CN102010897B - KIF6、apo E基因和染色体9p21区段SNP检测液相芯片 - Google Patents
KIF6、apo E基因和染色体9p21区段SNP检测液相芯片 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102010897B CN102010897B CN 201010196784 CN201010196784A CN102010897B CN 102010897 B CN102010897 B CN 102010897B CN 201010196784 CN201010196784 CN 201010196784 CN 201010196784 A CN201010196784 A CN 201010196784A CN 102010897 B CN102010897 B CN 102010897B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- sequence
- gene
- snp
- kif6
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种KIF6基因SNP检测液相芯片，该液相芯片主要包括有：ASPE引物对，每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对T2155C SNP位点的特异性引物组成，所述特异性引物是：SEQID NO.23和SEQ ID NO.24；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.18；分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球；扩增引物。本发明还公开了apo E、KIF6基因和染色体9p21区段SNP检测的液相芯片。本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100％。所制备的apo E、KIF6基因和染色体9p21区段SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种KIF6、apoE基因和染色体9p21区段SNP位点检测液相芯片。
背景技术
KIF6(Kinesin-like protein 6)编码驱动蛋白样蛋白-6，为分子动力超家族中的一员。CARE、WOSCOPS及PROVE IT-TIMI 22三项研究均表明，KIF6基因Trp719Arg(rs20455T＞C)与冠脉事件的相关性。KIF6基因Trp719Arg多态性在高加索人群中达到60％，具有719Arg多态性的人患冠心病(CHD)的风险增加55％。与非携带者相比(HR＝0.94)，KIF6719Arg等位基因携带者应用他汀强化治疗较他汀常规治疗获益更多(HR＝0.59)，强化治疗使携带者发生冠脉事件的绝对危险降低10.0％，非携带者仅降低0.8％。
载脂蛋白E(Apolipoprotein E，apo E)是血浆中重要的载脂蛋白之一。Apo E主要在肝脏合成、分泌和代谢过程中参与脂质的运输、储存及排泄，有修复组织、抑制血小板聚集、免疫调节等作用。人apo E的基因位于第19号染色体长臂13区2带(19q132)上，基因全长为3.7kb，含有4个外显子和3个内含子，其cDNA长为1.163kb。apoE蛋白前体由317个氨基酸组成，含有18个氨基酸信号肽，成熟的Apo E蛋白由299个氨基酸组成。Apo E基因有三个等位基因，即ε2、ε3和ε4，共构成6种不同的基因型：3种纯合型(ε2/ε2、ε3/ε3、ε4/ε4)和三种杂合型(ε3/ε4、ε2/ε3、ε2/ε4)。其基因发生频率因不同的种族和地区存在差异，在一般人群中，ε2约占8％，ε3约占78％，ε4占14％。由于编码apoE肽链上第112位和158位氨基酸相对应核苷酸的多态性差异，三种不同的等位基因转录、翻译成三种不同的蛋白异构体，即apo Eε3肽链的第112和158位上的氨基酸分别为半胱氨酸(Cys)和精氨酸(Arg)，而apoEε2是在第158位上的Arg被Cys取代，apo Eε4则在第112位上的Cys被Arg所取代。研究发现，不同基因型人群的心血管疾病风险依ε2＜ε3＜ε4次序增大，ε2/ε2的携带者倾向于发生III型的高血脂，ε4等位基因与血浆中胆固醇水平的上升以及由此引致的冠心病风险的提高相关，apo E基因型在预测心脏病相关的环境因素、斯他汀治疗、饮食治疗等对患者的治疗效果中起着重要作用。
WTCCC于2007年对1926例患有冠心病/心肌梗塞或有严重家族史者和2938名对照受试者的全基因组关联研究结果显示：与冠心病相关性最大的多态性位点rs1333049(G＞C)位于9p21区域(P＝ 1.80×10-14)。该研究结果于2008年经在东亚人群中得到验证。2009于中国人群中得到证实。PROVEIT-TIMI 22研究同样证实：rs1333049C等位基因携带者应用他汀强化治疗较他汀常规治疗获益更多。同时，与冠心病相关的多态性位点还有A22086055G(rs10757274)、A22114477G(rs10757278)、A22105026G(rs2383206)、A22105959G(rs2383207)和A22088619G(rs2891168)，此5个位点均与rs1333049(G22115503C)完全连锁。
目前国内外关于心血管疾病风险的检测日渐增多，已有检测apo E基因多态性的产品上市，如Celera公司、上海主健生物工程有限公司的检测产品，目前的产品一般基于PCR技术的荧光定量PCR法、RFLP法和DNA测序法等，存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点，同时由于检测通量的局限性，不能满足实际应用的需要。而染色体9p21区段SNP位点，目前国内外几乎没有相关的检测产品。
发明内容
本发明的目的之一是提供KIF6基因SNP检测液相芯片，该液相芯片可用于检测KIF6基因T2155C(rs20455)的野生型和突变型。
实现上述目的的技术方案如下：
一种KIF6基因SNP检测液相芯片，主要包括有：
(A)针对KIF6基因的T2155C SNP位点设计的野生型和突变型的ASPE引物对，每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对T2155C SNP位点的特异性引物组成，所述特异性引物是：SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.18；
(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQID NO.37～SEQ ID NO.54中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；
(C)用于扩增具有T2155C SNP位点的KIF6基因目标序列的扩增引物。
优选地，所述扩增引物为SEQ ID NO.57～SEQ ID NO.58。
更优选地，所述ASPE引物对为：由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.23组成的序列以及由SEQID NO.6和SEQ ID NO.24组成的序列。
本发明的另一目的是提供一种KIF6和apoE基因SNP同步检测液相芯片。
具体技术方案如下：
一种KIF6和apo E基因SNP检测液相芯片，主要包括有：
(A)针对每种基因的SNP位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对，每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物组成，所述特异性引物是：针对KIF6基因T2155CSNP位点的SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24；以及针对apo E基因C609TSNP的SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20、和/或针对apo E基因T471C的SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.18；
(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQID NO.37～SEQ ID NO.54中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；
(C)用于扩增具有KIF6基因T2155C SNP位点、以及apo E基因的C609T和/或T471CSNP的目标序列的扩增引物。
优选地，所述扩增引物为：针对KIF6基因T2155C SNP位点的SEQ ID NO.57～SEQ IDNO.58；以及针对apoE基因的SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56。
进一步地，所述ASPE引物对为：针对KIF6基因T2155C SNP的由SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.23组成的序列以及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.24组成的序列；以及针对apoE基因C609TSNP的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.19组成的序列、由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.2O组成的序列，和/或针对apo E基因T471C的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.21组成的序列、由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.22组成的序列
本发明的另一目的是提供对apo E、KIF6基因和染色体9p21区段SNP同步检测的液相芯片。该液相芯片可用于检测apo E基因两种常见基因型C609T(rs7412)和T471C(rs429358)的野生型和突变型、KIF6基因T2155C(rs20455)的野生型和突变型以及染色体9p21区段的G22115503C(rs1333049)、A22086055G(rs10757274)、A22114477G(rs10757278)、A22105026G(rs2383206)、A22105959G(rs2383207)和A22088619G(rs2891168)突变的野生型和突变型。
实现上述目的的技术方案如下：
一种apo E、KIF6基因和染色体9p21区段SNP检测的液相芯片，主要包括有：
(A)针对每种基因的SNP位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对，每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物组成，所述tag序列选自SEQID NO.1～SEQ ID NO.18；
所述特异性引物是：针对KIF6基因T2155C SNP位点的SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24；
针对apo E基因C609T SNP的SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20、和/或针对apo E基因T471C的SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22；以及
针对染色体9p21区段G22115503C SNP的SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、A22086055G SNP的SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、A22114477G SNP的SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30、A22105026G SNP的SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32、A22105959G SNP的SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34、和/或A22088619G SNP的SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36。
(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自EQID NO.37～SEQ ID NO.54中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；
(C)用于扩增具有KIF6基因T2155C SNP位点、apo E基因的C609T和T471C SNP、以及染色体区段9p21的G22115503C、A22086055G、A22114477G、A22105026G、A22105959G和/或A22088619G的目标序列的扩增引物。
优选地，所述扩增引物为：针对KIF6基因T2155C SNP位点的SEQ ID NO.57～SEQ IDNO.58；以及针对apoE基因的SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56；以及针对染色体区段9p21的SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60、SEQID NO.61和SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63和SEQ IDNO.64、SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67和SE Q ID NO.68、和/或SEQ ID NO.69和SEQ ID NO.70。
进一步地，所述ASPE引物对为：针对KIF6基因T215C SNP的由SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.23组成的序列以及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.24组成的序列；以及针对apo E基因C609TSNP的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.19组成的序列、由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.20组成的序列，和/或针对apo E基因T471C的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.21组成的序列、由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.22组成的序列；以及针对染色体区段9p21的由SEQ ID NO.7和SEQID NO.25组成的序列以及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.26组成的序列、由SEQ IDNO.9和SEQID NO.27组成的序列以及由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.28组成的序列、由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.29组成的序列以及由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.30组成的序列、由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.31组成的序列以及由SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.32组成的序列、由SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.33组成的序列以及由SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.34组成的序列、和/或由SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.35组成的序列以及由SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.36组成的序列。
优选地，上述所有液相芯片中所述间隔臂序列为5-10个T。
本发明的主要优点在于：
1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100％。所制备的apo E、KIF6基因和染色体9p21区段SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个SNP位点的并行检测。
2.本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型别的基因型。
3本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。
4本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
5.本发明的检测方法步骤简单，且九种SNPs检测可通过一步多重PCR即可完成九个含有SNP位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
具体实施方式
实施例1 apo E、KIF6基因和染色体9p21区段SNP检测液相芯片，主要包括有：
一、ASPE引物
针对apo E两种常见SNP位点C609T(ε2，rs7412)和T471C(ε4，rs429358)、KIF6基因的SNP位T2155C(rs20455)，以及染色体9p21区段的SNP位点G22115503C(rs1333049)、A22086055G(rs10757274)、A22114477G(rs10757278)、A22105026G(rs2383206)、A22105959G (rs2383207)和A22088619G(rs2891168)，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示：
表1 ASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)
每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的十八种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示：
表2 生球编号与微球上相应的anti-tag序列
选择的十八种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被于微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-1O个T，微球包被的过程如下：
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pI18.0)]，lmmol/LEDTA中，2-8℃避光保存。
三、扩增出含有突变位点的目标序列的引物
apo E基因的两种常见的SNP突变ε2和ε4，其中，ε2为C609T突变，ε4为T471C突变，均发生在apo E基因Exon 4上；KIF6基因的SNP位点T2155C发生在KIF6基因Exon 19上；而染色体9p21区段的G22115503C突变发生在该区段基因间隔区。利用Primer5.0设计八对引物(见表3)，分别扩增出八条含有SNP位点的目标序列。
表3 扩增出具有SNP位点的目标序列的引物
所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L TrisBuffer配制成100pmol/mL的贮存液。
同理，本领域的工作人员，可以根据实际需要，按照上述方法，单独构建KIF6基因、KIF6和apoE基因SNP检测液相芯片。
实施例2运用实施例1所述的apo E、KIF6基因和染色体9p21区段SNP检测液相芯片对样本的检测
所述各种溶液的配方如下：
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)：
| 试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250ml的用量 |
| MES(2[N-Morpholino] ethanesulfonic acid) | Sigma M-2933 | 0.05M | 2.44g |
[0066]
| 5M NaOH | Fisher SS256-500 | 5滴 |
2×Tm杂交缓冲液
| 试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250ml的用量 |
| 1MTris-HCl，pH8.0 | Sigma T3038 | 0.2M | 50ml |
| 5M NaCl | Sigma S5150 | 0.4M | 20ml |
| Triton X-100 | Sigma T8787 | 0.16％ | 0.4ml |
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取：
参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法，得到待检测的DNA。
二、待测样品的PCR扩增
利用Primer5.0设计八对引物，多重PCR一步扩增出apo E基因的外显子4，KIF6基因的外显子19和染色体9p21区段基因间隔区等共八条含有突变位点的目标序列，产物大小分别为264bp、385bp、274bp、269bp、339bp、225bp、302bp和269bp。引物序列(SEQ ID NO.55-70)见上述表3所示。
首先配制多重PCR引物工作液：分别各取SEQ ID NO.55-70的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下；
2×缓冲液(含Mg2+) 25ul
dNTP(各2.5mmol/L) 4ul
Taq酶(5U/ul) 0.2ul
多重PCR引物工作液(各8.3pmol/mL) 6ul
模板DNA(10ng/ul) 2ul
ddH2O 12.8ul
共 50ul
PCR扩增程序为：95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃40s，30个循环：72℃10min；4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
1.取7.5ul PCR反应后的产物，加入1ul 10×SAP缓冲液、1ul SAP酶和0.5ul Exo-I酶；
2.37℃孵育15min，80℃孵育15min，灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用上述设计的ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液：分别取待检测的apo E、KIF6和9p21基因多态性位点相应野生型和突变型ASPE引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/LTris Buffer补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：
10×缓冲液 2ul
MgCl2(50mmol/L) 0.5ul
Biotin-dCTP(400umol/L) 0.25ul
dATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L) 1ul
Tsp酶(5U/ul) 0.25ul
混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L) 1ul
酶切处理的PCR扩增产物 5ul
ddH2O 10ul
共 20ul
反应程序为：96℃2min；94℃30s，54℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物，每组选择相应的最优微球(微球浓度均为2.5×105个/ml)；
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；
3.微球于≥10000g离心1-2min；
4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH2O；
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul；
7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；
8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；
9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；
10.微球于≥3000g离心2-5min；
11.将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；
12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。检测结果如表4～表8所示。
对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求：
1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI；
2.NET MFI＝样品MFI-PCR阴性对照MFI(NETMFI小于0的以0表示)；
3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值：
突变比值＝突变型NETMFI+(突变型NETMFI+野生型NET MFI)
4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值)，以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。
使用本方法检测20份样本的apo E、KIF6基因和染色体9p21区段多态性，实验数据符合上述要求，因此可计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下：突变比值范围在0％-20％视为野生型纯合子；30％-70％视为杂合子；80％-100％视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的apo E、KIF6基因和染色体9p21区段基因型检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的apo E、KIF6基因和染色体9p21区段SNP检测液相芯片能够准确地检测出apo E、KIF6基因和染色体9p21区段的SNP类型，且结果稳定可靠。
表4 样本检测结果一(MFI)
表5 样本检测结果二(MFI)
表6 样本apoE、KIF6基因和染色体9p21区段突变比值
表7 样本apoE、KIF6基因和染色体9p21区段突变类型分析结果一(检测结果)
表8 样本apo E、KIF6基因和染色体9p21区段突变类型分析结果二(测序结果)
实施例3不同的ASPE引物的液相芯片对apo E、KIF6基因和染色体9p21区段SNP位点的检测
一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)
以apo E基因C609T位点、KIF6基因T2155C位点和染色体9p21区段G22115503C突变检测液相芯片为例，分别针对C609T、T2155C和G22115503C SNP位点的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.18，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQ IDNO.37-SEQ IDNO.54。具体设计如下表(表9)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表9 液相芯片制备的设计
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测结果如下：
表10 样本apo E SNP检测结果与基因多态性分析
表11 样本KIF6 SNP检测结果与基因多态性分析
表12 样本9p21 SNP检测结果与基因多态性分析
其它针对不同的SNP位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的Tag序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。
实施例4不同间隔臂液相芯片对apo E、KIF6基因和染色体9p21区段SNP位点SNP检测
一、液相芯片制备的设计(间隔臂的选择)
以KIF6基因T2155C位点突变的检测液相芯片为例，探明不同的间隔臂液相芯片对KIF6基因SNP检测的影响。针对T2155C的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列分别为SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42。探明不同的间隔臂液相芯片对KIF6基因SNP检测的影响，其中，不同的间隔臂为(CH2)12或5 10个T，
具体设计如下表(表13)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表13 液相芯片制备的设计
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品41-60进行检测，检测结果如下：
表13 样本检测结果与基因多态性分析
实施例4的间隔臂为(CH2)12的液相芯片，其检测结果稳定可靠(其它间隔臂的检测结果也如此，具体数据省略)，而优选5-10个T的间隔臂的杂交反应率和杂交特异性均优于间隔臂为(CH2)12的液相芯片，本发明所采用的5-10个T的间隔臂均优于其他间隔臂。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
序列表
<110>广州益善生物技术有限公司
<120>KIF6、apo E基因和染色体9p21区段SNP检测液相芯片
<160>70
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
cttttcaatt acttcaaatc ttca 24
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
aatcaatctt cattcaaatc atca 24
<210>3
<211>24
<2l2>DNA
<213>人工序列
<400>3
tcaatcaatt acttactcaa atac 24
<210>4
<211>24
<212>DNA
<212>人工序列
<400>4
tcaattaccttttcaataca atac 24
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ttcaatcatt caaatctcaa cttt 24
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
attattcact tcaaactaat ctac 24
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
taattataca tctcatcttc taca 24
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
aatcatacct ttcaatctt ttaca 24
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
cttttacaat acttc aatacaatc 24
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
ttactcaaaa tctacacttt ttca 24
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
cttttcaaat caatactcaa cttt 24
<210>12
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
tcaattactt cactt taatcct tt 24
<210>l3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
caattcattt cattcacaat caat 24
<210>14
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
tcaatcatta cacttttcaa caat 24
<210>15
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
tcaatcatct ttatacttca caat 24
<210>16
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
caatttactc atatacatca cttt 24
<210>17
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
cttttcatca ataatcttac cttt 24
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
aatctacaaa tccaataatc tcat 24
<210>19
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
ggacatggag gacgtgc 17
<210>20
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
ggacatggag gacgtgt 17
<210>21
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
ccgatgacct gcagaagt 18
<210>22
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
ccgatgacct gcagaagc 18
<210>23
<211>19
<2l2>DNA
<213>人工序列
<400>23
tctgactccc agcatgaat 19
<210>24
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
tctgactccc agcatgaac 19
<210>25
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
taaccatatg atcaacagtt g 21
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<4O0>26
taaccatatg atcaacagtt c 21
<210>27
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
tcaaatctaa gctgagtgtt ga 22
<210>28
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
tcaaatctaa gctgagtgtt gg 22
<210>29
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
ggtgtggtca ttccggtaa 19
<210>30
<211>19
<212>DNA
<212>人工序列
<400>30
ggtgtggtca ttccggtag 19
<210>31
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
tccttagaaa tgttattgta gta 23
<210>32
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>32
tccttagaaa tgttattgta gtg 23
<210>33
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
tcctgttcgg atcccttca 19
<210>34
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>34
tcctgttcgg atcccttcg 19
<210>35
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
aaagatgtcc tgtttggaac a 21
<210>36
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
aaagatgtcc tgtttggaac g 21
<210>37
<211>24
<212>DNA
<2l3>人工序列
<400>37
tgaagatttg aagtaattgaaaag 24
<210>38
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
tgatgatttg aatgaagatt gatt 24
<210>39
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>39
gtattgtatt gaaaaggtaa ttga 24
<210>40
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>40
gtatttgagt aagtaattga ttga 24
<210>41
<211>24
<2l2>DNA
<213>人工序列
<400>41
aaagttgaga tttgaatgat tgaa 24
<210>42
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>42
gtagattagt ttgaagtgaa taat 24
<210>43
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>43
tgtagaagat gagatgtata atta 24
<210>44
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>44
tgtaaaagat tgaaaggtat gatt 24
<210>45
<211>24
<2l2>DNA
<213>人工序列
<400>45
gattgtattg aagtattgta aaag 24
<210>46
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>46
tgaaaaagtg tagattttga gtaa 24
<210>47
<211>24
<2l2>DNA
<213>人工序列
<400>47
aaagttgagt attgatttga aaag 24
<210>48
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>48
aaaggattaa agtgaagtaa ttga 24
<210>49
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>49
attgattgtg aatgaaatga attg 24
<210>50
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>50
attgttgaaa agtgtaatga ttga 24
<210>51
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>51
attgtgaagt ataaagatga ttga 24
<210>52
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>52
aaagtgatgt atatgagtaa attg 24
<210>53
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>53
aaaggtaaga ttattgatga aaag 24
<210>54
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>54
atgagattat tggatt tgta gatt 24
<210>55
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>55
gcacggctgt ccaaggag 18
<210>56
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>56
gcggatggcg ctgaggc 17
<210>57
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>57
ctggggccaa caggtaaatt 20
<210>58
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>58
gcaggaccag ggcttgatt 19
<210>59
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>59
acacttctta ggctatcatt tc 22
<210>60
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>60
acaaagggct cataattgct g 21
<210>61
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>61
tgagcctatg tgtgtttctg c 21
<210>62
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>62
taact tctgcctcactctcc a 21
<210>63
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>63
tggaaagtgacaaagaggac a 21
<210>64
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>64
tagactccac gctgttccc 19
<210>65
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>65
ctatcctggt tgccccttct 20
<210>66
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>66
aagccaccaa ggaagaggag 20
<210>67
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>67
acttagccct tgggaccatt 20
<210>68
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>68
tggggagtac agactacctt g 21
<210>69
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>69
tagcacagga tgttccagtc a 21
<210>70
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>70
agtaatggag gtgtggtcag c 21
Claims (7)
1.一种KIF6基因SNP检测液相芯片，其特征是，主要包括有：
(A)针对KIF6基因的T2155C SNP位点设计的野生型和突变型的ASPE引物对，每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对T2155C SNP位点的特异性引物组成，所述特异性引物是：SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.18；
(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQID NO.37～SEQ ID NO.54中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；
(C)用于扩增具有T2155C SNP位点的KIF6基因目标序列的扩增引物；
所述扩增引物为SEQ ID NO.57～SEQ ID NO.58。
2.根据权利要求1所述的KIF6基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物对为：由SEQID NO.5和SEQ ID NO.23组成的序列以及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.24组成的序列。
3.一种KIF6和apo E基因SNP检测液相芯片，其特征是，主要包括有：
(A)针对每种基因的SNP位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对，每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物组成，所述特异性引物是：针对KIF6基因T2155C SNP位点的SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24；以及针对apo E基因C609T SNP的SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20、和/或针对apo E基因T471C的SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.18；
(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQID NO.37～SEQ ID NO.54中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；
(C)用于扩增具有KIF6基因T2155C SNP位点、以及apo E基因的C609T和/或T471C SNP的目标序列的扩增引物；
所述扩增引物为：针对KIF6基因T2155C SNP位点的SEQ ID NO.57～SEQ ID NO.58；以及针对apo E基因的SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56。
4.根据权利要求3所述的KIF6和apo E基因SNP检测液相芯片，其特征是，
所述ASPE引物对为：针对KIF6基因T2155C SNP的由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.23组成的序列以及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.24组成的序列；以及针对apo E基因C609T SNP的由SEQID NO.1和SEQ ID NO.19组成的序列、由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.20组成的序列，和/或针对apo E基因T471C的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.21组成的序列、由SEQ ID NO.4和SEQID NO.22组成的序列。
5.一种KIF6、apo E基因和染色体9p21区段SNP检测的液相芯片，其特征是，
主要包括有：
(A)针对每种基因的SNP位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对，每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物组成，所述tag序列选自SEQID NO.1～SEQ ID NO.18；所述特异性引物是：针对KIF6基因T2155C SNP位点的SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.24；
针对apo E基因C609T SNP位点的SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20、和/或针对apo E基因T471C SNP位点的SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22；以及
针对染色体9p21区段G22115503C SNP的SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、A22086055G SNP的SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、A22114477G SNP的SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30、A22105026G SNP的SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32、A22105959G SNP的SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34、和/或A22088619G SNP的SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36；
(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.37～SEQ ID NO.54中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；
(C)用于扩增具有KIF6基因T2155C SNP位点、apo E基因的C609T和T471C SNP位点、以及染色体9p21区段的G22115503C、A22086055G、A22114477G、A22105026G、A22105959G和/或A22088619G的目标序列的扩增引物；
所述扩增引物为：针对KIF6基因T2155C SNP位点的SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58；以及针对apo E基因的SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56；以及针对染色体区段9p21的SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.64、SEQ IDNO.65和SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68、和/或SEQ ID NO.69和SEQ IDNO.70。
6.根据权利要求5所述的KIF6、apo E基因和染色体9p21区段SNP检测的液相芯片，其特征是，所述ASPE引物对为：
针对KIF6基因T2155C SNP的由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.23组成的序列以及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.24组成的序列；以及
针对apo E基因C609T SNP的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.19组成的序列、由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.20组成的序列，和/或针对apo E基因T471C SNP的由SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.21组成的序列、由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.22组成的序列；以及
针对染色体9p21区段的由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.25组成的序列以及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.26组成的序列、由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.27组成的序列以及由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.28组成的序列、由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.29组成的序列以及由SEQ IDNO.12和SEQ ID NO.30组成的序列、由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.31组成的序列以及由SEQID NO.14和SEQ ID NO.32组成的序列、由SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.33组成的序列以及由SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.34组成的序列、和/或由SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.35组成的序列以及由SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.36组成的序列。
7.根据权利要求5所述的KIF6、apo E基因和染色体9p21区段SNP检测的液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5-10个T。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010196784 CN102010897B (zh) | 2010-06-08 | 2010-06-08 | KIF6、apo E基因和染色体9p21区段SNP检测液相芯片 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010196784 CN102010897B (zh) | 2010-06-08 | 2010-06-08 | KIF6、apo E基因和染色体9p21区段SNP检测液相芯片 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102010897A CN102010897A (zh) | 2011-04-13 |
| CN102010897B true CN102010897B (zh) | 2013-08-28 |
Family
ID=43841226
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201010196784 Active CN102010897B (zh) | 2010-06-08 | 2010-06-08 | KIF6、apo E基因和染色体9p21区段SNP检测液相芯片 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102010897B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110157797B (zh) * | 2019-06-05 | 2020-05-05 | 北京益序医疗科技有限公司 | 一种用于他汀类药物个体化基因检测的探针组及试剂盒 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040005566A1 (en) * | 2002-07-02 | 2004-01-08 | Genelink, Inc. | Kits and methods for assessing cardiovascular health |
| EP1778861A4 (en) * | 2004-07-01 | 2008-11-19 | Medical Res Fund At The Tel Av | METHODS AND KITS FOR PREDICTING THE SPEED OF PROGRESSION OF HEPATIC FIBROSIS IN PATIENTS WITH CHRONIC HEPATITIS C |
| US7485711B2 (en) * | 2005-08-12 | 2009-02-03 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | CYP19A1 polymorphisms |
-
2010
- 2010-06-08 CN CN 201010196784 patent/CN102010897B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102010897A (zh) | 2011-04-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101984072B (zh) | 一种pdgfra基因突变检测液相芯片 | |
| CN102154455B (zh) | 一种cyp2c9基因snp检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102010901B (zh) | apo E基因和染色体9p21区段SNP检测液相芯片以及特异性引物 | |
| CN102021238B (zh) | Adrb1基因snp检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102010897B (zh) | KIF6、apo E基因和染色体9p21区段SNP检测液相芯片 | |
| CN102533948B (zh) | 一种apoB基因SNP检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102031286B (zh) | 染色体9p21区段和KIF6基因SNP检测液相芯片以及特异性引物 | |
| CN102134605A (zh) | 一种cyp2c19基因snp检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN103031367B (zh) | 一种vhl基因突变检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102021236B (zh) | Agt1r基因snp检测液相芯片和特异性引物 | |
| CN102533951B (zh) | 一种brap与psma6基因snp检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102021240A (zh) | 一种gstm1、gstt1和gstp1基因突变检测液相芯片 | |
| CN102010898B (zh) | Ephx1基因检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN103849940B (zh) | Bard1基因突变检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102994622B (zh) | 一种met基因突变检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102010900B (zh) | GPIIIa和COX-1基因SNP检测液相芯片以及特异性引物 | |
| CN102021237A (zh) | Cyp4f2和ephx1基因snp检测液相芯片以及特异性引物 | |
| CN103571920B (zh) | Klk3基因突变检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102533947B (zh) | 一种kcnq1、kcne2与kcnn3基因snp检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102277413A (zh) | Cox-1基因snp检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN101824476B (zh) | Oprm1基因snp检测特异性引物、液相芯片和检测方法 | |
| CN102912005B (zh) | 一种cyp2c8基因多态性检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102559850A (zh) | 一种apoA5基因突变检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN103374600B (zh) | 染色体13q22区段SNP检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN103849938B (zh) | Map3k1基因突变检测特异性引物和液相芯片 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C56 | Change in the name or address of the patentee |
Owner name: SUREXAM BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER NAME: GUANGZHOU YISHAN BIOTECHNOLOGY CO., LTD. |
|
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: Five 510663 Guangdong city of Guangzhou province Guangzhou Science City Moon Road No. 80, Guangzhou technology innovation base B, C Patentee after: Surexam Biological Technology Co., Ltd. Address before: Five 510663 Guangdong city of Guangzhou province Guangzhou Science City Moon Road No. 80, Guangzhou technology innovation base B, C Patentee before: Guangzhou Yishan Biotechnology Co., Ltd. |