CN102234685B - 一种pik3ca基因突变检测液相芯片 - Google Patents

一种pik3ca基因突变检测液相芯片 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种PIK3CA基因突变检测液相芯片，其主要包括有：(A)针对PIK3CA基因的突变位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列能相应地与所选的tag序列互补配对；用于扩增出具有Exon 9和/或Exon 20的相应突变位点的PIK3CA基因目标序列的扩增引物。本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100％。所制备的PIK3CA基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，可实现同一位点多种突变型和多种突变位点的并行检测。

Description

一种PIK3CA基因突变检测液相芯片
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及PIK3CA基因突变检测液相芯片。
背景技术
PI3Ks(phosphatidylinositol3-kinases)是一组蛋白的多聚体，这些多聚体分为三类(ClassI、II和III)。I类(Class I)蛋白可包括两个亚单位：IA和IB。IA是由一个p110催化亚单位和一个p85调节亚单位组成的异源二聚体。PIK3CA基因是编码IA类的p110α催化亚单位。PI3Ks可由生长因子受体酪氨酸激酶(RTK)激活。PI3K的活化可产生多种生物学效应，包括调节细胞增殖、存活和细胞周期调控等方面。
PIK3CA点突变的位点在多个外显子中都有发现，但主要是发生在“激酶”和“螺旋”两个结构域(the kinase and helical domains)。其中最常见的突变是外显子9(Exon 9)的E542K和E545K，和外显子20(Exon 20)的H1047R，如下表：
目前，已经建立的PIK3CA基因突变检测技术，主要是PCR-测序法和实时荧光定量PCR检测技术。PCR-测序法具有能够确定突变范围和类型的优点，是目前应用较为广泛的检测方法，但测序法的灵敏度只有20％-25％，远远不能满足临床应用的需要，尤其是对于异质性的肿瘤体细胞突变，低灵敏度将导致大量的漏检。同时，测序法检测操作复杂，时效性差，对于要求高时效性和高灵敏度临床检测，测序法的局限性早已凸显。而实时荧光定量PCR检测技术，其检测效率高，时效性强，但其高居不下的假阳性率也为临床应用所诟病。基于上述检测技术存在的问题，申请人前期成功开发的“PIK3CA基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法”(申请号：200810220266.1)检测方法操作简单，通过酶切富集排除了大量野生型序列造成的干扰，结果特异性好，灵敏度高，准确度达99％以上，但该方法涉及两轮PCR操作，较易造成污染，且杂交检测步骤探针较为接近(只有突变位点不同)，不便于多种基因突变位点并行检测。
发明内容
本发明的目的之一是提供PIK3CA基因突变检测液相芯片。该液相芯片可用于检测PIK3CA基因外显子9的两种正常基因型(542-w、545-w)和五种突变型(E542K、E545K、E545G、E545A、E545D)，以及外显子20的正常基因型(1047-w)和两种突变型(H1047R、H1047L)。
一种PIK3CA基因突变检测液相芯片，主要包括有：
(A)针对PIK3CA基因的突变位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物组成，所述tag序列选自SEQID NO.1～SEQ ID NO.10中的序列；所述特异性引物是：针对Exon 9Codon542的、来源于SEQID NO.11或其反向互补序列SEQ ID NO.41中的碱基序列、和来源于SEQ ID NO.12或其反向互补序列SEQ ID NO.42中的碱基序列；针对于Exon 9Codon545的、来源于SEQ ID NO.13或其反向互补序列SEQ ID NO.43中的碱基序列、和来源于SEQ ID NO.14～SEQ ID NO.17中一种以上的碱基序列，或来源于其反向互补序列SEQ ID NO.44～SEQ ID NO.47中的一种以上的碱基序列；和/或针对Exon 20Codon1047的、来源于SEQ ID NO.18或其反向互补序列SEQ ID NO.48中的碱基序列、和来源于SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.20中一种以上的碱基序列，或来源于其反向互补序列SEQ ID NO.49～SEQ ID NO.50中的一种以上的碱基序列；上述特异性引物的3’端的最后3位碱基中的一个碱基为突变位点，所述特异性引物的Tm值在52～58℃之间；
(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.71～SEQ ID NO.80中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；
(C)用于扩增出具有Exon 9和/或Exon 20的相应突变位点的PIK3CA基因目标序列的扩增引物。
优选地，所述扩增引物为：当特异性引物来源于SEQ NO.11～SEQ NO.17或其反向互补序列时，针对Exon 9的扩增引物为SEQ.NO.81～SEQ.NO.82；当特异性引物来源于SEQNO.18～SEQ NO.20或其反向互补序列时，针对Exon 20的扩增引物为SEQ.NO.83～SEQ.NO.84。
优选地，所述特异性引物为：针对Exon9 Codon542野生型的SEQ ID NO.21或SEQ IDNO.22，以及Codon542突变型E542K的SEQ ID NO.23或SEQ ID NO.24；和/或针对Exon9Codon545野生型的SEQ ID NO.25或SEQ ID NO.26，以及突变型中的E545K突变位点的SEQ IDNO.27或SEQ ID NO.28、E545G突变位点的SEQ ID NO.29或SEQ ID NO.30、E545A突变位点的SEQ ID NO.31或SEQ ID NO.32、和/或E545D突变位点的SEQ ID NO.33或SEQ ID NO.34；和/或针对Exon 20Codon1047野生型的SEQ ID NO.35或SEQ ID NO.36，以及突变型中的H1047R突变位点的SEQ ID NO.37或SEQ ID NO.38、和/或H1047L突变位点的SEQ ID NO.39或SEQ ID NO.40。
或者，所述特异性引物为：针对Exon 9Codon542野生型的SEQ ID NO.51或SEQ ID NO.52，以及Codon542突变型E542K的SEQ ID NO.53或SEQ ID NO.54；和/或针对Exon 9Codon545野生型的SEQ ID NO.55或SEQ ID NO.56，以及突变型中的E545K突变位点的SEQ ID NO.57或SEQ ID NO.58、E545G突变位点的SEQ ID NO.59或SEQ ID NO.60、E545A突变位点的SEQ IDNO.61或SEQ ID NO.62、和/或E545D突变位点的SEQ ID NO.63或SEQ ID NO.64；和/或针对Exon 20Codon1047野生型的SEQ ID NO.65或SEQ ID NO.66，以及突变型中的H1047R突变位点的SEQ ID NO.67或SEQ ID NO.68、和/或H 1047L突变位点的SEQ ID NO.69或SEQ IDNO.70。
优选地，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述间隔臂序列为5-10个T。
本发明的主要优点在于：
1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100％。所制备的PIK3CA基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，可实现同一位点多种突变型和多种突变位点的并行检测。
2.本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种突变类型。各种特异性ASPE引物，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种引物、探针之间基本不存在非特异性结合。
3.本发明的检测方法步骤简单，可通过一步多重PCR即可完成多个位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
4.本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合临床需要。多种ASPE特异性引物的组合使用使液相芯片和检测方法形成一个检测效果完好的系统。
5.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
实施例1PIK3CA基因突变检测液相芯片，主要包括有：
一、ASPE引物
针对PIK3CA基因Exon9的五种突变型：E542K、E545K、E545G、E545A、E545D，以及Exon20两种突变型：H1047R、H1047L，分别设计特异性的引物序列。
PIK3CA基因突变检测的ASPE引物的设计要点为：
ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列”组成。其中，5’端为根据PIK3CA基因突变检测所设计的Tag序列，所设计的Tag序列在反应体系能最大限度的避免ASPE引物可能形成的二级结构，且Tag序列与Tag序列，Tag序列与特异性引物序列之间不发生交叉反应。Tag序列和特异性引物序列形成完整的ASPE引物，并使所有的ASPE引物能够在一个均一的反应体系中同步反应(即同一反应的缓冲环境，同一反应温度等)，完成并行检测。所设计的Tag序列具体如表1。3’端为根据PIK3CA基因突变检测所设计的特异性引物序列，所述特异性引物的Tm值在52～58℃之间；其中针对各种突变型的特异性引物序列，其3’端的最后3位碱基中的一个碱基应为突变位点；所述Exon 9或Exon 20野生型的特异性引物序列3’端的最后3个碱基应分别包含Exon 9或Exon 20突变位点。所述Tm值的计算方式为Tm＝(G+C)×4+(A+T)×2-4。
表1Tag序列
  SEQ ID NO.   Tag序列(5′-3′)
  1   CAATTTCATCATTCATTCATTTCA
  2   TACACAATCTTTTCATTACATCAT
  3   TCATTCATATACATACCAATTCAT
  4   CAATTCATTTCATTCACAATCAAT
  5   TCAATCATTACACTTTTCAACAAT
  6   TTACTACACAATATACTCATCAAT
  7   ATTATTCACTTCAAACTAATCTAC
  8   CTATCTTCATATTTCACTATAAAC
  9   TCATTTCACAATTCAATTACTCAA
  10   TACATCAACAATTCATTCAATACA
表2PIK3CA基因突变检测特异性引物的来源序列(□内为突变碱基)
根据上述的ASPE引物中特异性引物序列的设计要点，设计得到一系列的特异性引物序列，其中例举部分野生型和突变型特异性引物，如表3：
表3PIK3CA基因突变检测特异性引物序列一
同样的，表2中特异性引物的来源序列的反向互补序列也可以用于设计ASPE的特异性引物，具体的序列备选范围如表4：
表4 PIK3CA基因突变检测特异性引物的来源序列二
同样的，根据上述的ASPE引物中特异性引物序列的设计要点，由表4中特异性引物来源序列设计得到一系列的特异性引物序列，其中例举部分野生型和突变型特异性引物，如表5：
表5 PIK3CA基因突变检测特异性引物序列二
所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物序列，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物序列可能形成的二级结构，选择的十种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表6所示：
表6微球编号与微球上相应的anti-tag序列
  SEQ ID NO.   微球上对应的anti-tag序列(5′-3′)   微球编号
  71   TGAAATGAATGAATGATGAAATTG   35
  72   ATGATGTAATGAAAAGATTGTGTA   39
  73   ATGAATTGGTATGTATATGAATGA   34
  74   ATTGATTGTGAATGAAATGAATTG   36
  75   ATTGTTGAAAAGTGTAATGATTGA   38
  76   TGAAAAAGTGTAGATTTTGAGTAA   41
  77   GTAGATTAGTTTGAAGTGAATAAT   32
  78   GTTTATAGTGAAATATGAAGATAG   42
  79   TTGAGTAATTGAATTGTGAAATGA   45
  80   TGTATTGAATGAATTGTTGATGTA   46
选择的10种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T。微球包被的过程如下：
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0)，1mmol/LEDTA中，2-8℃避光保存。
三、扩增出具有检测位点的目标序列的引物：
目标检测PIK3CA基因Exon9的两种正常基因型(542-w、545-w)和五种突变型(E542K、E545K、E545G、E545A、E545D)均位于外显子9中，Exon20的正常基因型(1047-w)和两种突变型(H1047R、H1047L)位于外显子20中。利用Primer5.0设计两对引物(见表7)，扩增出具有检测位点的目标序列。
表7扩增出具有突变位点的目标序列的引物
所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
实施例2运用PIK3CA基因突变检测液相芯片对样本的检测
所述各种溶液的配方如下：
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)：
  试剂   来源   终浓度  每250ml的用量
  MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) Sigma M-2933 0.05M 2.44g
  5MNaOH   Fisher SS256-500   ---  5滴
2×Tm杂交缓冲液
  试剂   来源   终浓度  每250ml的用量
  1MTris-HCl，pH8.0   SigmaT3038   0.2M  50ml
  5M NaCl   Sigma S5150   0.4M  20ml
  Triton X-100   Sigma T8787   0.16％  0.4ml
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取：
参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法，得到待检测的DNA。
二、待测样品的PCR扩增
利用Primer5.0设计引物，多重PCR一步扩增出具有检测位点的目标序列，产物大小分别为141bp、108bp。引物序列(SEQ NO.81-84)见上述表7所示。
首先配制PCR引物工作液：分别各取SEQ NO.81-84的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。PCR反应体系如下：
10×缓冲液(含Mg2+)               5ul
dNTP(各2.5mmol/L)                4ul
Taq酶(5U/ul)                     0.5ul
多重PCR引物工作液(各16.7pmol/mL) 6ul
模板DNA(10ng/ul)                 1ul
ddH2O                            33.5ul
共                               50ul
PCR扩增程序为：95℃3min；94℃20s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
详细步骤如下：
1.取7.5ul PCR反应后的产物，加入3ul ExoSAP-IT酶；
2.37℃孵育15min。80℃孵育15min，使多余的酶灭活。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用上述设计的ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液：分别取Exon9和Exon20相应的野生型和突变型ASPE引物(具体如表8所示)贮存液10ul于2支不同的1.5ml微量离心管中，加入10mmol/L Tris Buffer补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：
其中，Group1和Group3在一个反应系统中同时进行，即对Group1和Group3并行检测。同时，Group2和Group4也在同一个反应系统中同时进行，对Group2和Group4并行检测。
表8液相芯片制备的设计一
10×缓冲液                             2ul
MgCl2(50mmol/L)                        0.5ul
Biotin-dCTP(400umol/L)                 0.25ul
dATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L)    1ul
Tsp酶(5U/ul)                      0.25ul
混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L) 1ul
酶切处理的PCR扩增产物             5ul
ddH2O                             10.ul
共                                20ul
反应程序为：96℃2min；94℃30s，52℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物，每组选择相应的最优的微球(微球浓度均为2.5×105个/ml)。每种微球分别带有不同颜色编码，同时每种微球表面分别连接有一段24bp的特异性的寡核苷酸序列(anti-tag)，这些anti-tag序列能分别与对应的ASPE引物5’端的tag序列特异结合；
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；
3.微球于≥10000g离心1-2min；
4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH2O；
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul；
7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；
8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；
9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；
10.微球于≥3000g离心2-5min；
11将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；
12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。以突变型荧光值(MFI)大于100为cut-off值，当突变型检测的MFI值大于100时，判定该样本存在该突变类型，否则判定该样本为相应的野生型。检测结果如表9、表10和表11所示。
使用本方法检测大量样本的PIK3CA基因突变，以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的PIK3CA基因型检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的PIK3CA基因突变检测液相芯片能够准确地检测出PIK3CA基因的突变类型，且结果稳定可靠。
表10样本检测结果二(MFI)
表11样本PIK3CA基因突变检测结果分析
  样本号   液相芯片检测结果   测序检测结果
  1   野生型   野生型
  2   野生型   野生型
  3   野生型   野生型
  4   野生型   野生型
  5   野生型   野生型
  6   野生型   野生型
  7   E542K突变   E542K突变
  8   野生型   野生型
  9   野生型   野生型
  10   野生型   野生型
  11   野生型   野生型
  12   E542K突变   E542K突变
  13   野生型   野生型
  14   野生型   野生型
  15   野生型   野生型
  16   E545K突变   E545K突变
  17   野生型   野生型
  18   野生型   野生型
  19   野生型   野生型
  20   H1047R突变   H1047R突变
针对同一突变位点所设计的2组特异性引物序列对样品的检测，均取得一致的检测效果。根据上述ASPE引物设计的要点分别设计的不同液相芯片，其特异性引物序列不同，而检测结果一致。其他类似情况的具体检测数据省略。
实施例3来源序列不同的野生型和突变型特异性引物序列的选择
一、液相芯片制备的设计(野生型和突变型特异性引物序列的选择)
针对PIK3CA基因Exon9和Exon20突变位点，分别设计野生型和突变型的ASPE引物3’端的特异性引物序列，检测Exon9和Exon20突变的特异性引物序列分别是来源于SEQ.NO11-20的SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.40，或来源于SEQ NO.41-50的SEQ ID NO.51-SEQID NO.70。野生型和突变型ASPE引物5’端的Tag序列分别选自SEQ ID NO.1-10，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列分别选自SEQ ID NO.71-80。具体设计如下表(表12)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
其中，Group1和Group3在一个反应系统中同时进行，即对Group1和Group3并行检测。同时，Group2和Group4也在同一个反应系统中同时进行，对Group2和Group4并行检测。
表12液相芯片制备的设计二
  基因型   实验组   基因型   特异性引物   Tag序列   anti-tag序列
  Exon9   Group1   542-w1   SEQ ID NO.21   SEQ ID NO.1   SEQ ID NO.71
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测结果如下：
表14样本检测结果二(MFI)
表15样本PIK3CA基因突变检测结果分析
  样本号   液相芯片检测结果   测序检测结果
  21   H1047R突变   H1047R突变
  22   野生型   野生型
  23   野生型   野生型
  24   野生型   野生型
  25   野生型   野生型
  26   野生型   野生型
  27   野生型   野生型
  28   野生型   野生型
  29   野生型   野生型
  30   E542K突变   E542K突变
  31   野生型   野生型
  32   野生型   野生型
  33   E545G突变   E545G突变
  34   野生型   野生型
  35   野生型   野生型
  36   野生型   野生型
  37   野生型   野生型
  38   野生型   野生型
  39   野生型   野生型
  40   野生型   野生型
针对同一突变位点的来源于SEQ ID NO.11-20或来源于SEQ ID NO.41-50的特异性引物序列，符合上述ASPE引物设计的要点，均可用于Exon9和Exon20突变型检测，且检测结果一致，结果稳定可靠。其他类似情况的具体数据省略。
实施例4野生型和突变型特异性引物序列的选择
一、液相芯片制备的设计(野生型和突变型特异性引物序列的选择)
分别以PIK3CA基因的Exon9和Exon20中一个突变位点的检测液相芯片为例，针对Exon9和Exon20的野生型设计ASPE引物3’端特异性引物序列，而Exon9和Exon20突变型分别选取E542K、E545K、H1047R突变位点，针对E542K、E545K、H1047R位点的ASPE引物3’端的特异性引物序列分别选自SEQ ID NO.23～24、SEQ ID NO.27～28和SEQ IDNO.37～38。Exon9和Exon20的野生型(542-w、545-w和1047-w)Tag序列分别固定为：SEQID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，其相应的突变型分别固定为：SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQ ID NO.71～SEQ ID NO.76。具体设计如下表(表16)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表16液相芯片制备的设计三
  类型   特异性引物序列(3’端)   实验组
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品41-60进行检测，检测结果如下：
表18样本PIK3CA基因突变检测结果分析
  样本号   液相芯片检测结果   测序检测结果
  41   野生型   野生型
  42   野生型   野生型
  43   野生型   野生型
  44   野生型   野生型
  45   野生型   野生型
  46   E545K突变   E545K突变
  47   野生型   野生型
  48   野生型   野生型
  49   野生型   野生型
  50   野生型   野生型
  51   野生型   野生型
  52   野生型   野生型
  53   H1047R突变   H1047R突变
  54   野生型   野生型
  55   野生型   野生型
  56   野生型   野生型
  57   野生型   野生型
  58   野生型   野生型
  59   野生型   野生型
  60   野生型   野生型
针对同一突变位点的野生型和突变型特异性引物序列(其中，Exon9和Exon20的野生型特异性引物分别选自SEQ ID NO.21-22、SEQ ID NO.25-26和SEQ ID NO.35-36，针对其相应突变位点的特异性引物分别选自SEQ ID NO.23-24、SEQ ID NO.27-34和SEQ ID NO.37-40)，所组成的液相芯片均可进行检测，且检测结果一致。同样的，根据上述ASPE引物设计的要点分别设计的来源于SEQ ID NO.11-20或SEQ ID NO.41-50的特异性引物，均可进行检测，结果稳定可靠。其他类似情况的具体检测数据省略。
实施例5Tag序列及Anti-Tag序列的选择
一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)
以PIK3CA基因Exon9中E452K位点突变的检测液相芯片为例，针对Exon9的野生型和E452K突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10中的6条，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQ ID NO.71-SEQ ID NO.80。具体设计如下表(表19)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表19液相芯片制备的设计四
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品61-80进行检测，检测结果如下：
表20样本检测结果(MFI)
  74   4164   43   4536   47   4000   41
  75   4115   58   4297   48   4585   56
  76   4377   44   4353   40   4231   53
  77   4479   42   4542   43   4069   57
  78   4102   46   4185   60   4186   47
  79   4432   57   4022   53   4115   59
  80   4414   57   4489   59   4045   48
表21样本PIK3CA基因突变检测结果分析
  样本号   液相芯片检测结果   测序检测结果
  61   野生型   野生型
  62   野生型   野生型
  63   野生型   野生型
  64   野生型   野生型
  65   野生型   野生型
  66   野生型   野生型
  67   野生型   野生型
  68   E542K突变   E542K突变
  69   野生型   野生型
  70   野生型   野生型
  71   野生型   野生型
  72   野生型   野生型
  73   野生型   野生型
  74   野生型   野生型
  75   野生型   野生型
  76   野生型   野生型
  77   野生型   野生型
  78   野生型   野生型
  79   野生型   野生型
  80   野生型   野生型
其它针对不同的突变位点的液相芯片，ASPE引物运用上述所设计的不同的Tag序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
序列表
<110>广州益善生物技术有限公司
<120>一种PIK3CA基因突变检测液相芯片
<160>84
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
caatttcatc attcattcat ttca                                24
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tacacaatct tttcattaca tcat                                24
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tcattcatat acataccaat tcat                                24
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
caattcattt cattcacaat caat                                24
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
tcaatcatta cacttttcaa caat                        24
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
ttactacaca atatactcat caat                        24
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
attattcact tcaaactaat ctac                        24
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
ctatcttcat atttcactat aaac                        24
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
tcatttcaca attcaattac tcaa                        24
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
tacatcaaca attcattcaa taca                              24
<210>11
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
tctttctcct gctcagtgat ttcagagaga ggatctcgtg tag         43
<210>12
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
tctttctcct gctcagtgat tttagagaga ggatctcgtg tag         43
<210>13
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
ctccatagaa aatctttctc ctgctcagtg atttcagaga gaggatct    48
<210>14
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
ctccatagaa aatctttctc ctgcttagtg atttcagaga gaggatct    48
<210>15
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
ctccatagaa aatctttctc ctgcccagtg atttcagaga gaggatct    48
<210>16
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
ctccatagaa aatctttctc ctgcgcagtg atttcagaga gaggatct    48
<210>17
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
ctccatagaa aatctttctc ctgatcagtg atttcagaga gaggatct    48
<210>18
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
tttgttgtcc agccaccatg atgtgcatca ttcatttgtt tcatg       45
<210>19
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
tttgttgtcc agccaccatg acgtgcatca ttcatttgtt tcatg       45
<210>20
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
tttgttgtcc agccaccatg aagtgcatca ttcatttgtt tcatg    45
<210>21
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
tttctcctgc tcagtgattt c                              21
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
ctcctgctca gtgatttcag                                20
<210>23
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
tttctcctgc tcagtgattt t                              21
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
ctcctgctca gtgattttag                                20
<210>25
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
atagaaaatc tttctcctgc tc                        22
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
tagaaaatct ttctcctgct c                        21
<210>27
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
atagaaaatc tttctcctgc tt                        22
<210>28
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
agaaaatctt tctcctgctt ag                        22
<210>29
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
atagaaaatc tttctcctgc c                        21
<210>30
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
agaaaatctt tctcctgccc a                        21
<210>31
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
atagaaaatc tttctcctgc g                        21
<210>32
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>32
agaaaatctt tctcctgcgc a                        21
<210>33
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
ccatagaaaa tctttctcct ga                        22
<210>34
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>34
atagaaaatc tttctcctga tc                        22
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
tgttgtccag ccaccatgat                        20
<210>36
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
ttgtccagcc accatgatgt                        20
<210>37
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>37
gttgtccagc caccatgac                        19
<210>38
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
tgtccagcca ccatgacgt                        19
<210>39
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>39
tgttgtccag ccaccatgaa                        20
<210>40
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>40
ttgtccagcc accatgaagt                                            20
<210>41
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>41
ctacacgaga tcctctctct gaaatcactg agcaggagaa aga                 43
<210>42
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>42
ctacacgaga tcctctctct aaaatcactg agcaggagaa aga                 43
<210>43
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<400>43
agatcctctc tctgaaatca ctgagcagga gaaagatttt ctatggag            48
<210>44
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<400>44
agatcctctc tctgaaatca ctaagcagga gaaagatttt ctatggag            48
<210>45
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<400>45
agatcctctc tctgaaatca ctgggcagga gaaagatttt ctatggag    48
<210>46
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<400>46
agatcctctc tctgaaatca ctgcgcagga gaaagatttt ctatggag    48
<210>47
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<400>47
agatcctctc tctgaaatca ctgatcagga gaaagatttt ctatggag    48
<210>48
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>48
catgaaacaa atgaatgatg cacatcatgg tggctggaca acaaa       45
<210>49
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>49
catgaaacaa atgaatgatg cacgtcatgg tggctggaca acaaa       45
<210>50
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>50
catgaaacaa atgaatgatg cacttcatgg tggctggaca acaaa    45
<210>51
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>51
tacacgagat cctctctctg                                20
<210>52
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>52
acacgagatc ctctctctga                                20
<210>53
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>53
tacacgagat cctctctcta                                20
<210>54
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>54
acacgagatc ctctctctaa                                20
<210>55
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>55
ctctctctga aatcactgag                        20
<210>56
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>56
cctctctctg aaatcactga g                      21
<210>57
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>57
atcctctctc tgaaatcact a                      21
<210>58
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>58
cctctctctg aaatcactaa g                      21
<210>59
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>59
cctctctctg aaatcactgg                        20
<210>60
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>60
tctctctgaa atcactgggc                        20
<210>61
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>61
cctctctctg aaatcactgc                        20
<210>62
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>62
tctctctgaa atcactgcgc                        20
<210>63
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>63
cctctctctg aaatcactga t                      21
<210>64
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>64
tctctctgaa atcactgatc a                      21
<210>65
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>65
atgaaacaaa tgaatgatgc aca                        23
<210>66
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>66
aaacaaatga atgatgcaca tc                         22
<210>67
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>67
tgaaacaaat gaatgatgca cg                         22
<210>68
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>68
aaacaaatga atgatgcacg tc                         22
<210>69
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>69
atgaaacaaa tgaatgatgc act                        23
<210>70
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>70
aaacaaatga atgatgcact tc                        22
<210>71
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>71
tgaaatgaat gaatgatgaa attg                      24
<210>72
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>72
atgatgtaat gaaaagattg tgta                      24
<210>73
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>73
atgaattggt atgtatatga atga                      24
<210>74
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>74
attgattgtg aatgaaatga attg                      24
<210>75
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>75
attgttgaaa agtgtaatga ttga                        24
<210>76
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>76
tgaaaaagtg tagattttga gtaa                        24
<210>77
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>77
gtagattagt ttgaagtgaa taat                        24
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gtttatagtg aaatatgaag atag                        24
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ttgagtaatt gaattgtgaa atga                        24
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tgtattgaat gaattgttga tgta                        24
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gacaatgaat taagggaaaa tgac                        24
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cattttagca cttacctgtg ac                          22
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attcgaaaga ccctagcctt ag                          22
<210>84
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>84
ccaatccatt tttgttgtcc ag                          22

Claims (8)

1.一种PIK3CA基因突变检测液相芯片，其特征是，主要包括有：(A)针对PIK3CA基因的突变位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物组成，所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10中的序列；所述特异性引物是：针对Exon 20 Codon1047野生型的SEQ IDNO.35或SEQ IDNO.36，以及突变型中的H1047R突变位点的SEQ IDNO.37或SEQ ID NO.38、和/或H1047L突变位点的SEQ ID NO.39或SEQ ID NO.40；或者，所述特异性引物是：针对Exon 20 Codon1047野生型的SEQ ID NO.65或SEQ ID NO.66，以及突变型中的H1047R突变位点的SEQ ID NO.67或SEQ ID NO.68、和/或H1047L突变位点的SEQ ID NO.69或SEQ ID NO.70；
(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQID NO.71～SEQ ID NO.80中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；
(C)用于扩增出具有Exon 20的相应突变位点的PIK3CA基因目标序列的扩增引物。
2.根据权利要求1所述的PIK3CA基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为：当特异性引物来源于SEQ ID NO.18～SEQ ID NO.20或其反向互补序列时，针对Exon 20的扩增引物为SEQ ID NO.83～SEQ ID NO.84。
3.根据权利要求1-2任一项所述的PIK3CA基因突变检测液相芯片，其特征是，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列。
4.根据权利要求3所述的PIK3CA基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5-10个T。
5.一种PIK3CA基因突变检测液相芯片，其特征是，主要包括有：
(A)针对PIK3CA基因的突变位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物组成，所述tag序列选自SEQID NO.1～SEQ ID NO.10中的序列；所述特异性引物是：针对Exon 20Codon1047野生型的SEQID NO.35或SEQ ID NO.36，以及突变型中的H1047R突变位点的SEQ IDNO.37或SEQ IDNO.38、和/或H1047L突变位点的SEQ ID NO.39或SEQ ID NO.40；以及选自针对Exon9Codon542野生型的SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.22，以及Codon542突变型E542K的SEQ IDNO.23或SEQ ID NO.24，和针对Exon9Codon545野生型的SEQ ID NO.25或SEQ ID NO.26，以及突变型中的E545K突变位点的SEQ ID NO.27或SEQ ID NO.28、E545G突变位点的SEQ IDNO.29或SEQ ID NO.30、E545A突变位点的SEQ ID NO.31或SEQ ID NO.32、和/或E545D突变位点的SEQ ID NO.33或SEQ ID NO.34中的一对以上；
或者所述特异性引物为：针对Exon 20Codon1047野生型的SEQ ID NO.65或SEQ ID NO.66，以及突变型中的H1047R突变位点的SEQ ID NO.67或SEQ IDNO.68、和/或H1047L突变位点的SEQ ID NO.69或SEQ ID NO.70，以及选自针对Exon 9 Codon542野生型的SEQ ID NO.51或SEQID NO.52，以及Codon542突变型E542K的SEQ ID NO.53或SEQ ID NO.54；和针对Exon9Codon545野生型的SEQ ID NO.55或SEQ ID NO.56，以及突变型中的E545K突变位点的SEQ IDNO.57或SEQ ID NO.58、E545G突变位点的SEQ ID NO.59或SEQ ID NO.60、E545A突变位点的SEQ ID NO.61或SEQ ID NO.62、和/或E545D突变位点的SEQ ID NO.63或SEQ ID NO.64中的至少一对；
(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.71～SEQ ID NO.80中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；
(C)用于扩增出具有Exon9和Exon20的相应突变位点的PIK3CA基因目标序列的扩增引物。
6.根据权利要求5所述的PIK3CA基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为：当特异性引物来源于SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.17或其反向互补序列时，针对Exon 9的扩增引物为SEQ ID NO.81～SEQ ID NO.82；当特异性引物来源于SEQ ID NO.18～SEQ ID NO.20或其反向互补序列时，针对Exon20的扩增引物为SEQ ID NO.83～SEQ ID NO.84。
7.根据权利要求5-6任一项所述的PIK3CA基因突变检测液相芯片，其特征是，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列。
8.根据权利要求7所述的PIK3CA基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5-10个T。
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