CN105936931A - 一种荧光定量pcr检测养禽场肠杆菌科耐药基因的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种荧光定量pcr检测养禽场肠杆菌科耐药基因的试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种荧光定量PCR检测养禽场肠杆菌科耐药基因的试剂盒及其检测方法，包括荧光定量PCRMIX试剂、16sRNA通用引物和耐药基因blaTEM引物；所述的16sRNA通用引物包括16sRNA通用引物1：5'‑CGTATCGGTCGCATTGTT‑3'，16sRNA通用引物2：5'‑CTTCGTCCCATTTCAGGTT‑3'；所述的耐药基因blaTEM引物包括耐药基因blaTEM引物1：5'‑CGGTATTATCCCGTGTTG‑3'；耐药基因blaTEM引物2：5'‑GTCGTTTGGTATGGCTTC‑3'。本发明提供的试剂盒材料完整、操作简单，具有快速、较高的灵敏度、良好的特异性，对获取养殖场环境中耐药基因信息具有广泛的适用性。

Description

一种荧光定量PCR检测养禽场肠杆菌科耐药基因的试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及细菌耐药基因检测技术领域，具体为一种荧光定量PCR检测养禽场肠杆菌科耐药基因的试剂盒及其检测方法。
背景技术
当前，畜牧业生产中抗生素的使用存在诸多不规范的情况，临床和畜禽养殖业抗生素的不合理使用导致微生物在选择性压力作用下获得并维持耐药性，且有可能通过质粒和整合子将耐药基因在相同或不同种属中广泛传播转移，最终导致多重耐药。耐药基因在养禽场中从发病动物体内的耐药菌株传递给环境中的非致病菌，非致病菌在养殖场中不能被完全消灭，致使耐药基因在舍内长期存在，不断地传递给可能出现的致病菌，从而使得养殖场细菌病治疗难度加大。目前，在研究和生产领域，耐药基因检测多为致病菌耐药基因、对单种细菌耐药基因的检测，且多采用普通PCR技术，在灵敏度、快速性和广泛性等方面存在不足。
实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量、通过内参或外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。具有快速高效、灵敏度高、特异性强等特点。经过对现有技术的文献检索，未发现有利用实时荧光定量PCR检测养禽场环境中肠杆菌科耐药基因的方法，因此开发荧光实时定量PCR检测养禽场环境中肠杆菌科耐药基因的试剂盒十分必要。
发明内容
本发明提供了一种荧光定量PCR检测养禽场肠杆菌科耐药基因的试剂盒及其检测方法，解决了目前没有利用实时荧光定量PCR检测养禽场环境中肠杆菌科耐药基因的方法的问题。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种荧光定量PCR检测养禽场肠杆菌科耐药基因的试剂盒，包括荧光定量PCR MIX试剂、16sRNA通用引物和耐药基因blaTEM引物；
所述的16sRNA通用引物包括
16sRNA通用引物1：5'-CGTATCGGTCGCATTGTT-3'(SEQ ID NO:1)，
16sRNA通用引物2：5'-CTTCGTCCCATTTCAGGTT-3'(SEQ ID NO:2)；
所述的耐药基因blaTEM引物包括
耐药基因blaTEM引物1：5'-CGGTATTATCCCGTGTTG-3'(SEQ ID NO:3)；
耐药基因blaTEM引物2：5'-GTCGTTTGGTATGGCTTC-3'(SEQ ID NO:4)。
进一步，本发明的一种优选方案为：所述的16sRNA通用引物的浓度为0.1～0.5μmol/L；耐药基因blaTEM引物的浓度为0.1～0.5μmol/L。
进一步，本发明的一种优选方案为：所述的荧光定量PCR MIX试剂组成成分及含量分别为浓度为5U/μL的Taq聚合酶；浓度均为200μmol/L的dNTP、浓度为25μmol/L的Mg2+。
本发明的所述的一种荧光定量PCR检测养禽场肠杆菌科耐药基因的试剂盒的用途：用于对β-内酰胺类药物耐药性进行定量检测。
进一步，本发明的一种优选方案为：所述的β-内酰胺类药物为头孢菌素。
本发明也提供了一种养禽场耐药基因的检测方法，利用本发明的所述的试剂盒，包括以下步骤：
(1)采集环境细菌检测样品。
(2)提取环境中细菌基因组RNA；
(3)将步骤(2)所得的基因组RNA反转录为cDNA；
(4)将步骤(3)得到的cDNA加入到荧光定量PCR检测养禽场耐药基因的检测试剂盒，混匀，进行PCR扩增；
(5)PCR扩增结束后，根据荧光实时定量PCR仪对结果进行分析，根据耐药基因blaTEM和16sRNA基因的Ct值，通过相对Ct法计算耐药基因mRNA的相对表达量，即为耐药基因表达的信息。
进一步，本发明的一种优选方案为：所述的PCR扩增的条件为PCR扩增时预孵育95℃，时间5min；变性温度为95℃，反应时间为10s；扩增温度72℃，时间30s；循环数为45。
本发明的有益效果：
本发明提供的试剂盒材料完整、操作简单，具有快速、较高的灵敏度、良好的特异性，对获取养殖场环境中耐药基因信息具有广泛的适用性。
本发明提供的试试剂盒可以对养殖场环境细菌相关耐药基因进行定量，从而为养殖场常见细菌病的药物治疗和兽药厂药物生产提供指导。
本发明提供的检测方法反应条件温和，扩增快速高效，1h左右即可完成，不需要电泳，与普通PCR相比更快速、灵敏，而且没有污染。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为耐药基因blaTEM基因熔解曲线；
图2为不同菌株大肠杆菌blaTEM基因检测结果；
图3为不同菌株大肠杆菌16s RNA基因检测结果；
图4为肠道杆菌科不同细菌blaTEM基因检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种荧光定量PCR检测养禽场肠杆菌科耐药基因的试剂盒，包括荧光定量PCR MIX试剂、16sRNA通用引物和耐药基因blaTEM引物；
所述的荧光定量PCR MIX试剂组成成分及含量分别为浓度为5U/μL的Taq聚合酶；浓度均为200μmol/L的dNTP、浓度为25μmol/L的Mg2+。
所述的16sRNA通用引物包括
16sRNA通用引物1：5'-CGTATCGGTCGCATTGTT-3'(SEQ ID NO:1)，
16sRNA通用引物2：5'-CTTCGTCCCATTTCAGGTT-3'(SEQ ID NO:2)；
所述的耐药基因blaTEM引物包括
耐药基因blaTEM引物1：5'-CGGTATTATCCCGTGTTG-3'(SEQ ID NO:3)；
耐药基因blaTEM引物2：5'-GTCGTTTGGTATGGCTTC-3'(SEQ ID NO:4)。
16sRNA通用引物的浓度为0.5μmol/L；耐药基因blaTEM引物的浓度为0.5μmol/L，所述的荧光定量PCR MIX试剂采用上述试剂。荧光定量PCR MIX试剂也可以采用市场上的其它试剂。
实施例2
与实施例1基本相同，不同之处在于：16sRNA通用引物的浓度为0.1μmol/L；耐药基因blaTEM引物的浓度为0.3μmol/L。
实施例3
与实施例1基本相同，不同之处在于：16sRNA通用引物的浓度为0.2μmol/L；耐药基因blaTEM引物的浓度为0.1μmol/L。
实施例4
一种养禽场耐药基因的检测方法，包括以下步骤：
(1)采集环境细菌检测样品：地面采样，采样点采用梅花式(7点法)分布，用5cm×5cm无菌规格板，放在地面，采样面积100cm2，用中和剂浸润后的灭菌棉拭子一个，在规格板内横竖往返均匀涂擦各5次，并随之转棉拭子，剪去手接触部位后，将棉拭子头部放入10ml含相应中和剂的无菌洗脱无菌洗脱液试管中，回化验室检测。
(2)提取环境中细菌基因组RNA：利用TRI pure LS Reagent试剂盒提取样品基因组RNA；
3)按常规方法用反转录试剂盒Reverse Transcription System将提取的样品基因组RNA反转录为cDNA；
4)用上述荧光定量PCR MIX试剂进行Real-time PCR，仪器为480Real-Time PCR System，反应体系为：荧光定量PCR MIX试剂10μL、Primer-1 0.5μL、Primer-2 0.5μL、cDNA 1μL、无菌水补至20μL，其中16sRNA通用引物、blaTEM引物的浓度均为0.5μmol/L；
反应条件：PCR扩增时预孵育95℃，时间5min；变性温度为95℃，反应时间为10s；扩增温度72℃，时间30s；循环数为45。反应结束后作熔解曲线分析。
5)定量PCR反应结束后，根据Real-time PCR专用仪为480Ⅱ上装有软件对结果进行分析。根据耐药基因blaTEM基因和16sRNA通用的Ct值，通过相对Ct法即2–ΔΔCt法，来计算blaTEM基因mRNA的相对表达量。
6)实验结果如表1和图1所示。
表1 某养鸡场地面样品中blaTEM基因检测情况
样品号 空舍期 养殖期1 养殖期2 养殖期3 养殖期4
blaTEM相对表达量 5.1 7.3 26.1 28.4 35.0
如表1所示，对某养鸡场空舍期和养殖期地面样品检测结果表明，养殖期blaTEM基因的表达水平明显上调，养殖期4为空舍期的6.9倍，与空舍期差异显著，通过这一检测数据，可以辅助评价养禽场环境耐药基因存在及消长情况。
由图1可知blaTEM基因引物熔解曲线显示，引物特异性良好。
实施例5
利用本发明的引物对不同菌株大肠杆菌blaTEM基因检测，菌株具体为：blaTEM基因阴性标准菌株、blaTEM基因阳性标准菌株和药敏试验结果阳性的分离菌株和药敏试验阴性的分离菌株(其中1.blaTEM基因阴性标准菌株，2.blaTEM基因阳性标准菌株，3-7.药敏试验阳性的分离菌株，8-10.药敏试验阴性的分离菌株)进行PCR扩增，具体结果见图2。由图2可知耐药基因blaTEM基因阴性标准菌株和药敏试验结果阳性的分离菌株均出现特异性条带，而blaTEM基因阴性标准菌株和药敏试验阴性的分离菌株均未出现特异性条带，
利用本发明的引物对不同菌株大肠杆菌16s RNA基因检测结果，菌株具体为：blaTEM基因阴性标准菌株、blaTEM基因阳性标准菌株和药敏试验结果阳性的分离菌株和药敏试验阴性的分离菌株(其中1.blaTEM基因阴性标准菌株，2.blaTEM基因阳性标准菌株，3-7.药敏试验阳性的分离菌株，8-10.药敏试验阴性的分离菌株)进行PCR扩增，具体结果见图3。由图3可知不同菌株大肠杆菌16s RNA基因检测结果：10株大肠杆菌均检出16s RNA基因。
利用本发明的引物对肠道杆菌科不同细菌blaTEM基因检测结果，7种细菌分别为：1.大肠杆菌 2.芽孢杆菌 3.葡萄球菌 4.克雷伯氏菌 5.变形杆菌 6.不动杆菌 7.阴沟肠杆菌，具体结果见图4。由图4可知大肠杆菌、变形杆菌、克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌检测到blaTEM基因，芽孢杆菌、葡萄球菌和不动杆菌未检出该基因。由图1-4可知，本发明的引物具有良好的特异性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种荧光定量PCR检测养禽场肠杆菌科耐药基因的试剂盒，其特征在于，包括荧光定量PCRMIX试剂、16sRNA通用引物和耐药基因blaTEM引物；
所述的16sRNA通用引物包括
16sRNA通用引物1：5'-CGTATCGGTCGCATTGTT-3'，
16sRNA通用引物2：5'-CTTCGTCCCATTTCAGGTT-3'；
所述的耐药基因blaTEM引物包括
耐药基因blaTEM引物1：5'-CGGTATTATCCCGTGTTG-3'；
耐药基因blaTEM引物2：5'-GTCGTTTGGTATGGCTTC-3'。
2.根据权利要求1所述的一种荧光定量PCR检测养禽场肠杆菌科耐药基因的试剂盒，其特征在于：所述的16sRNA通用引物的浓度为0.1～0.5μmol/L；耐药基因blaTEM引物的浓度为0.1～0.5μmol/L。
3.根据权利要求1所述的一种荧光定量PCR检测养禽场肠杆菌科耐药基因的试剂盒，其特征在于：所述的荧光定量PCR MIX试剂组成成分及含量分别为浓度为5U/μL的Taq聚合酶；浓度均为200μmol/L的dNTP、浓度为25μmol/L的Mg2+。
4.一种权利要求1-3任一项所述的一种荧光定量PCR检测养禽场肠杆菌科耐药基因的试剂盒的用途：其特征在于：用于对β-内酰胺类药物耐药性进行定量检测。
5.根据权利要求4所述的一种荧光定量PCR检测养禽场肠杆菌科耐药基因的试剂盒的用途，其特征在于：所述的β-内酰胺类药物为头孢菌素。
6.一种养禽场肠杆菌科耐药基因的检测方法，其特征在于，利用权利要求1-3任一项所述的试剂盒，包括以下步骤：
(1)采集环境细菌检测样品。
(2)提取环境中细菌基因组RNA；
(3)将步骤(2)所得的基因组RNA反转录为cDNA；
(4)将步骤(3)得到的cDNA加入到荧光定量PCR检测养禽场耐药基因的检测试剂盒，混匀，进行PCR扩增；
(5)PCR扩增结束后，根据荧光实时定量PCR仪对结果进行分析，根据耐药基因blaTEM和16sRNA基因的Ct值，通过相对Ct法计算耐药基因mRNA的相对表达量，即为耐药基因表达的信息。
7.根据权利要求5所述的一种养禽场肠杆菌科耐药基因的检测方法，其特征在于：所述的PCR扩增的条件为PCR扩增时预孵育95℃，时间5min；变性温度为95℃，反应时间为10s；扩增温度72℃，时间30s；循环数为45。
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