CN105368745B - 一种治理黑臭河流的复合微生物制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种治理黑臭河流的复合微生物制剂及其制备方法，制备该复合微生物剂的原料为：脱氮硫杆菌菌粉40‑60份，复合芽孢杆菌菌粉10‑40份，复合酵母菌粉10‑40份。本发明针对性的筛选降解黑臭底泥中的硫化物，有机质以及适应在黑臭底泥中生长的菌株，由高效降解硫化氢与脱氮的脱氮硫杆菌，富产蛋白酶，淀粉酶，纤维素酶等酶系的解淀粉芽孢杆菌，酿酒酵母与产朊假丝酵母，兼性厌氧的地衣芽孢杆菌，能快速改善黑臭河流的水体质量与去除底泥黑臭。
Description
技术领域
本发明涉及黑臭河道治理技术领域，特别是涉及一种用于快速治理黑臭河流，削减底泥的一种复合微生物菌剂及其制备方法。
背景技术
随着我国经济的发展和人口的增多，用水量不断增大，大量未经有效处理的农田径流，工业废水和生活污水排入河道，一些河道几乎沦为纳污河。污染浓度远远超出了河道的自净能力，大部份河道长期处于黑臭状态，严重影响了河道沿岸居民生活和城市形象。水体污染物大量淤积，底泥厚度不断增加，河道过水断面减少，影响河道排洪，泄洪以及航运功能。黑臭底泥也是河道重要的内源污染，通过耗氧，释放有机污染物和N，P营养盐等，使上覆水体水质恶化。
河道黑臭、底泥累积是我国城市河网的普遍现象。研究表明，底泥有机污染物长期厌氧分解产生硫化氢等臭气以及硫化铁等有色金属硫化物，是造成黑臭的主要原因，底泥氮、磷二次释放会构成水体富营养化。
在河道黑臭治理方面，目前国际上流行的方法是通过提高底泥的氧化还原电位（如投加硝酸钙，过氧化钙），以氧化底泥硫化物和抑制底泥磷释放；其中，通过投加硝酸钙来消除河道黑臭在国内外已有工程应用实例，然而该种技术存在处理周期长（1-2年），且容易促进氨氮和硝酸盐过量释放，造成氮的二次污染等缺点。目前，在快速消除底泥黑臭方面国内外做了一些新的尝试，如在投加硝酸钙的同时加入其它氧化剂（过氧化钙或双氧水），或通过加大硝酸钙投加量来缩短处理周期，然而据报道，硫化物去除率达到96%以上的处理周期仍然需要一个月左右；余光伟等在专利号201310230547.6中公开了一种基于反硝化除硫的黑臭河道底泥原位氧化技术，该技术包括黑臭河道湿法或干法投加底泥氧化剂（硝酸钙与硝酸钠的混合物）、底泥氨氮浸提剂（氯化钠或氯化钾）和底泥酸碱调节剂（石灰或稀硝酸），能够同时除硫脱氮固磷，可快速消除河道黑臭，抑制底泥氮磷释放，提高水体水质，其主要是投加一些化学氧化剂来促进底泥中的脱氮硫氧化细菌的生长来降解硫化物，但Murphy T P等认为加入硝酸钙等能够加速PAHs（多环芳烃）的生物降解作用，但投加硝酸钙后，不同区域的有机物降解差别很大。含有磷的有机物能够提供营养磷酸盐，克服硝酸盐沉淀磷酸盐无生物可用营养盐的缺陷，但磷含量较少的有机物则无法提低足够的磷酸盐。硝酸钙对不同区域中磷的抑制差别较大，因此，有机物降解也呈现较大差别。另外，河流污染底泥生物需氧量较高，修复中需要投加的氧化剂较大，因此存在成本高，实施困难的问题。
发明内容
为了克服现有技术的缺点，本发明提供一种用于治理黑臭河流的复合微生物菌剂，具体说是提供一种快速治理黑臭河流，削减底泥的复合微生物菌剂，该复合微生物菌剂含有既能快速降解底泥的可挥发性硫化物（AVS），还能在底泥层厌氧情况下，将亚硝酸盐，氨态氮，硝酸盐还原成为氮气的脱氮硫杆菌，解决了底泥二次氮的二次释放问题，同时含有富产蛋白酶，淀粉酶，纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌，能利用多种酶系的分解有机质而产生二氧化碳的酿酒酵母菌与产朊假丝酵母菌，二氧化碳可作为脱氮硫杆菌的碳源合成菌体。好氧菌（解淀粉芽孢杆菌与产朊假丝酵母菌）能在氧含量充足的河道上层水体进行快速繁殖而快速降解水体中的有机质，氨态氮与总磷。兼性厌氧菌（地衣芽孢杆菌与酿酒酵母菌）能够快速削减底泥厚度，降低上覆水体的COD，TP，TN。
并且利用微生物“共生、共存、共荣”的微生态学原理大部份菌是通过两两混合发酵，大大减少了生产设备的投资与生产工作量。
本发明的另一目的是提供该复合微生物菌剂的制备方法。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种治理黑臭河流的复合微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤
：脱氮硫杆菌菌粉的制备
A、脱氮硫杆菌半固体种子活化培养：将脱氮硫杆菌种穿刺在半固体脱氮硫杆菌培养基中， 30℃培养5-7天，待穿刺的菌线长出菌苔，即可作为活化的脱氮硫杆菌种
B、脱氮硫杆菌种子培养：将活化的脱氮硫杆菌种接种至脱氮硫杆菌种子液体培养基中，温度30℃，厌氧培养5-7天，检测种子的OD420≥0.4，即为脱氮硫杆菌种子培养液；
C、发酵培养：将脱氮硫杆菌种子培养液与发酵培养基以1：10-1：20的接种量接种，培养温度31℃，第一天厌氧培养，搅拌速度为120转/分钟，第二天开始通气培养，通气量为每分钟的液气比为1：0.05,第三天通气量为每分钟的液气比为1：0.1，第四天通气量为每分钟的液气比为1：0.15，从第五天开始，通气量为每分钟的液气比为1：0.2；待培养至60小时，开始流加已经灭菌的100 g/L的硫代硫酸钠溶液至发酵培养液中，在24小时内将发酵培养液中的硫代硫酸钠的浓度调至5 g/L，继续培养3-5天，待检测其OD420≥1.2，活菌数≥50亿cfu/ml，即可放罐，过滤后用轻质碳酸钙吸附，调节菌浓度为50亿cfu/g，20-30℃风干，即得脱氮硫杆菌菌粉；
其中，所述的脱氮硫杆菌种子液体培养基：五水合硫代硫酸钠 5.0 g，硝酸钾 2.0g，碳酸氢钠 1.0 g，磷酸二氢钾 2.0 g，六水合硫酸镁 0.5 g，氯化钙 0.005 g， 氯化铵0.5 g，溶于1000 mL水中，调节 pH 到 7.0，121 ℃灭菌 30 min 备用；其中，所述的半固体脱氮硫杆菌培养基为脱氮硫杆菌种子液体培养基中加1%的琼脂；
其中，所述的发酵培养基：五水合硫代硫酸钠4 g/L，硝酸钾1 g/L，氯化铵08g/L，磷酸氢二钾3 g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.3g/L，碳酸氢钠4 g/L，碳酸钙20 g/L，微量元素 20ml/L, pH 到 7.0，121 ℃灭菌 30 min；
其中，所述的微量元素组成为：EDTA二钠0.14g，硫酸亚铁0.5g，浓硫酸0.05ml，硫酸锌10mg，氯化锰3mg，硼酸30mg，氯化钴20mg，氯化铜1mg，氯化镍2mg，钼酸钠3mg，蒸馏水1000毫升，PH3-4，121℃灭菌15分钟。
步骤
、复合芽孢杆菌菌粉的制备
A、解淀粉芽孢杆菌菌种的制备
取出菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，37℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种50毫升LB培养基中，在培养箱中37℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至5L大三角瓶中，装液量为2L，LB培养基，37℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过40亿cfu/ml，即可作为解淀粉芽孢杆菌液体菌种；
B、地衣芽孢杆菌菌种的制备
取出菌种保藏管，用营养肉汁固体培养基划平板进行复苏，37℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种50毫升营养肉汁培养基中，在培养箱中37℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至5L大三角瓶中，装液量为2L，营养肉汁培养基，37℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过20亿cfu/ml，即可作为地衣芽孢杆菌液体菌种；
C、混合固体发酵
将上述制备的解淀粉芽孢杆菌液体菌种与地衣芽孢杆菌液体菌种以1：1的比例混合均匀后，以2%的接种量接种至灭菌的芽孢杆菌固体发酵培养基上，菌种与固体培养基混合均匀后，将接好种的固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为15-25cm，前8小时控温37-40℃，8-20小时控温39-42℃，16小时后控温37-39℃，湿度保持为50%-75%，发酵24-32小时，检测其总芽孢含量不低于100亿/g，解淀粉芽孢杆菌含量不低于50亿/g，地衣芽孢杆菌含量不低于40亿/g，烘干或晒干，即得到复合芽孢杆菌菌粉；
其中，所述营养肉汁培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；
其中，所述LB液体发酵培养基：蛋白胨10，酵母膏5 g/L，氯化钠10 g/L；pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；
芽孢杆菌固体发酵培养基：麸皮800kg，稻糠100kg，玉米粉50kg,豆粕粉50kg,硫酸镁0.5kg,硫酸铵1.0kg,硫酸锰0.5kg,料水比1：1；
各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
步骤
、复合酵母菌粉的制备
采用酿酒酵母与产朊假丝酵母菌按以下步骤进行培养：
A、酿酒酵母种子液的制备：取出酿酒酵母菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种200毫升PDA培养基中，在培养箱中30℃震荡培养24小时。种子采用10%的接种量，接种至2L PDA液体培养基中，30℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过10亿cfu/ml，即可作为酿酒酵母菌种子液体；
B、产朊假丝酵母菌种子液的制备：取出产朊假丝酵母菌菌种保藏管，用产朊假丝酵母固体培养基划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种200毫升产朊假丝酵母培养基中，在培养箱中30℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至3L的产朊假丝酵母培养基，30℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过6亿cfu/ml，即可作为产朊假丝酵母菌种子液；
C、混合发酵培养：将上述制备的酿酒酵母菌种子液体与产朊假丝酵母菌种子液按1：1的比例混合均匀后作为混合酵母种子，以5%的接种量接种至600L的酵母菌发酵培养基中，开搅拌120r/min，通气量350L/min，30℃培养20-28小时，待酵母菌总含量不低于30亿cfu/ml，产朊假丝酵母菌含量不低于10亿cfu/ml，即可结束发酵，板框过滤除水，剩下菌体加轻质碳酸钙，调节菌浓为20亿cfu/g，干燥即得到复合酵母菌粉；
其中，所述的PDA培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，固体培养基中加入琼脂2%；
其中，所述的产朊假丝酵母培养基：蔗糖 12g，磷酸氢二钾0.5g，碳酸钙5g，七水硫酸镁0.5g，氯化铁0.005g，酵母膏0.4g，水1000mlpH 7.0-7.2，固体培养基中加琼脂20g；
其中，所述的酵母菌发酵培养基：糖蜜120 g/L，玉米粉10g/L，玉米浆10g/L，酵母膏0.3 g/L，蛋白胨0.5 g/L，氯化铵0.5 g/L，硫酸镁0.1 g/L。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
步骤
、混合粉碎
按脱氮硫杆菌菌粉 40-60份，复合芽孢杆菌菌粉10-40份，复合酵母菌粉10-40份的重量比，混合均匀，粉碎过100目筛，即得到复合微生物制剂。
其中，所述的治理黑臭河流施用方法为：向黑臭河流均匀洒复合微生物菌剂的量为5-20克/平方米；可干洒也可对水湿洒。
本发明中的复合微生物菌剂中含有脱氮硫杆菌，1904 年 Benjeric 首先分离到脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)，之后Baalsurd 研究了它的生理特性。脱氮硫杆菌广泛存在于土壤、淡水和海洋沉积物、污水处理池中，是一种兼性厌氧菌，兼性厌氧，可在 10～37℃，pH 为 4.0～9.5 的条件下生长，最适宜的生长温度为 28~30℃，最适宜的pH 为 6.5～7.0。
脱氮硫杆菌为革兰氏阴性化能自养细菌，电镜观察，菌细胞短杆状、单个、成对或短链状排列，具有单根极生鞭毛，无芽孢，菌体大小约为 0.3~0.8μm×0.8~3.0 μm。脱氮硫杆菌能在好氧和厌氧条件下以硫代硫酸盐和 S2-作为能源、以 CO2作为碳源进行生长，厌氧（兼性厌氧）条件下可以硝酸盐作为电子受体还原为 N2。正因为脱氮硫杆菌以二氧化碳为碳源，对水体有害的亚硝酸盐、硫化氢等均可被氧化为无毒的物质，同时减低了水体中的生物消耗量和化学耗氧量。其反硝化过程如下：脱氮硫杆菌胞内含 1，5-二磷酸核酮糖羧化酶和 5-磷酸核酮糖激酶，可通过卡尔文循环途径来固定 CO2。脱氮硫杆菌以还原态硫作为电子供体 ，同时以硝酸盐作为电子受体，将其还原为 N2，完成自养反硝化过程。由于脱氮硫杆菌有脱硫的性质, 近年来利用脱氮硫杆菌氧化二价硫、从沼气或天然气中去除 H2S 气体的研究十分活跃。李志章等研究了 H2S 气体的生物脱除，比较了光合硫细菌、排硫硫杆菌、脱氮硫杆菌、氧化亚铁硫杆菌、异养菌等多种细菌的脱硫效果和混合菌群的脱硫效果，脱氮硫杆菌具有比较明显的优势。何品晶等提出，接种纯菌种的脱臭装置，其处理能力与脱除率比混合接种脱臭装置有明显的提高。在此基础上，张承中通过将脱氮硫杆菌接种到生物滴滤塔上脱除 H2S 气体，表明该种细菌具有良好的缓冲和除臭的效果。随着生物技术和化学工程学的不断发展，脱氮硫杆菌因其独特的生理生化特性已成为颇具潜力的研究对象。目前，脱氮硫杆菌在废气和废水处理中的应用主要集中在：（1）好氧脱硫；（2）厌氧脱硫；（3）厌氧反硝；（4）厌氧同步脱硫脱氮并将脱硫产物控制在单质硫阶段。控制适宜的生态条件，使硫化物氧化（S2-→S0）和硝酸盐还原（NO3-→N2）两过程中的电子转移达到平衡，实现同步脱硫脱氮并回收单质硫的目标，将是最具应用价值的发展方向。该工艺具备以下优点：（1）无需对反应器进行曝气，降低运行成本；（2）无需外加有机物作为电子受体，既降低成本又避免了增大反应器的负荷，造成二次污染；（3）生成的单质硫可进行资源回收，取得良好的经济效益。但还没有将脱氮硫杆菌运用到河流底泥治理的相关技术方案公开。
本发明的复合微生物菌剂中的脱氮硫杆菌施入黑臭河流中与载体轻质碳酸钙一起沉入底泥上，碳酸钙本身作为河道底泥的pH调节剂，使底泥程弱酸或中性，而为脱氮硫杆菌提供繁殖的生存环境，脱氮硫杆菌会快速适应底泥的厌氧环境，进行快速繁殖，而氧化黑臭河流底泥中的硫化物，从而快速减少黑臭程度，部分菌体悬浮在河道水体中进行有氧繁殖，施入河道的脱离氮硫杆菌能在好氧和厌氧条件下以硫代硫酸盐和 S2-作为能源、以CO2作为碳源进行生长，厌氧条件下可以硝酸盐作为电子受体还原为 N2，起到脱硫除氮的作用。
本发明中的复合微生物菌剂含有解淀粉芽孢杆菌与产朊假丝酵母菌，解淀粉芽孢杆菌与产朊假丝酵母菌作为好氧菌，其在底泥上覆水体中或底泥表面含氧较高的水体中，解淀粉芽孢杆菌与产朊假丝酵母菌能够快速萌发，繁殖生长，在生长过程中产生大量的淀粉酶，纤维素酶，蛋白酶，能够快速降解水体中的高分子有机质，从而能快速降低水体中的COD，氨态氮，总磷。
本发明中的复合微生物除臭剂含有地衣芽孢杆菌与酿酒酵母，地衣芽孢杆菌与酿酒酵母为为兼性厌氧菌，能够在底泥中的厌氧层或水体中的低氧情况下都能够生长，利用菌体生长过程中所分泌的多种酶系分解底泥与水体中的有机质，并降解底泥中的氨态氮，总磷，酿酒酵母菌并产生二氧化碳，可为脱氮硫杆菌提供部分碳源。并且在好氧层的水体中，地衣芽孢杆菌与酿酒酵母菌也能快速生长，但较解淀粉芽孢杆菌与产朊假丝酵母菌的繁殖速度要慢一些。解淀粉芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，酿酒酵母菌，产朊假丝酵母菌将高分子有机质降解为低分子的二氧化碳，氨态氮，亚硝酸盐，硝酸盐，乙醇，醋酸等低分子物质，而其中的，二氧化碳，硝酸盐，亚硝酸盐，氨态氮，底泥中的硫化物，能够被水体与底泥中的脱氮硫杆菌通过好氧与厌氧反应进行氧化还原成氮气，硫或者硫酸，或者合成自身菌体，从而达到快速去除水体与底泥中黑臭硫化物，COD，总氮，总磷，削减底泥厚度。
本发明将筛选得到的五株菌株，以“共生、共存、共荣”的微生态学原理、功能菌在代谢转化过程中的协同分工机制，代谢产物偶联代谢机制为指导，结合微生物生理生态习性、拮抗共生特性、营养需求等，以正交实验为指导确定各类混合菌株的最佳发酵条件、构建协同代谢、互惠共生的高效复合菌剂。
本发明的优越之处在于：
1、菌剂由多种微生物菌种构成，各菌株在水体与底泥中各有分布，降解各类物质如黑臭硫化物，水体中有机质，底泥有机质针对性强，降解效果显著，菌剂微生物在各类河道底泥与水体中能良好生长，迅速占据有利生态位，抑制产黑臭微生物生长繁殖，降低恶臭释放强度，实现恶臭原位源头控制；
2、菌剂由高效脱氮除硫的脱氮硫杆菌，富产蛋白酶，淀粉酶，纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌，高效降解高分子有机质，氨氮，总磷的酿酒酵母与产朊假丝酵母等有益微生物构成，有益菌在河道底泥与水体中生长繁殖，协同作用，有效改善了水体与底泥中的生态环境，解淀粉芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，酿酒酵母菌，产朊假丝酵母菌将高分子有机质降解为低分子的二氧化碳，氨态氮，亚硝酸盐，硝酸盐，乙醇，醋酸等低分子物质，而其中的，二氧化碳，硝酸盐，亚硝酸盐，氨态氮，底泥中的硫化物，能够被水体与底泥中的脱氮硫杆菌通过好氧与厌氧反应进行氧化还原成氮气，硫或者硫酸，或者合成自身菌体，从而达到快速去除水体与底泥中黑臭硫化物，COD，总氮，总磷，削减底泥厚度；
3、本发明的微生物除臭菌剂由5种微生物经过发酵制成，大部份菌是通过两两混合发酵，大大减少了生产设备的投资与生产工作量；
4、菌剂的载体主要是由碳酸钙组成，施入河流底泥后可以起到调节底泥pH的作用，以减少由于脱氮硫杆菌氧化硫化物转为硫酸对底泥pH的影响，同时可提供碳酸根作为脱氮硫杆菌的碳源；
下面结合试验说明本发明的复合微生物菌剂在黑臭河流治理的效果。
深圳市共乐涌黑臭河道原位修复试验案例：
共东涌河道周边有工业区和生活区，接纳大量工业废水与生活污水，大量污染物进入河道，严重超出了河道水体的自净能力，底泥大量淤积，水体常年处于黑臭状态，且河道离西乡地铁站不远，100米远处都能闻到恶心的臭气，行人都是掩鼻而行。在河道中选取120米长的河段，两边截断。采用本发明的复合微生物制剂进行底泥原位修复试验。河道面积宽约8米，按整个河道面积为960平米计算，每平米撒复合微生物菌剂为10g/平方米。
试验结果如下：
河道表观：在施入复合微生物菌剂后，第二天开始水体发白，第三天开始，底泥明显不黑，河道黑臭现象明显改善，第四天开始取样，明显底泥已经不黑，还有臭味，但岸边已经不见臭味，底泥厚度明显变少，试验完成后，水体变绿透明度已经达到40cm以上。水体从第6天开始发绿，应该有藻类开始生长，其水质变化如表1，从表1可以看出，在使用复合微生物菌剂第16天后，水体中的COD，TN，TP的去除率可达到71%以上；从表2底泥变化中也可看出底泥中的AVS（硫化物）在第12天即去除率已经达到了99%，经过16天的氧化，其底泥厚度被削减了32cm，底泥中的有机物去除了超过60%。
表1河道水体水质指标
| 采样时间（d） | COD(mg/kg) | 去除率(%) | TN(mg/kg) | 去除率(%) | TP(mg/kg) | 去除率(%) |
| 0 | 338.4 | 0 | 56.01 | 0 | 28.49 | 0 |
| 4 | 261.8 | 22.64 | 42.68 | 23.78 | 21.12 | 25.86 |
| 8 | 149.9 | 55.7 | 26.9 | 51.96 | 12.92 | 54.65 |
| 12 | 99.4 | 70.63 | 18.04 | 67.79 | 10.10 | 64.55 |
| 16 | 71.3 | 78.93 | 13.96 | 75.07 | 8.08 | 71.64 |
表2河道底泥指标
具体实施方式
本发明实质性特点可从下述实施例中得以体现，但这些实施例仅作为说明，而不是对本发明进行限制。
实施例1
一种治理黑臭河流的复合微生物制剂，主要以下重量份的原料混合制备而成：脱氮硫杆菌菌粉 50份，复合芽孢杆菌菌粉30份，复合酵母菌粉20份。
一种治理黑臭河流的复合微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤
：脱氮硫杆菌菌粉的制备
A、脱氮硫杆菌半固体种子活化培养：将脱氮硫杆菌种穿刺在半固体脱氮硫杆菌培养基中， 30℃培养6天，待穿刺的菌线长出菌苔，即可作为活化的脱氮硫杆菌种
B、脱氮硫杆菌种子培养：将活化的脱氮硫杆菌种接种至脱氮硫杆菌种子液体培养基中，温度30℃，厌氧培养6天，检测种子的OD420为0.42，即为脱氮硫杆菌种子培养液；
C、发酵培养：将脱氮硫杆菌种子培养液与发酵培养基以1：12的接种量接种，培养温度31℃，第一天厌氧培养，搅拌速度为120转/分钟，第二天开始通气培养，通气量为每分钟的液气比为1：0.05,第三天通气量为每分钟的液气比为1：0.1，第四天通气量为每分钟的液气比为1：0.15，从第五天开始，通气量为每分钟的液气比为1：0.2；待培养至60小时，开始流加已经灭菌的100 g/L的硫代硫酸钠溶液至发酵培养液中，在24小时内将发酵培养液中的硫代硫酸钠的浓度调至5 g/L，继续培养4天，待检测其OD420为1.24，活菌数为52亿cfu/ml，即可放罐，过滤后用轻质碳酸钙吸附，调节菌浓度为50亿cfu/g，20-30℃风干，即得脱氮硫杆菌菌粉；
其中，所述的脱氮硫杆菌种子液体培养基：五水合硫代硫酸钠 5.0 g，硝酸钾 2.0g，碳酸氢钠 1.0 g，磷酸二氢钾 2.0 g，六水合硫酸镁 0.5 g，氯化钙 0.005 g， 氯化铵0.5 g，溶于1000 mL水中，调节 pH 到 7.0，121 ℃灭菌 30 min 备用；其中，所述的半固体脱氮硫杆菌培养基为脱氮硫杆菌种子液体培养基中加1%的琼脂；
其中，所述的发酵培养基：五水合硫代硫酸钠4 g/L，硝酸钾1 g/L，氯化铵08g/L，磷酸氢二钾3 g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.3g/L，碳酸氢钠4 g/L，碳酸钙20 g/L，微量元素 20ml/L, pH 到 7.0，121 ℃灭菌 30 min；
其中，所述的微量元素组成为：EDTA二钠0.14g，硫酸亚铁0.5g，浓硫酸0.05ml，硫酸锌10mg，氯化锰3mg，硼酸30mg，氯化钴20mg，氯化铜1mg，氯化镍2mg，钼酸钠3mg，蒸馏水1000毫升，PH3-4，121℃灭菌15分钟。
步骤
、复合芽孢杆菌菌粉的制备
A、解淀粉芽孢杆菌菌种的制备
取出菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，37℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种50毫升LB培养基中，在培养箱中37℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至5L大三角瓶中，装液量为2L，LB培养基，37℃震荡培养24小时，检测其菌液浓度，活菌含量为42亿cfu/ml，作为解淀粉芽孢杆菌液体菌种；
B、地衣芽孢杆菌菌种的制备
取出菌种保藏管，用营养肉汁固体培养基划平板进行复苏，37℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种50毫升营养肉汁培养基中，在培养箱中37℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至5L大三角瓶中，装液量为2L，营养肉汁培养基，37℃震荡培养24小时，检测其菌液浓度，活菌含量为21亿cfu/ml，即作为地衣芽孢杆菌液体菌种；
C、混合固体发酵
将上述制备的解淀粉芽孢杆菌液体菌种与地衣芽孢杆菌液体菌种以1：1的比例混合均匀后，以2%的接种量接种至灭菌的芽孢杆菌固体发酵培养基上，菌种与固体培养基混合均匀后，将接好种的固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为20cm，前8小时控温37-40℃，8-20小时控温39-42℃，16小时后控温37-39℃，湿度保持为50%-75%，发酵28小时，检测其总芽孢含量为108亿/g，解淀粉芽孢杆菌含量为55亿/g，地衣芽孢杆菌含量为53亿/g，即烘干或晒干，即得到复合芽孢杆菌菌粉；
其中，所述营养肉汁培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；
其中，所述LB液体发酵培养基：蛋白胨10，酵母膏5 g/L，氯化钠10 g/L；pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；
固体发酵培养基：麸皮800kg，稻糠100kg，玉米粉50kg,豆粕粉50kg,硫酸镁0.5kg,硫酸铵1.0kg,硫酸锰0.5kg,料水比1：1；
各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
步骤
、复合酵母菌粉的制备
采用酿酒酵母与产朊假丝酵母菌按以下步骤进行培养：
A、酿酒酵母种子液的制备：取出酿酒酵母菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种200毫升PDA培养基中，在培养箱中30℃震荡培养24小时。种子采用10%的接种量，接种至2L PDA液体培养基中，30℃震荡培养22小时，检测其菌液浓度，活菌含量为10.5亿cfu/ml，即作为酿酒酵母菌种子液体；
B、产朊假丝酵母菌种子液的制备：取出产朊假丝酵母菌菌种保藏管，用产朊假丝酵母固体培养基划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种200毫升产朊假丝酵母培养基中，在培养箱中30℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至3L的产朊假丝酵母培养基，30℃震荡培养26小时，检测其菌液浓度，活菌含量为7亿cfu/ml，即作为产朊假丝酵母菌种子液；
C、混合发酵培养：将上述制备的酿酒酵母菌种子液体与产朊假丝酵母菌种子液按1：1的比例混合均匀后作为混合酵母种子，以5%的接种量接种至600L的酵母菌发酵培养基中，开搅拌120r/min，通气量350L/min，30℃培养24小时，待酵母菌总含量为31亿cfu/ml，产朊假丝酵母菌含量为12亿cfu/ml，结束发酵，板框过滤除水，剩下菌体加轻质碳酸钙，调节菌浓为20亿cfu/g，干燥即得到复合酵母菌粉；
其中，所述的PDA培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，固体培养基中加入琼脂2%；
其中，所述的产朊假丝酵母培养基：蔗糖 12g，磷酸氢二钾0.5g，碳酸钙5g，七水硫酸镁0.5g，氯化铁0.005g，酵母膏0.4g，水1000mlpH 7.0-7.2，固体培养基中加琼脂20g；
其中，所述的酵母菌发酵培养基：糖蜜120 g/L，玉米粉10g/L，玉米浆10g/L，酵母膏0.3 g/L，蛋白胨0.5 g/L，氯化铵0.5 g/L，硫酸镁0.1 g/L。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
步骤
、混合粉碎
按脱氮硫杆菌菌粉 50份，复合芽孢杆菌菌粉30份，复合酵母菌粉20份的重量比，混合均匀，粉碎过100目筛，即得到复合微生物制剂。
实施例2
一种治理黑臭河流的复合微生物制剂，主要以下重量份的原料混合制备而成：脱氮硫杆菌菌粉 55份，复合芽孢杆菌菌粉30份，复合酵母菌粉15份。
治理黑臭河流的复合微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤
：脱氮硫杆菌菌粉的制备
A、脱氮硫杆菌半固体种子活化培养：将脱氮硫杆菌种穿刺在半固体脱氮硫杆菌培养基中， 30℃培养7天，待穿刺的菌线长出菌苔，即可作为活化的脱氮硫杆菌种
B、脱氮硫杆菌种子培养：将活化的脱氮硫杆菌种接种至脱氮硫杆菌种子液体培养基中，温度30℃，厌氧培养7天，检测种子的OD420为0.5，即为脱氮硫杆菌种子培养液；
C、发酵培养：将脱氮硫杆菌种子培养液与发酵培养基以1：15的接种量接种，培养温度31℃，第一天厌氧培养，搅拌速度为120转/分钟，第二天开始通气培养，通气量为每分钟的液气比为1：0.05,第三天通气量为每分钟的液气比为1：0.1，第四天通气量为每分钟的液气比为1：0.15，从第五天开始，通气量为每分钟的液气比为1：0.2；待培养至60小时，开始流加已经灭菌的100 g/L的硫代硫酸钠溶液至发酵培养液中，在24小时内将发酵培养液中的硫代硫酸钠的浓度调至5 g/L，继续培养5天，待检测其OD420为1.3，活菌数为58亿cfu/ml，即可放罐，过滤后用轻质碳酸钙吸附，调节菌浓度为50亿cfu/g，20-30℃风干，即得脱氮硫杆菌菌粉；
其中，所述的脱氮硫杆菌种子液体培养基：五水合硫代硫酸钠 5.0 g，硝酸钾 2.0g，碳酸氢钠 1.0 g，磷酸二氢钾 2.0 g，六水合硫酸镁 0.5 g，氯化钙 0.005 g， 氯化铵0.5 g，溶于1000 mL水中，调节 pH 到 7.0，121 ℃灭菌 30 min 备用；其中，所述的半固体脱氮硫杆菌培养基为脱氮硫杆菌种子液体培养基中加1%的琼脂；
其中，所述的发酵培养基：五水合硫代硫酸钠4 g/L，硝酸钾1 g/L，氯化铵08g/L，磷酸氢二钾3 g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.3g/L，碳酸氢钠4 g/L，碳酸钙20 g/L，微量元素 20ml/L, pH 到 7.0，121 ℃灭菌 30 min；
其中，所述的微量元素组成为：EDTA二钠0.14g，硫酸亚铁0.5g，浓硫酸0.05ml，硫酸锌10mg，氯化锰3mg，硼酸30mg，氯化钴20mg，氯化铜1mg，氯化镍2mg，钼酸钠3mg，蒸馏水1000毫升，PH3-4，121℃灭菌15分钟。
步骤
、复合芽孢杆菌菌粉的制备
A、解淀粉芽孢杆菌菌种的制备
取出菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，37℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种50毫升LB培养基中，在培养箱中37℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至5L大三角瓶中，装液量为2L，LB培养基，37℃震荡培养26小时，检测其菌液浓度，活菌含量为44亿cfu/ml，即作为解淀粉芽孢杆菌液体菌种；
B、地衣芽孢杆菌菌种的制备
取出菌种保藏管，用营养肉汁固体培养基划平板进行复苏，37℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种50毫升营养肉汁培养基中，在培养箱中37℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至5L大三角瓶中，装液量为2L，营养肉汁培养基，37℃震荡培养26小时，检测其菌液浓度，活菌含量为22亿cfu/ml，即作为地衣芽孢杆菌液体菌种；
C、混合固体发酵
将上述制备的解淀粉芽孢杆菌液体菌种与地衣芽孢杆菌液体菌种以1：1的比例混合均匀后，以2%的接种量接种至灭菌的芽孢杆菌固体发酵培养基上，菌种与固体培养基混合均匀后，将接好种的固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为20cm，前8小时控温37-40℃，8-20小时控温39-42℃，16小时后控温37-39℃，湿度保持为50%-75%，发酵30小时，检测其总芽孢含量为121亿/g，解淀粉芽孢杆菌含量为68亿/g，地衣芽孢杆菌含量为53亿/g，即烘干或晒干，即得到复合芽孢杆菌菌粉；
其中，所述营养肉汁培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；
其中，所述LB液体发酵培养基：蛋白胨10，酵母膏5 g/L，氯化钠10 g/L；pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；
葡萄糖8g/L，玉米粉20 g/L， 鱼粉10 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.1 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，磷酸氢二钠2.0 g/L，pH7.0；
固体发酵培养基：麸皮800kg，稻糠100kg，玉米粉50kg,豆粕粉50kg,硫酸镁0.5kg,硫酸铵1.0kg,硫酸锰0.5kg,料水比1：1；
各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
步骤
、复合酵母菌粉的制备
采用酿酒酵母与产朊假丝酵母菌按以下步骤进行培养：
A、酿酒酵母种子液的制备：取出酿酒酵母菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种200毫升PDA培养基中，在培养箱中30℃震荡培养24小时。种子采用10%的接种量，接种至2L PDA液体培养基中，30℃震荡培养26小时，检测其菌液浓度，活菌含量为11亿cfu/ml，即作为酿酒酵母菌种子液体；
B、产朊假丝酵母菌种子液的制备：取出产朊假丝酵母菌菌种保藏管，用产朊假丝酵母固体培养基划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种200毫升产朊假丝酵母培养基中，在培养箱中30℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至3L的产朊假丝酵母培养基，30℃震荡培养26小时，检测其菌液浓度，活菌含量为7亿cfu/ml，即作为产朊假丝酵母菌种子液；
C、混合发酵培养：将上述制备的酿酒酵母菌种子液体与产朊假丝酵母菌种子液按1：1的比例混合均匀后作为混合酵母种子，以5%的接种量接种至600L的酵母菌发酵培养基中，开搅拌120r/min，通气量350L/min，30℃培养20-28小时，检测酵母菌总含量为35亿cfu/ml，产朊假丝酵母菌含量为13亿cfu/ml，即可结束发酵，板框过滤除水，剩下菌体加轻质碳酸钙，调节菌浓为20亿cfu/g，干燥即得到复合酵母菌粉；
其中，所述的PDA培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，固体培养基中加入琼脂2%；
其中，所述的产朊假丝酵母培养基：蔗糖 12g，磷酸氢二钾0.5g，碳酸钙5g，七水硫酸镁0.5g，氯化铁0.005g，酵母膏0.4g，水1000mlpH 7.0-7.2，固体培养基中加琼脂20g；其中，所述的酵母菌发酵培养基：糖蜜120 g/L，玉米粉10g/L，玉米浆10g/L，酵母膏0.3 g/L，蛋白胨0.5 g/L，氯化铵0.5 g/L，硫酸镁0.1 g/L。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
步骤
、混合粉碎
按脱氮硫杆菌菌粉 55份，复合芽孢杆菌菌粉30份，复合酵母菌粉15份的重量比，混合均匀，粉碎过100目筛，即得到复合微生物制剂。
Claims (2)
1.一种治理黑臭河流的复合微生物制剂，其特征在于主要以下重量份的原料混合制备而成：
脱氮硫杆菌菌粉40-60份，复合芽孢杆菌菌粉10-40份，复合酵母菌粉10-40份；
所述的一种治理黑臭河流的复合微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)、脱氮硫杆菌菌粉的制备
A、脱氮硫杆菌半固体种子活化培养：将脱氮硫杆菌种穿刺在半固体脱氮硫杆菌培养基中，30℃培养5-7天，待穿刺的菌线长出菌苔，即可作为活化的脱氮硫杆菌种；
B、脱氮硫杆菌种子培养：将活化的脱氮硫杆菌种接种至脱氮硫杆菌种子液体培养基中，温度30℃，厌氧培养5-7天，检测种子的OD420≥0.4，即为脱氮硫杆菌种子培养液；
C、发酵培养：将脱氮硫杆菌种子培养液与发酵培养基以1：10-1：20的接种量接种，培养温度31℃，第一天厌氧培养，搅拌速度为120转/分钟，第二天开始通气培养，通气量为每分钟的液气比为1：0.05，第三天通气量为每分钟的液气比为1：0.1，第四天通气量为每分钟的液气比为1：0.15，从第五天开始，通气量为每分钟的液气比为1：0.2；待培养至60小时，开始流加已经灭菌的100g/L的硫代硫酸钠溶液至发酵培养液中，在24小时内将发酵培养液中的硫代硫酸钠的浓度调至5g/L，继续培养3-5天，待检测其OD420≥1.2，活菌数≥50亿cfu/ml，即可放罐，过滤后用轻质碳酸钙吸附，调节菌浓度为50亿cfu/g，20-30℃风干，即得脱氮硫杆菌菌粉；
其中，所述的脱氮硫杆菌种子液体培养基：五水合硫代硫酸钠5.0g，硝酸钾2.0g，碳酸氢钠1.0g，磷酸二氢钾2.0g，六水合硫酸镁0.5g，氯化钙0.005g，氯化铵0.5g，溶于1000mL水中，调节pH到7.0，121℃灭菌30min备用；其中，所述的半固体脱氮硫杆菌培养基为脱氮硫杆菌种子液体培养基中加1％的琼脂；
其中，所述的发酵培养基：五水合硫代硫酸钠4g/L，硝酸钾1g/L，氯化铵0.8g/L，磷酸氢二钾3g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.3g/L，碳酸氢钠4g/L，碳酸钙20g/L，微量元素20ml/L，pH到7.0，121℃灭菌30min；
其中，所述的微量元素组成为：EDTA二钠0.14g，硫酸亚铁0.5g，浓硫酸0.05ml，硫酸锌10mg，氯化锰3mg，硼酸30mg，氯化钴20mg，氯化铜1mg，氯化镍2mg，钼酸钠3mg，蒸馏水1000毫升，PH3-4，121℃灭菌15分钟；
步骤(2)、复合芽孢杆菌菌粉的制备
解淀粉芽孢杆菌菌种的制备
取出菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，37℃培养48小时；在平板下挑取单个菌落接种50毫升LB培养基中，在培养箱中37℃震荡培养24小时；种子采用5％的接种量，接种至5L大三角瓶中，装液量为2L，LB培养基，37℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过40亿cfu/ml，即可作为解淀粉芽孢杆菌液体菌种；
地衣芽孢杆菌菌种的制备
取出菌种保藏管，用营养肉汁固体培养基划平板进行复苏，37℃培养48小时；在平板下挑取单个菌落接种50毫升营养肉汁培养基中，在培养箱中37℃震荡培养24小时；种子采用5％的接种量，接种至5L大三角瓶中，装液量为2L，营养肉汁培养基，37℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过20亿cfu/ml，即可作为地衣芽孢杆菌液体菌种；
混合固体发酵
将上述制备的解淀粉芽孢杆菌液体菌种与地衣芽孢杆菌液体菌种以1：1的比例混合均匀后，以2％的接种量接种至灭菌的芽孢杆菌固体发酵培养基上，菌种与固体培养基混合均匀后，将接好种的固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为15-25cm，前8小时控温37-40℃，8-20小时控温39-42℃，16小时后控温37-39℃，湿度保持为50％-75％，发酵24-32小时，检测其总芽孢含量不低于100亿/g，解淀粉芽孢杆菌含量不低于50亿/g，地衣芽孢杆菌含量不低于40亿/g，烘干或晒干，即得到复合芽孢杆菌菌粉；
其中，所述营养肉汁培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2％；
其中，所述LB液体发酵培养基：蛋白胨10，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L；pH7.2，固体培养基中加入琼脂2％；
芽孢杆菌固体发酵培养基：麸皮800kg，稻糠100kg，玉米粉50kg，豆粕粉50kg，硫酸镁0.5kg，硫酸铵1.0kg，硫酸锰0.5kg，料水比1：1；
各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
步骤(3)、复合酵母菌粉的制备
采用酿酒酵母与产朊假丝酵母菌按以下步骤进行培养：
A、酿酒酵母种子液的制备：取出酿酒酵母菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养48小时；在平板下挑取单个菌落接种200毫升PDA培养基中，在培养箱中30℃震荡培养24小时；种子采用10％的接种量，接种至2LPDA液体培养基中，30℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过10亿cfu/ml，即可作为酿酒酵母菌种子液体；
B、产朊假丝酵母菌种子液的制备：取出产朊假丝酵母菌菌种保藏管，用产朊假丝酵母固体培养基划平板进行复苏，30℃培养48小时；在平板下挑取单个菌落接种200毫升产朊假丝酵母培养基中，在培养箱中30℃震荡培养24小时，种子采用5％的接种量，接种至3L的产朊假丝酵母培养基，30℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过6亿cfu/ml，即可作为产朊假丝酵母菌种子液；
C、混合发酵培养：将上述制备的酿酒酵母菌种子液体与产朊假丝酵母菌种子液按1：1的比例混合均匀后作为混合酵母种子，以5％的接种量接种至600L的酵母菌发酵培养基中，开搅拌120r/min，通气量350L/min，30℃培养20-28小时，待酵母菌总含量不低于30亿cfu/ml，产朊假丝酵母菌含量不低于10亿cfu/ml，即可结束发酵，板框过滤除水，剩下菌体加轻质碳酸钙，调节菌浓为20亿cfu/g，干燥即得到复合酵母菌粉；
其中，所述的PDA培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，固体培养基中加入琼脂2％；
其中，所述的产朊假丝酵母培养基：蔗糖12g，磷酸氢二钾0.5g，碳酸钙5g，七水硫酸镁0.5g，氯化铁0.005g，酵母膏0.4g，水1000mlpH7.0-7.2，固体培养基中加琼脂20g；
其中，所述的酵母菌发酵培养基：糖蜜120g/L，玉米粉10g/L，玉米浆10g/L，酵母膏0.3g/L，蛋白胨0.5g/L，氯化铵0.5g/L，硫酸镁0.1g/L；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
步骤(4)、混合粉碎
按脱氮硫杆菌菌粉40-60份，复合芽孢杆菌菌粉10-40份，复合酵母菌粉10-40份的重量比，混合均匀，粉碎过100目筛，即得到复合微生物制剂。
2.如权利要求1所述的一种治理黑臭河流的复合微生物制剂，其特征在于所述的治理黑臭河流施用方法为：向黑臭河流均匀洒复合微生物制剂的量为5-20克/平方米。
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