/L初始氮中这一转化率分别为73.02％和26.70％。过高的氮同化会导致大量污泥产生，从而增加污水处理厂的运行成本。复合菌剂缓解了这种情况，在相同的时间内移除了多达499.91mg/L的初始氮，并且将氮同化占比降低至62.47％，将气态氮转化率提高到37.93％。这意味着复合菌剂在加速氮移除的同时改善了同化与异化的比例，将有助于减少污泥的产生。另外，在单菌中发现了代谢中间产物硝酸盐的积累，而在复合菌剂中没有检测到任何中间体的产生。

表1.复合菌剂与单菌的氮平衡分析

-：未检测出

气态氮浓度＝初始氮浓度-48h氮浓度-细胞内氮浓度

实施例4：复合菌剂相较于单菌脱氮相关酶活力的提升

处理方式为：使用实施例2中的培养基，将单菌及复合菌剂在30℃、160rpm的条件下培养至对数生长期，4℃、10000rpm离心10min收集菌体，随后用磷酸缓冲液(20mM，pH7.5)洗涤三次并重悬菌体。重悬液置于冰上超声破碎15min，4℃、8000rpm离心5min收集上清液，即粗酶液用于测定脱氮相关酶活。测定不同组别粗酶液中氨单加氧酶(AMO)、羟胺脱氢酶(HAO)和硝酸盐还原酶(NAP)的活力。其中，一个酶活单位(U)定义为每分钟催化1μmol底物所需要的酶量。比酶活(U/mg)定义为每毫克蛋白所具有的酶活力单位。

如图5所示，与单一菌株相比，复合菌剂在不同程度上提高了三种酶的活性，表明复合菌剂可以通过增强脱氮相关酶活力来加快氨氮去除速率。硝化阶段的第一个关键酶AMO能够将铵根离子氧化成羟胺，它在复合菌剂中的活性分别是ZJB21135和ZJB21134的10.62倍和1.32倍。HAO负责将羟胺转化为亚硝酸盐或者硝酸盐，其活性超过其他两个酶一个数量级，在ZJB21135和ZJB21134以及复合菌剂中分别达到0.111、0.137和0.192U/mg。作为反硝化阶段的第一个酶，NAP将硝酸盐还原为亚硝酸盐。与AMO和HAO相比，复合菌剂中NAP活性增加不显著，分别为ZJB21135和ZJB21134的1.48倍和1.01倍。结果表明，复合菌剂中两个菌的协同作用通过提高酶活加速了体系的代谢能力，进而促进了氮的代谢。

实施例5：复合菌剂在不同处理条件下的脱氮能力

(1)不同碳源对复合菌剂脱氮效率的影响：改变实施例2中高浓度氨氮培养基的碳源分别为乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠、蔗糖和葡萄糖，固定碳源含量为5g/L(以C计)，在30℃、160rpm的条件下，测定24、36和48h复合菌剂的氨氮降解能力，结果如表2所示。表明以丁二酸钠、乙酸钠和柠檬酸钠为碳源时48h氨氮清除率高达99％左右，远高于含量相同(以C计)的蔗糖尤其是葡萄糖作为碳源时的清除率。同时考虑到价格因素，乙酸钠可能是最佳的碳源类型。

(2)不同碳氮比对复合菌剂脱氮效率的影响：改变实施例2中的高浓度氨氮培养基乙酸钠含量，使培养基中C/N质量比值分别为2、5、10、15和20，在30℃、160rpm的条件下，测定24、36和48h复合菌剂的氨氮降解能力，结果如表2所示。表明当C/N质量比值为10时，氨氮清除率最高，48h达到100％。同时在低C/N的情况下(C/N＝5)仍有不错的降解效率，表明该复合菌剂在低营养污水中有更广阔的应用价值。

(3)不同氮源对复合菌剂脱氮效率的影响：改变实施例2中高浓度氨氮培养基的氮源分别为硫酸铵、硝酸钾和亚硫酸钠，固定氮源含量为0.5g/L(以N计)，在30℃、160rpm的条件下，测定24、36和48h复合菌剂的氮源降解能力，结果如表2所示。结果表明在48h该复合菌剂对不同的氮源均有优异的处理效果，同时在第24和36h硝氮和亚硝氮降解速率高于氨氮，说明复合菌剂的反硝化能力大于硝化能力。以上结果均表明，复合菌剂在复杂含氮污水处理中有广阔的应用前景。

表2.复合菌剂在不同条件下的脱氮能力

实施例6：固定化复合菌剂的制备

将ZJB21134和ZJB21135分别以1％接种在LB培养基中30℃、160rpm培养24h；然后4℃、8000rpm离心10min以获得湿菌体。取两个菌的湿菌体各10g，并加入20g硅藻土、20g活性炭、10g微孔淀粉以及少量水充分混匀，于37℃干燥箱烘干30h，可得50g左右固定化复合菌剂。

实施例7：复合菌剂在实际污水中的脱氮效果

污水样品取自杭州某污水处理厂。取100mL上述污水水样，接种1g固定化复合菌剂(如实施例6中所述)，在30℃、160rpm的条件下培养。每隔12h取样测定污水处理前后总氮和氨氮浓度，测定结果如表3所示。

表3.污水样品处理前后氮元素浓度变化

由表3可知，本菌剂对污水中的总氮和氨氮均有很好的清除效果。12h基本去除了所有氨氮，而在24h去除了149.1mg/L总氮，降解率51.0％。相较于现有的脱氮微生物，本菌剂应用范围广，能够适应多种碳源和浓度并对不同的氮源均有优异的降解能力，因此为不同程度的污染水体提供了解决方案，是一种具有广阔应用前景的污水处理方式。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种污水脱氮菌剂及其制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1359

<212> DNA

<213> 康德拉氏副球菌(Paracoccus kondratievae)

<400> 1

ctgcgcggac taccatgcag tcgagcgagg acttcggttc tagcggcgga cgggtgagta 60

acgcgtggga acgtgccctt tgctgcggaa tagccccggg aaactgggag taataccgca 120

tgagcccttc gggggaaaga tttatcggca aaggatcggc ccgcgttgga ttaggtagtt 180

ggtggggtaa tggcctacca agccgacgat ccatagctgg tttgagagga tgatcagcca 240

cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atcttagaca 300

atgggggcaa ccctgatcta gccatgccgc gtgagtgatg aaggccctag ggttgtaaag 360

ctctttcagc tgggaagata atgacggtac cagcagaaga agccccggct aactccgtgc 420

cagcagccgc ggtaatacgg agggggctag cgttgttcgg aattactggg cgtaaagcgc 480

acgtaggcgg accggaaagt tgggggtgaa atcccggggc tcaaccccgg aactgccttc 540

aaaactatcg gtctggagtt cgagagaggt gagtggaatt ccgagtgtag aggtgaaatt 600

cgtagatatt cggaggaaca ccagtggcga aggcggctca ctggctcgat actgacgctg 660

aggtgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 720

atgaatgcca gtcgtcgggc agcatgctgt tcggtgacac acctaacgga ttaagcattc 780

cgcctgggga gtacggtcgc aagattaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 840

cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgcagaac cttaccaacc cttgacatcc 900

cgggaccgct ccagagatgg agtttccact tcggtggctc ggagacaggt gctgcatggc 960

tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttcgg ttaagtccgg caacgagcgc aacccacact 1020

cctagttgcc agcatttggt tgggcactct aggagaactg ccgatgataa gtcggaggaa 1080

ggtgtggatg acgtcaagtc ctcatggccc ttacgggttg ggctacacac gtgctacaat 1140

ggtggtgaca gtgggttaat ccccaaaagc catctcagtt cggattgggg tctgcaactc 1200

gaccccatga agttggaatc gctagtaatc gcggaacagc atgccgcggt gaatacgttc 1260

ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttg ggtctacccg acggccgtgc 1320

gctaaccagc aatgggggca gcgaccacgg tgatcgccc 1359

<210> 2

<211> 1431

<212> DNA

<213> 溶血不动杆菌(Acinetobacter haemolyticus strain)

<400> 2

gggtcggcac gtggtagcgt cctcccttgc ggttagacta cctacttctg gtgcacaaac 60

tcccatggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcattctg 120

atccgcgatt actagcgatt ccgacttcat ggagtcgagt tgcagactcc aatccggact 180

acgatcggct ttttgagatt agcatcctat cgctaggtag caaccctttg taccgaccat 240

tgtagcacgt gtgtagccct ggtcgtaagg gccatgatga cttgacgtcg tccccgcctt 300

cctccagttt gtcactggca gtatccttaa agttcccggc ttaacccgct ggcaaataag 360

gaaaagggtt gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca 420

gccatgcagc acctgtatgt aagttcccga aggcaccaat ccatctctgg aaagttctta 480

ctatgtcaag accaggtaag gttcttcgcg ttgcatcgaa ttaaaccaca tgctccaccg 540

cttgtgcggg cccccgtcaa ttcatttgag ttttagtctt gcgaccgtac tccccaggcg 600

gtctacttat cgcgttagct gcgccactaa agcctcaaag gccccaacgg ctagtagaca 660

tcgtttacgg catggactac cagggtatct aatcctgttt gctccccatg ctttcgtacc 720

tcagcgtcag tattaggcca gatggctgcc ttcgccatcg gtattcctcc agatctctac 780

gcatttcacc gctacacctg gaattctacc atcctctccc atactctagc tgaccagtat 840

cgaatgcaat tcctaagtta agctcaggga tttcacatcc gacttaatca gccgcctacg 900

cacgctttac gcccagtaaa tccgattaac gctcgcaccc tctgtattac cgcggctgct 960

ggcacagagt tagccggtgc ttattctgcg agtaacgtcc actatctcta ggtattaact 1020

agagtagcct cctcctcgct taaagtgctt tacaaccaaa aggccttctt cacacacgcg 1080

gcatggctgg atcaggcttc cgcccattgt ccaatattcc ccactgctgc ctcccgtagg 1140

agtctgggcc gtgtctcagt cccagtgtgg cggatcatcc tctcagaccc gctacagatc 1200

gtcgccttgg taggccttta ccccaccaac tagctaatcc gacttaggct catctattag 1260

cgcaaggtcc gaagatcccc tgctttctcc cgtaggacgt atgcggtatt agcattcctt 1320

tcggaatgtt gtcccccact aataggcaga ttcctaagca ttactcaccc gtccgccgct 1380

aggtaatgta gcaagctaca ctcccccgct cgactgcatg gtagctccca c 1431

Claims (7)

1.一种污水脱氮菌剂，其特征在于含有康德拉氏副球菌(Paracoccus kondratievae)ZJB21134和溶血不动杆菌(Acinetobacter haemolyticus strain)ZJB21135，所述康德拉氏副球菌ZJB21134的保藏号为CCTCC NO:M20211514，所述溶血不动杆菌ZJB21135的保藏号为CCTCC NO:M20211543。

2.如权利要求1所述的一种污水脱氮菌剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将康德拉氏副球菌ZJB21134和溶血不动杆菌ZJB21135分别以1％接种，在LB培养基中30℃、160rpm培养24h；

2)4℃、8000rpm离心10min以获得湿菌体；

3)取两个菌的湿菌体各10g，并加入20g硅藻土、20g活性炭、10g微孔淀粉以及少量水充分混匀，于37℃干燥箱烘干30h，得到固定化复合菌剂。

3.如权利要求1所述的一种污水脱氮菌剂在含氮污水脱氮处理中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于包括以下步骤：

将污水脱氮菌剂接种至含氮污水中，添加碳源和氮源至C/N比值为5～15，于30℃～40℃、80～200rpm下进行培养，去除废水中的氨氮。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述碳源为丁二酸钠、乙酸钠和柠檬酸钠中的一种或几种。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述氮源为硫酸铵、硝酸钾和亚硫酸钠中的一种或几种。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述添加碳源和氮源至C/N比值为10，于30℃、160rpm下进行培养。

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