CN102277413A - Cox-1基因snp检测特异性引物和液相芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种COX-1基因SNP检测特异性引物和液相芯片，该液相芯片主要包括有：由5’端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物组成的ASPE引物对，所述特异性引物是：针对C50T SNP位点的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、针对A842G SNP位点的SEQID NO.9和SEQ ID NO.10、和/或针对G123A SNP位点的SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6；微球；扩增引物。所述检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，能够避免交叉反应，且可以实现多个SNP位点的并行检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种COX-1基因SNP检测液相芯片以及特异性引物。
背景技术
环氧合酶(Cyclooxygenase，COX)是花生四烯酸转化成类花生酸类物质途径中重要的限速酶，如：前列腺素的合成(Prostaglandins，PGs)。环氧合酶存在两种同工酶，即为COX-1和COX-2，COX-1(Cyclooxygenase 1)属于管家酶，又名前列腺素内过氧化物G/H合成酶(prostaglandin endoperoxide G/H synthase，PTGS1)，在机体的各组织中均有表达，它产生的前列腺素参与机体正常的生理过程和保护功能，在大多数正常细胞中都呈稳定表达。一般情况下活性稳定，在应激状态下或受某些激素、生长因子刺激时，其活性可轻度增加2倍～4倍。COX-1蛋白由576个氨基酸组成，其编码基因位于染色体9，大小约22kb，含有11个外显子。有研究表明，携带不平衡完全连锁的C50T和A842G单核苷酸突变的患者，阿司匹林在前列腺素H2合成过程中比正常的基因型起着更大的抑制作用。此外，COX-1的G123A位点多态性与阿司匹林抵抗(Aspirin Resistance，AR)相关。其中，C50T(rs3842787)位于COX-1的exon2上，A842G(rs10306114)发生在COX-1的启动子区域，G123A(rs3842788)发生在COX-1的exon3上。
目前对COX-1多态性检测的产品一般基于PCR技术的荧光定量PCR法、RFLP法和DNA测序法等，存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点，同时由于检测通量的局限性，不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种COX-1基因SNP检测液相芯片，该液相芯片可用于检测COX-1基因三种常见基因型C50T、A842G和G123A的野生型和突变型。
实现上述目的的技术方案如下：
一种COX-1基因SNP检测液相芯片，主要包括有：
(A)针对COX-1基因的SNP位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物组成，所述特异性引物是：针对C50T SNP位点的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、针对A842G SNP位点的SEQID NO.9和SEQ ID NO.10、和/或针对G123A SNP位点的SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6；
(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.18中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；
(C)用于扩增出具有C50T、A842G和/或G123A SNP位点的COX-1基因目标序列的扩增引物。
优选地，所述扩增引物为针对C50T SNP位点的SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.20，针对A842GSNP位点的SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.22，和/或针对G123A SNP位点SEQ ID NO.23～SEQ IDNO.24。
更优选地，所述ASPE引物对为：针对C50T SNP位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.7组成的序列以及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.8组成的序列、针对A842G SNP位点的由SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.9组成的序列以及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.10组成的序列、和/或针对G123A SNP位点的由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.11组成的序列以及由SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.12组成的序列。
本发明还提供了用于COX-1基因SNP检测的特异性引物，包括有：针对C50T SNP位点的野生型和突变型的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、针对A842G SNP位点的野生型和突变型的SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、和/或针对G123A SNP位点的野生型和突变型的SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。
本发明的主要优点在于：
1.本发明所提供的液相芯片与测序法的检测结果吻合率高达100％。所制备的COX-1基因SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个SNP位点的并行检测。
2.本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型别的基因型。
3.本发明的检测方法步骤简单，三种SNPs检测可通过一步多重PCR即可完成三个具有SNP位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
实施例1 COX-1基因SNP检测液相芯片，主要包括有：
一、ASPE引物
针对COX-1基因的三种常见SNP位点C50T(rs3842787)、A842G(rs10306114)和G123A(rs3842788)，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示：
表1 ASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)
每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/LTris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的6种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示：
表2 微球编号与微球上相应的anti-tag序列
选择的六种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T，微球包被的过程如下：
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0)]，1mmol/LEDTA中，2-8℃避光保存。
三、扩增出含有突变位点的目标序列的引物
针对COX-1基因的三种常见的SNP位点C50T、A842G和G123A，其中，C50T和A842G为不平衡完全连锁，C50T位于COX-1的exon2上，A842G发生在COX-1的启动子区域，而G123A发生在COX-1的exon3上；利用Primer5.0设计三对引物(见表3)，分别扩增出三条含有SNP位点的目标序列。
表3 扩增出具有SNP位点的目标序列的引物
所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
实施例2 运用COX-1基因检测液相芯片对样本的检测
所述各种溶液的配方如下：
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)：
| 试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250ml的用量 |
| MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma M-2933 | 0.05M | 2.44g |
| 5M NaOH | Fisher SS256-500 | --- | 5滴 |
2×Tm杂交缓冲液
| 试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250ml的用量 |
| 1MTris-HCl，pH8.0 | SigmaT3038 | 0.2M | 50ml |
| 5M NaCl | Sigma S5150 | 0.4M | 20ml |
| Triton X-100 | Sigma T8787 | 0.16％ | 0.4ml |
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取：
参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法，得到待检测的DNA。
二、待测样品的PCR扩增
利用Primer5.0设计四对引物，多重PCR一步扩增出COX-1基因的exon2，COX-1的启动子区域和COX-1基因的exon3共三条含有SNP位点的目标序列，产物大小分别为554bp、202bp和297bp，引物序列(SEQ ID NO.19-24)见上述表3所示。
首先配制多重PCR引物工作液：分别各取SEQ ID NO.19-24的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：
2×缓冲液(含Mg2+) 25ul
dNTP(各2.5mmol/L) 4ul
Taq酶(5U/ul) 0.2ul
多重PCR引物工作液(各8.3pmol/mL) 6ul
模板DNA(10ng/ul) 2ul
ddH2O 12.8ul
共 50ul
PCR扩增程序为：95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min；4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
1.取7.5ul PCR反应后的产物，加入1ul 10×SAP缓冲液、1ul SAP酶和0.5ul Exo-I酶；
2.37℃孵育15min，80℃孵育15min，灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用上述设计的ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液：分别取COX-1基因的C50T、A842G、G123A相应的野生型和突变型ASPE引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/LTris Buffer补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：
10×缓冲液 2ul
MgCl2(50mmol/L) 0.5ul
Biotin-dCTP(400umol/L) 0.25ul
dATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L) 1ul
Tsp酶(5U/ul) 0.25ul
混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L) 1ul
酶切处理的PCR扩增产物 5ul
ddH2O 10ul
共 20ul
反应程序为：96℃2min；94℃30s，58℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物，每组选择相应的最优微球(微球浓度均为2.5×105个/ml)。每种微球分别带有不同颜色编码，同时每种微球表面分别连接有一段24bp的特异性的寡核苷酸序列(anti-tag)，这些anti-tag序列能分别与对应的ASPE引物5’端的tag序列特异结合；
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；
3.微球于≥10000g离心1-2min；
4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH2O；
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul；
7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；
8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；
9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；
10.微球于≥3000g离心2-5min；
11.将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；
12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。检测结果如表4、表5和表6所示。
对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求：
1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI；
2.NET MFI＝样品MFI-PCR阴性对照MFI(NET MFI小于0的以0表示)；
3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值：
突变比值＝突变型NET MFI÷(突变型NET MFI+野生型NET MFI)
4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值)，以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。
使用本方法检测20份样本的COX-1基因SNP位点，实验数据符合上述要求，因此可计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下：突变比值范围在0％-20％视为野生型纯合子；30％-70％视为杂合子；80％-100％视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的COX-1基因型检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的COX-1 SNP检测液相芯片能够准确地检测出COX-1的SNP类型，且结果稳定可靠。
表4 样本检测结果(MFI)
表5 样本COX-1基因突变比值(％)
表6 样本COX-1基因突变类型分析结果
实施例3 不同的ASPE引物的液相芯片对COX-1基因SNP位点的检测
一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)
以COX-1基因C50T位点突变检测液相芯片为例，分别针对C50T的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ ID NO.1-SEQID NO.6，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.18。具体设计如下表(表7)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表7 液相芯片制备的设计
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测结果如下：
表8 样本检测结果与基因多态性分析
其它针对不同的SNP位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的Tag序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。
实施例4 不同间隔臂液相芯片对COX-1基因SNP检测
一、液相芯片制备的设计(间隔臂的选择)
以COX-1基因G123A(rs3842788)位点突变的检测液相芯片为例，探明不同的间隔臂液相芯片对COX-1基因SNP检测的影响。针对G123A的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列分别为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18。探明不同的间隔臂液相芯片对COX-1基因SNP检测的影响，其中，不同的间隔臂为(CH2)12或5-10个T，具体设计如下表(表9)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表9 液相芯片制备的设计
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品41-60进行检测，检测结果如下：
表10 样本检测结果与基因多态性分析
实施例4中间隔臂为(CH2)12的液相芯片，其检测结果稳定可靠(其它间隔臂的检测结果也如此，具体数据省略)，而优选5-10个T的间隔臂的杂交反应率和杂交特异性均优于间隔臂为(CH2)12的液相芯片，本发明所采用的5-10个T的间隔臂均优于其他间隔臂。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
序列表
<110>广州益善生物技术有限公司
<120>COX-1基因SNP检测特异性引物和液相芯片
<160>24
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
tcaattacct tttcaataca atac 24
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
cttttcaat tacttcaaatc ttca 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
aatcaatctt cattcaaatc atca 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
tcaatcaatt acttactcaa atac 24
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<211>24
<212>DNA
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<400>5
tcatttacca atctttcttt atac 24
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<211>24
<212>DNA
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<400>6
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<212>DNA
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<400>7
ttcctgctcc tgctccc 17
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<212>DNA
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<400>8
ttcctgctcc tgctcct 17
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<212>DNA
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<400>9
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<211>20
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<213>人工序列
<400>10
agcacctact acatgctggg 20
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gttgttacta tccatgccag 20
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gttgttacta tccatgccaa 20
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tgaagatttg aagtaattga aaag 24
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tgatgatttg aatgaagatt gatt 24
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gtatttgagt aagtaattga ttga 24
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gtataaagaa agattggtaa atga 24
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gtagtaatgt taatgaatta gtag 24
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cctggtggag ccttgaatg 19
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gttcccagac ggttagagg 19
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gccttccgat aactgagcac 20
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tcaaatccag actccacagc 20
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gcacccagtg attcaggac 19
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
gagcagaagg gctcaagac 19
Claims (5)
1.一种COX-1基因SNP检测液相芯片，其特征是，主要包括有：
(A)针对COX-1基因的SNP位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物组成，所述特异性引物是：针对C50T SNP位点的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、针对A842G SNP位点的SEQID NO.9和SEQ ID NO.10、和/或针对G123A SNP位点的SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6；
(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.18中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；
(C)用于扩增具有C50T、A842G和/或G123A SNP位点的COX-1基因目标序列的扩增引物。
2.根据权利要求1所述的COX-1基因SNP检测液相芯片，其特征是，
所述扩增引物为：针对C50T SNP位点的SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.20，针对A842G SNP位点的SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.22，和/或针对G123A SNP位点SEQ ID NO.23～SEQ IDNO.24。
3.根据权利要求1所述的COX-1基因SNP检测液相芯片，其特征是，
所述ASPE引物对为：针对C50T SNP位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.7组成的序列以及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.8组成的序列、针对A842G SNP位点的由SEQ ID NO.3和SEQID NO.9组成的序列以及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.10组成的序列、和/或针对G123A SNP位点的由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.11组成的序列以及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.12组成的序列。
4.根据权利要求1-3所述的COX-1基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5-10个T。
5.用于COX-1基因SNP检测的特异性引物，其特征是，包括有：针对C50T SNP位点的野生型和突变型的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、针对A842G SNP位点的野生型和突变型的SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、和/或针对G123A SNP位点的野生型和突变型的SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12。
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