CN110029159A - 一种用于ApoE基因分型检测的核苷酸序列组及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种核苷酸序列组，包括正向引物和反向引物，用于扩增含有基因多态性位点的ApoE基因的一部分；正向引物的3’末端对应ApoE基因的多态性位点；反向引物的3’末端对应ApoE基因的另一个多态性位点。采用本发明的核苷酸序列组，配合荧光定量PCR检测方法，可有效增大不同的ApoE基因型的区分度。

Description

一种用于ApoE基因分型检测的核苷酸序列组及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种用于ApoE基因分型检测的核苷酸序列组及其应用。
背景技术
载脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)在加工后成为含有299个氨基酸残基的蛋白质，分子量34.2kDa。是一种主要的胆固醇载体，具有脂蛋白转运、代谢、修复脑损伤等功能。
ApoE基因位于19号染色体长臂上，全长约3.7kb，有4个外显子，第4外显子表现出基因多态性，使ApoE基因具有E2、E3、E4三种等位基因，其E2(rs429358 为T，rs7412为T)、E3(rs429358为T，rs7412为C)、E4(rs429358为C，rs7412为 C)三种基因可组合产生6种基因型：三种纯合子(E2/2、E3/3、E4/4)和三种杂合子 (E2/3、E2/4、E3/4)。ApoE基因具有异构体特异性，导致其编码的蛋白质功能具有差异性，从而导致不同蛋白质对脂质的代谢能力、抗氧化能力及抗炎症能力不同。 ApoE的氨基酸序列的第112位和158位两种氨基酸残基，即精氨酸(Arg)和半胱氨酸(Cys)的变异决定了其基因型别。ApoE4在这两个位置上都是Arg；ApoE2都是 Cys；112位为Cys和158位是Arg者为ApoE3。自然人群中，基因频率E3分布最广，约占70％。
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种起病隐匿的进行性发展致死性神经系统退行性疾病。研究表明，ApoE4基因的携带者患阿尔茨海默的几率明显增加，而ApoE2基因的携带者具有一定的抵抗作用。通过检测ApoE的基因型，可了解是否为阿尔茨海默易感人群，以便早诊断、早治疗、以降低疾病造成的损害。因此，对ApoE基因型别的检测可以帮助患者疾病的早期诊断和指导个体化用药，提高患者的预后水平。
冠心病(Coronary Atherosclerotic Heart D isease，CHD)是全球范围内最常见的死亡原因之一，其中，LDL-C水平升高是导致CHD的最重要的病因。现有的治疗药物当中，他汀类药物应用广泛。而他汀类药物会因为ApoE基因型差异而表现出差异性的药动学反应，如ApoE2的作用是降低胆固醇浓度，对冠状动脉硬化的发展有一定的防护作用，而ApoE4则会使血浆LDL-C、TC浓度升高，易诱发CHD。
现有的基因分型的检测方法中，直接测序法虽然灵敏度高，但是价格昂贵，工序繁琐，难以满足临床检测要求。荧光定量PCR检测有着灵敏度高，操作方便快捷等优点，适宜在临床上进行推广。
本发明提供一种基于荧光定量探针检测的一组引物和阻断核酸序列，以提高临床检测的便捷程度。
发明内容
鉴于现有的基因分型检测中测序等方法的成本过高，操作繁琐并不适宜于医院开展大规模的临床检测，本发明所需解决的问题是提供一种高效低成本的ApoE基因分型检测方法，以提高医院相关检测的效率。
为实现上述目的，本发明的一个方面提供了一种核苷酸序列组。在一个具体实施方式中，该核苷酸序列组包括正向引物和反向引物，用于扩增含有目标多态性位点的靶标ApoE基因的一部分；正向引物的3’末端对应靶标ApoE基因的第一多态性位点；反向引物的3’末端对应靶标ApoE基因的第二多态性位点。
可选地，正向引物上包括第一多态性位点，该第一多态性位点使得正向引物与非靶标ApoE基因型的反义链不能完全互补；反向引物上包括第二多态性位点，该第二多态性位点使得反向引物与非靶标ApoE基因型的正义链不能完全互补。
可选地，第一多态性位点位于对应于正向引物的该核苷酸序列的3’端；第二多态性位点对应于反向引物的3’端。
在另一个具体实施方式中，该核苷酸序列组还包括正向引物的第一阻断核苷酸序列和反向引物的第二阻断核苷酸序列，第一阻断核苷酸序列能与非靶标ApoE基因型的反义链互补；第二阻断核苷酸序列能与非靶标ApoE基因型的正义链互补。
可选地，第一阻断核苷酸序列和/或第二阻断核苷酸序列的3’端添加有2-5个相对于ApoE基因的非互补碱基，或者添加有使第一阻断核苷酸序列和/或第二阻断核苷酸序列本身不能延伸的3’端化学修饰。
进一步可选地，3’端化学修饰为3'ddC、3'反向dT(3'Inverted dT)、3'C3间隔子(3'C3spacer)、3'氨基(3'Amino)或3'磷酸化(3'phosphorylation)。
可选地，正向引物和反向引物扩增的片段为包括第一多态性位点和所述第二多态性位点的120-200bp长度的序列。
可选地，正向引物和反向引物的序列长度为15-35bp，退火温度为55-65℃。
可选地，核苷酸序列组还包括探针，探针带有荧光基团和淬灭基团。可选地，荧光基团选自FAM、HEX、CY5、VIC、TET、JOE和ROX中的一种；淬灭基团选自BHQ-1、BHQ-2、TAMRA和MGB中的一种。可选地，第一多态性位点和第二多态性位点分别为ApoE基因所在染色体序列的第44908684位和第44908822 位。在一个具体实施方式中，该核苷酸序列组包括正向引物和反向引物，用于扩增含有目标多态性位点的靶标ApoE基因的一部分；正向引物的序列选自如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的序列中的一个或多个；反向引物的序列选自如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的序列中的一个或多个。
可选地，该核苷酸序列组还包括正向引物的第一阻断核苷酸序列和反向引物的第二阻断核苷酸序列；第一阻断核苷酸序列选自如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8 所示的序列中的一个或两个；第二阻断核苷酸序列选自如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的序列中的一个或两个。
可选地，该核苷酸序列组还包括探针，所述探针的序列如SEQ ID NO:11所示。
本发明的第二个方面提供了一种试剂盒。在一个具体实施方式中，该试剂盒包括如上所述的核苷酸序列组。
可选地，每一个正向引物的浓度均为300±200nM，每一个反向引物的浓度均为300±200nM，每一个阻断核苷酸序列的浓度均为0-4μM，探针的浓度为 300±200nM。
可选地，该试剂盒中还包括DNA聚合酶、镁离子、dNTP和缓冲液。
本发明的第三个方面还提供了一种检测基因多态性的方法，其特征在于，使用如上所述的核苷酸序列组进行PCR扩增。
可选地，上述方法适用于检测含有不同ApoE基因型的血液基因组DNA。
可选地，采用荧光定量PCR进行检测。
可选地，荧光信号通过荧光染料或荧光探针获得。
采用本发明的核苷酸序列组，配合荧光定量PCR探针法的检测，可以有效鉴别ApoE多态性的不同基因型，区分度在14个循环以上，可以用于血液中DNA为样本的检测，从而有助于临床上对患者的基因型进行判断。
并且，当配合采用荧光定量PCR探针的检测方法时，实验操作简便，数据分析及结果判读直观，检测成本较低，能够在2小时内出具检测结果，能够最大限度满足临床需求。通过荧光探针对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程。通过软件对荧光积累信息进行分析和计算，能获得待测样品模板的初始浓度。
以下将结合附图对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例的原理示意图。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook 等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所采用的试剂，若无特殊说明，均为市售或公开渠道可以获得的试剂。
本发明中所述的ApoE基因的序列位于19号染色体上44908684-44908822位。本文中ApoE基因型的多态性位点其SNP号分别为rs429358和rs7412，其中ApoE2 的对应序列如SEQ ID NO:12所示，ApoE3的对应序列如SEQ ID NO:13所示， ApoE4的对应序列如SEQ IDNO:14所示。
在第一个具体实施方式中，根据ApoE基因的多态性点，设计能扩增包含多态性位点在内的120-200bp长度的基因序列的核苷酸序列组。该核苷酸序列组包括正向引物和反向引物。
在一个可选的实施方式中，正向引物的3’末端对应靶标ApoE基因的一种多态性位点，使得正向引物与非靶标ApoE基因的反义链不能完全互补，以增加不同基因型的区分度。
在一个可选的实施方式中，反向引物的3’末端对应靶标ApoE基因的另一种多态性位点，使得反向引物与非靶标ApoE基因的正义链不能完全互补，以增加不同基因型的区分度。
在一个可选的实施方式中，该核苷酸序列组还包括探针，探针带有荧光基团和淬灭基团，用于在检测时提供荧光信号。
在第二个具体实施方式中，根据ApoE的多态性位点，设计扩增包括多态性位点在内的120-200bp长度的基因序列的核苷酸序列组。该核苷酸序列组包括正向引物、反向引物、第一阻断核苷酸序列和第二阻断核苷酸序列。
正向引物和反向引物的设计原则和第一个具体实施方式中相同。
正向引物的第一阻断核苷酸序列与非靶标ApoE基因型的碱基序列的反义链完全互补；反向引物的第二阻断核苷酸序列与非靶标ApoE基因型的碱基序列的正义链完全互补。第一阻断核苷酸序列和/或第二阻断核苷酸序列的3’端添加有2-5 个相对于ApoE基因的非互补碱基，或者添加有使第一阻断核苷酸序列和/或第二阻断核苷酸序列本身不能延伸的3’端化学修饰，通过非互补碱基或者化学修饰，实现抑制野生型基因扩增的目的。
可选地，3’端化学修饰为3’ddC、3'Inverted dT、3'C3spacer、3'Amino或3'phosphorylation。
利用上述核苷酸序列组检测ApoE基因多态性为点的原理如图1所示，第一阻断核苷酸序列和第二阻断核苷酸序列与非靶标ApoE基因型结合，使得正向引物或者反向引物不能与非靶标ApoE基因型的序列结合并延伸，从而使非靶标ApoE基因型的序列不能扩增。阻断核苷酸序列不能与靶标ApoE基因型结合，而正向引物和反向引物与靶标基因型序列结合，从而扩增出目的片段。
在一个可选的实施方式中，该核苷酸序列组还包括探针，探针带有荧光基团和淬灭基团，用于在检测时提供荧光信号。
在第三个具体实施方式中，根据如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的ApoE基因型第rs429358和rs7412的SNP位点设计核苷酸序列组。上述序列为多态性所在位置附近的ApoE基因序列。该核苷酸序列组用于检测SNP 位点rs429358和rs7412的一个或者两个。
该核苷酸序列组包括正向引物和反向引物，正向引物选自如SEQ ID NO:1、 SEQID NO:2和SEQ ID NO:3所示的序列中的一个或多个。反向引物选自如SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示的序列中的一个或多个。
在一个可选的实施方式中，该核苷酸序列组还包括探针，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
在第四个具体实施方式中，根据如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的ApoE基因型第rs429358和rs7412的SNP位点设计核苷酸序列组。上述序列为多态性所在位置附近的ApoE基因序列。该核苷酸序列组用于检测SNP 位点rs429358和rs7412的一个或者两个。
该核苷酸序列组包括正向引物、反向引物、第一阻断核苷酸序列和第二阻断核苷酸序列。正向引物选自如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的序列中的一个或多个。反向引物选自如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO: 6所示的序列中的一个或多个。第一阻断核苷酸序列选自如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的序列中的一个或两个；第二阻断核苷酸序列选自如SEQ ID NO:9 和SEQ ID NO:10所示的序列中的一个或两个。
在一个可选的实施方式中，该核苷酸序列组还包括探针，探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:11。
实施例1基因分型实验
本实施例使用的核苷酸序列组包括正向引物、反向引物和探针序列(序列由上海生工生物工程有限公司合成)，具体如表1所示：
表1核苷酸序列组
探针的荧光基团为FAM、HEX、CY5、VIC、TET、JOE或者ROX；淬灭基团为BHQ-1、BHQ-2、TAMRA或者MGB。通过探针法获得荧光信号。
1、多态性DNA质粒
将SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列构建到pUC57质粒(购自上海生工生物工程有限公司)上，形成ApoE2型质粒，采用Nanodrop分光光度计定量浓度。
将SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列构建到pUC57质粒上，形成ApoE3型质粒，采用Nanodrop分光光度计定量浓度。
将SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列构建到pUC57质粒上，形成ApoE4型质粒，采用Nanodrop分光光度计定量浓度。
2、多态性DNA检测模板处理
设置不同的多态性位点DNA组合(E2/2、E3/3、E4/4、E2/3、E2/4、E3/4)，每一组DNA检测模板中DNA拷贝数为5000copies/μl。
其中，E2/3由ApoE2型质粒(30ng/ul)和ApoE3型质粒(30ng/ul)各取0.5ul 混合形成，E2/4和E3/4类似方式形成。
3、荧光定量PCR检测
使用如表1所示的引物，以及如上检测模板DNA，按照如下所示的PCR扩增体系配置PCR反应液。每个检测孔设置三个重复。其中，定量PCR试剂购自赛默飞(TaqPathTMProAmpTMMaster Mix)、KapaBiosystems(KK4701)或 Toyobo(QPS-101)。
PCR的扩增反应体系如下：
使用配置的反应体系进行荧光定量PCR检测(定量PCR仪为Bio-rad CFX96)， PCR扩增的反应条件为：
其中，针对ApoE基因的多态性位点，使用ApoE2引物组(SEQ ID NO：1、 SEQ ID NO：4)、ApoE3引物组(SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5)和ApoE4引物组(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6)，使用SEQ ID NO：11所示的探针进行荧光定量PCR检测，检测结果如表2所示：
表2荧光定量PCR检测结果
根据表2中的结果，表明采用如表1中的核苷酸序列组合，ApoE基因型的区分度在9个循环以上。
实施例2基因分型实验
本实施例使用的核苷酸序列组包括正向引物、反向引物、阻断核苷酸和探针序列(序列由上海生工生物工程有限公司合成)，具体如表1所示：
表3核苷酸序列组
探针的荧光基团为FAM、HEX、CY5、VIC、TET、JOE或者ROX；淬灭基团为BHQ-1、BHQ-2、TAMRA或者MGB。通过探针法获得荧光信号。
1、多态性DNA质粒
将SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列构建到pU57质粒上，形成ApoE2型质粒，采用Nanodrop分光光度计定量浓度。
将SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列构建到pU57质粒上，形成ApoE3型质粒，采用Nanodrop分光光度计定量浓度。
将SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列构建到pU57质粒上，形成ApoE4型质粒，采用Nanodrop分光光度计定量浓度。
2、多态性DNA检测模板处理
设置不同的多态性位点DNA组合(E2/2、E3/3、E4/4、E2/3、E2/4、E3/4)，每一组DNA检测模板中欧DNA拷贝数为5000copies/μl。
其中，E2/3由ApoE2型质粒(30ng/ul)和ApoE3型质粒(30ng/ul)各取0.5ul 混合形成，E2/4和E3/4类似方式形成。
3、荧光定量PCR检测
使用如表3所示的引物，以及如上检测模板DNA，按照如下所示的PCR扩增体系配置PCR反应液。每个检测孔设置三个重复。其中，定量PCR试剂购自赛默飞(TaqPathTMProAmpTMMaster Mix)、KapaBiosystems(KK4701)或 Toyobo(QPS-101)。
PCR的扩增反应体系如下：
使用配置的反应体系进行荧光定量PCR检测(定量PCR仪为Bio-rad CFX96)， PCR扩增的反应条件为：
其中，针对ApoE基因的多态性位点，使用ApoE2引物组(SEQ ID NO：1、 SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10)、ApoE3引物组(SEQ ID NO： 2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9)和ApoE4引物组(SEQ ID NO： 3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9)，使用SEQ ID NO：11所示的探针进行荧光定量PCR检测，检测结果如表4所示：
表4荧光定量PCR检测结果
根据表4中的结果，表明采用如表3中的核苷酸序列组合，ApoE基因型的区分度在14个循环以上，同时使得NC基本没有扩增。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 成都华青精准医疗科技有限公司
<120> 一种用于ApoE分型检测的核苷酸序列组及其应用
<160> 14
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<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggctgtccaa ggagctgcag gcggcgcagg cccggctggg cgcggacatg gaggacgtgc 60
gcggccgcct ggtgcagtac cgcggcgagg tgcaggccat gctcggccag agcaccgagg 120
agctgcgggt gcgcctcgcc tcccacctgc gcaagctgcg taagcggctc ctccgcgatg 180
ccgatgacct gcagaagcgc ctggcagtgt accaggccgg ggcccgcgag ggcgccgagc 240
gcggcctcag 250

Claims (10)

1.一种核苷酸序列组，其特征在于，所述核苷酸序列组包括正向引物和反向引物，用于扩增含有目标多态性位点的靶标ApoE基因的一部分；所述正向引物的3’末端对应靶标ApoE基因的第一多态性位点；反向引物的3’末端对应靶标ApoE基因的第二多态性位点。
2.如权利要求1所述的核苷酸序列组，其特征在于，所述正向引物上包括第一多态性位点，所述第一多态性位点使得正向引物与非靶标ApoE基因型的反义链不能完全互补。
3.如权利要求2所述的核苷酸序列组，其特征在于，所述反向引物上包括第二多态性位点，所述第二多态性位点使得反向引物与非靶标ApoE基因型的正义链不能完全互补。
4.如权利要求3所述的核苷酸序列组，其特征在于，所述第一多态性位点对应于正向引物的3’端；所述第二多态性位点对应于反向引物的3’端。
5.如权利要求4所述的核苷酸序列组，其特征在于，所述核苷酸序列组还包括正向引物的第一阻断核苷酸序列，所述第一阻断核苷酸序列能与非靶标ApoE基因型的反义链互补。
6.如权利要求5所述的核苷酸序列组，其特征在于，所述核苷酸序列组还包括反向引物的第二阻断核苷酸序列，所述第二阻断核苷酸序列能与非靶标ApoE基因型的正义链互补。
7.如权利要求6所述的核苷酸序列组，其特征在于，所述第一阻断核苷酸序列和/或所述第二阻断核苷酸序列的3’端添加有2-5个相对于ApoE基因的非互补碱基，或者添加有使所述第一阻断核苷酸序列和/或所述第二阻断核苷酸序列本身不能延伸的3’端化学修饰。
8.一种核苷酸序列组，其特征在于，所述核苷酸序列组包括正向引物和反向引物，用于扩增含有目标多态性位点的靶标ApoE基因的一部分；所述正向引物的序列选自如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的序列中的一个或多个；所述反向引物的序列选自如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的序列中的一个或多个。
9.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-8中任一项所述的核苷酸序列组。
10.一种检测基因多态性的方法，其特征在于，使用如权利要求1-8中任一项所述的核苷酸序列组进行PCR扩增。
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