CN109486979A

CN109486979A - 用于鉴定西藏红豆杉的snp分子标记及应用

Info

Publication number: CN109486979A
Application number: CN201711398246.9A
Authority: CN
Inventors: 林源吉; 丁佳女; 郑宜文
Original assignee: Hangzhou Hundred Biological Ltd By Share Ltd
Current assignee: Hangzhou Hundred Biological Ltd By Share Ltd
Priority date: 2017-09-11
Filing date: 2017-12-22
Publication date: 2019-03-19
Also published as: CN109486982A; CN109486980A

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定西藏红豆杉的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于SEQ ID NO.1所示序列的第314位碱基，若第314位的碱基为A，则鉴定为西藏红豆杉。本发明基于SNP分子标记建立起了快速鉴定西藏红豆杉的体系。从而达到快速、准确检测西藏红豆杉的目的，对于口岸物种检验工作等具有重大的意义。

Description

用于鉴定西藏红豆杉的SNP分子标记及应用

技术领域

本发明涉及木材材种鉴定的分子生物学检测领域，具体地说，涉及用于西藏红豆杉的SNP分子标记及其应用。

背景技术

西藏红豆杉(拉丁学名Taxus wallichiana Zucc.)，又称喜马拉雅红豆杉，为红豆杉科红豆杉属植物。乔木或大灌木，一年生枝绿色。叶条形，质地较厚。雌雄异株，球花单生叶腋；雄球花圆球形，具多数螺旋状排列的雄蕊，具短梗；雌球花几无梗。种子当年成熟，坚果状，柱状长圆形，生于肉质、红色、杯状假种皮中。西藏特有树种，为国家Ⅰ级重点保护野生植物，分布于阿富汗、尼泊尔以及中国大陆的西藏等地。

西藏红豆杉是中国分布区最小，也是资源蕴藏量最小的种类，但资源基本未遭破坏。木材心边材区别明显，纹理均匀，结构细致，硬度大，韧性强，干后少挠裂。为优良的建筑、桥梁、家具、器具、车辆等用材。可作产区的造林树种。

其珍贵奇特的药用价值引起国内外专家的关注，它所含的紫杉醇对癌症有良好的疗效，对糖尿病、冠心病等有一定的疗效，应用开发前景可观。

形态学鉴定是西藏红豆杉鉴定中常采用的方法，但形状特征易受生境、气候、生理状况等的影响而常常导致主观辨别上的偏差，仅靠形态差异难以准确鉴定。

近年来，利用分子生物学技术进行物种鉴定已经在一些珍惜物种及检验检疫方面得到了应用，如何利用分子生物学技术建立高效、快速、灵敏且准确度高的鉴定方法将是西藏红豆杉鉴定领域的关键技术之一。

发明内容

本发明提供一种用于鉴定西藏红豆杉的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于SEQID NO.1所示序列的第314位碱基，若第314碱基为A，则鉴定为西藏红豆杉。

所述SNP分子标记在西藏红豆杉鉴定中的应用。

所述的应用具体的包括从南方红豆杉、曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉和云南红豆杉中鉴定出西藏红豆杉。

本发明提供了一种用于鉴定西藏红豆杉的核苷酸序列，包括SEQ ID NO.1，或者SEQ ID NO.1所对应的cDNA或mRNA，所述SEQ ID NO.1所示序列的第 314位碱基为A。

本发明提供了一种鉴定西藏红豆杉的试剂盒，包括用于特异性检测SEQ ID NO.1序列第314位的碱基为A存在与否的一种或多种引物，或引物和探针的组合。所述引物和探针选自：

用于测序鉴定的特异性扩增引物F1、R1和测序引物，引物序列分别为

上游引物F1：5'-GCGGTAGGATCATTGTCG-3'

下游引物R1：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'

测序引物：5'-GCGGTAGGATCATTGTCG-3'

或者，用于荧光定量PCR检测的扩增特异性引物和探针，引物和探针序列分别为：

上游引物F2：5'-TGGGTGCACCAGCGACTC-3'

下游引物R2：5'-CTGCTTTGCAGACCGGCA-3'

探针P2：5'-TCGAAGGGTCCCAGAAATTTCCACCT-3'；

或者，用于ARMS-PCR检测的特异性扩增引物，引物序列为：

上游引物F3：5'-CGGTCGAAGGGTCCCTGA-3'

下游引物R3：5'-GCCCGGCGACACTTCA-3'

进一步的，所述试剂盒用于从南方红豆杉、曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉和云南红豆杉中鉴定出东北红豆杉。

进一步的，还包括阳性质控品和阴性质控品。

本发明提供了一种制备鉴定西藏红豆杉试剂盒的方法，包括制备检测反应试剂的步骤，其特征在于，所述反应试剂包含用于特异性检测SEQ ID NO.1序列第314位的碱基为A存在与否的一种或多种引物，或引物和探针的组合。

本发明还提供了用于鉴定西藏红豆杉的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸用于特异性检测SEQ ID NO.1序列第314位的碱基为A存在与否，所述寡核苷酸选自用于测序的特异性扩增引物序列和测序引物序列，分别为

上游引物F1：5'-GCGGTAGGATCATTGTCG-3'

下游引物R1：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'

测序引物：5'-GCGGTAGGATCATTGTCG-3'

或者，用于荧光定量PCR扩增特异性上游引物F2序列、下游引物R2序列和探针P2序列，分别为：

上游引物F2：5'-TGGGTGCACCAGCGACTC-3'

下游引物R2：5'-CTGCTTTGCAGACCGGCA-3'

探针P2：5'-TCGAAGGGTCCCAGAAATTTCCACCT-3'；

或者，用于ARMS-PCR扩增的特异性上游引物F3序列和下游引物R3序列分别为：

上游引物F3：5'-CGGTCGAAGGGTCCCTGA-3'

下游引物R3：5'-GCCCGGCGACACTTCA-3'。

进一步的，探针P2的5'端的荧光基团选自FAM、T HEX或TET，3'端的淬灭基团选自BHQ1或TAMRA。

本发明提供了一种鉴定西藏红豆杉的方法，包括以下步骤：

提取待测植物的基因组DNA；

以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，检测SEQ ID NO.1 序列第314位的碱基为A存在与否；

若经检测，SNP位点为A时，则判断该待测植物鉴定为西藏红豆杉。

进一步的，PCR扩增所需的引物或探针选自上游引物F1、下游引物R1和测序引；或者，上游引物F2序列、下游引物R2序列和探针P2序列；或者，上游引物F3和下游引物R3。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：本发明在对红豆杉大量基因信息进行分析比较的基础上，并根据序列位点多态性，设计西藏红豆杉种属特异引物和探针，建立了西藏红豆杉特异性的荧光定量PCR鉴定检测方法。本发明并不需要木材有完整的形态结构，只需从木料上取极少量木材样本，即可满足检测要求，操作简单。并且通过西藏红豆杉SNP分子标记做出判断，鉴定过程客观、准确。克服了传统鉴定方法主要依赖于形态鉴定方法，并必须建立在木材有完整易辨识的形态结构的基础上的技术局限性。本发明采用ARMS技术利用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大，与此同时，利用探针对扩增产物进行检测，在实时荧光定量PCR平台上实现对西藏红豆杉检测的高特异性和高灵敏度。

附图说明

图1本发明利用荧光定量PCR法检测阳性质控品(西藏红豆杉叶片基因组 DNA)的结果。

图2本发明利用荧光定量PCR法鉴定西藏红豆杉的结果。

图3本发明利用荧光定量PCR法鉴定南方红豆杉的结果。

图4本发明利用荧光定量PCR法鉴定曼地亚红豆杉的结果。

图5本发明利用荧光定量PCR法鉴定欧洲红豆杉的结果。

图6本发明利用荧光定量PCR法鉴定云南红豆杉的结果。

图7本发明利用荧光定量PCR法鉴定东北红豆杉的结果。

图8测序法鉴定西藏红豆杉的结果。

图9测序法鉴定南方红豆杉的结果。

图10测序法鉴定曼地亚红豆杉的结果。

图11测序法鉴定欧洲红豆杉的结果。

图12测序法鉴定云南红豆杉的结果。

图13测序法鉴定东北红豆杉的结果。

图14电泳结果：1泳道为质控品，2泳道为西藏红豆杉；3泳道为云南红豆杉；4泳道为曼地亚红豆杉，5泳道为欧洲红豆杉；6泳道为云南红豆杉；7 泳道为东北红豆杉；8泳道为100bp ladder maker。

图15六种不同品种红豆杉的序列对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但并不因此将本发明限制在所述的具体实施例中。实施例中未说明的条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，Sambrook等分子克隆实验手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件。

实施例1西藏红豆杉SNP分子标记的获得

1、根据NCBI数据库公开的ITS基因，设计相应的引物进行PCR扩增，采用上游引物F1：5'-GCGGTAGGATCATTGTCG-3'(SEQ ID NO.2)，下游引物R1： 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(SEQ ID NO.3)，和如下的PCR反应体系和PCR 反应程序，以经鉴定的南方红豆杉(Taxusmairei SY Hu)、曼地亚红豆杉(Taxus madia)、欧洲红豆杉(Taxus baccata)、西藏红豆杉(Taxus wallichiana Zucc.)、东北红豆杉(Taxus cuspidata S.et Z.)和云南红豆杉(Taxus yunnanensis Cheng et L.K.F)6个红豆杉属物种基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并在紫外凝胶成像系统观察合格后进行测序。

其中，Vazyme AceTaq DNA酶(货号p401-d1 250U)。

按传统方法提取植物基因组DNA，也可采用商品化DNA提取试剂盒进行 DNA提取。例如，所述红豆杉属物种基因组DNA的提取采用杭州百迈生物股份有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒(Koing^TM通用型基因组提取试剂盒，货号F1612)，参照试剂盒说明进行操作，将提取的DNA置于-20℃下保存备用。

2、序列比对及物种特异的分子标记的开发

将步骤1获得的6个红豆杉属物种的ITS基因序列，通过DNAMAN软件进行序列比对寻找合适的SNP位点。序列比对结果如图15所示，经分析发现位于南西藏红豆杉ITS基因内的序列第314位上的碱基为A，而其它红豆杉属物种相应位置处的碱基为C。即SEQ ID NO.1序列的第314位上的碱基为A是西藏红豆杉的SNP位点(SEQ ID NO.1序列中方框所示位置)，SEQ ID NO.1的基因序列如下：

实施例2西藏红豆杉SNP分子标记在荧光PCR扩增法鉴定西藏红豆杉中的应用

本实施例是在获得西藏红豆杉SNP位点的基础上，针对包含所述SNP位点的基因序列，利用PrimerPremier5.0分别设计出特异性上游引物F2、下游引物 R2和探针P2，引物和探针由苏州金唯智生物科技有限公司合成。利用所述特异性引物和探针对南方红豆杉、曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉和云南红豆杉进行荧光PCR扩增检测。具体的，所述上游引物F2序列、下游引物R2序列和探针P2序列分别是：

上游引物F2：5'-TGGGTGCACCAGCGACTC-3'(SEQ ID NO.4)

下游引物R2：5'-CTGCTTTGCAGACCGGCA-3'(SEQ ID NO.5)

探针序列P2：5'-TCGAAGGGTCCCAGAAATTTCCACCT-3(SEQ ID NO.6)

探针5'端的荧光基团选自FAM、T HEX、TET等，3'端的淬灭基团选自： BHQ1、TAMRA等。

例如探针为5'-FAM-TCGAAGGGTCCCAGAAATTTCCACCT-BHQ1-3'。

以6个红豆杉属物种基因组DNA为模板，20μLPCR反应体系中包括：

PCR扩增程序：

包括以下步骤：1)提取待测植物的基因组DNA；2)以待测植物的基因组 DNA为模板，利用引物和探针，PCR扩增西藏红豆杉ITS基因；同时设置阳性和阴性对照组，所述阳性和阴性对照组分别以含有和不含有提取的西藏红豆杉叶片基因组DNA为模板进行扩增；3)采用荧光PCR法检测PCR扩增产物，若扩增曲线有标准的S型曲线，且Ct≤36，则待测植物为西藏红豆杉物种。

本实施例2采用的南方红豆杉、曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉和云南红豆杉样品也是经现有方法鉴定不同与实施例1的另一组样品，按本发明所述方法对样品进行荧光PCR法检测，检测结果下图1至7所示，其中图1为阳性质控品的扩增结果；其余样本中，仅西藏红豆杉出现S型曲线(如图2所示)，且Ct≤36,而其他红豆杉类没有出现S型曲线(如图3至7所示)，这表明本发明针对西藏红豆杉ITS基因SNP位点具有极高的特异性，因此可以用于快速鉴定西藏红豆杉。

利用实施例1所述引物和测序方法，对本实施例2中的南方红豆杉、曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉和云南红豆杉样品进行鉴定，鉴定结果见图8至13。测序结果为只有南方红豆杉相应于SEQ ID NO.1序列第314 位上的碱基为A，而其它红豆杉属物种为C。

实施例3西藏红豆杉SNP分子标记在arms-PCR法鉴定西藏红豆杉中的应用

本实施例是在获得西藏红豆杉SNP位点的基础上，针对包含所述SNP位点的基因序列，利用PrimerPremier5.0分别设计出特异性上游引物F3、下游引物 R3，引物和探针由苏州金唯智生物科技有限公司合成。利用所述特异性引物和探针对南方红豆杉、曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉和云南红豆杉样品进行荧光PCR扩增检测。具体的，所述上游引物F3、下游引物 R3的序列分别是：

上游引物F3：5'-CGGTCGAAGGGTCCCTGA-3'(SEQ ID NO.7)

下游引物R3：5'-GCCCGGCGACACTTCA-3'(SEQ ID NO.8)

Arms-PCR反应程序：

包括以下步骤：1)提取待测植物的基因组DNA；2)以待测植物的基因组 DNA为模板，利用引物和探针，arms-PCR扩增红豆杉ITS基因；3)采用电泳法检测PCR扩增产物，西藏红豆杉的电泳有明显的条带，而其他红豆杉则无扩增条带。

本实施例2采用的南方红豆杉、曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉和云南红豆杉也是经现有方法鉴定不同与实施例1的另一组样品，检测结果如图14所示，西藏红豆杉的扩增结果为有显著扩增条带；其他红豆杉的扩增结果为无扩增条带。这表明本发明的针对西藏红豆杉ITS基因SNP位点具有极高的特异性，因此可以用于快速鉴定西藏红豆杉。

实施例2和3的鉴定结果汇总表见下表：

本申请所述实施例中所列反应体系，反应程序和检测步骤等只是一种具体的实施方式，本领域技术人员还可以根据实际需要对反应体系，反应程序等作出适应性的调整。

序列表

<110> 杭州百迈生物股份有限公司

<120> 用于鉴定西藏红豆杉的SNP分子标记及应用

<130> 201707

<150> 2017108141463

<151> 2017-09-11

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1076

<212> DNA

<213> 西藏红豆杉(Taxus wallichiana Zucc.)

<400> 1

tacgttcaga gatgggcgtg ttcggcacgt ccggcgcgtc tcctccccgt cccccgctct 60

tgcgggagtt tggactggag ttccggatgc ttttcccttt gcaatgcctc gggggtcccc 120

tccgctggct ttctctcggg tgggcgttcg ggtcttcgca agttgttctc ctgcggttcg 180

ggttattaca agggcgagtg ccagtgtcgt ctacagtgtg gctatgcgag gggctcgttt 240

ttcggctgca gtgggtgcac cagcgactct gttcgtctgg cagtcctgct cctttgcggt 300

cgaagggtcc cagaaatttc cacctgctag gcggttcctt gcaaacgccc gtggctgctt 360

tgcagaccgt tgaacatttg ccggtctgca aagcagctgc aaccccctga agtgtcgccg 420

ggcaggtaat gccgtacaga ttatttcgtg cctttggacg ggtgcacctg cgtacgtcgc 480

cgggcgggcc gaccgtccac tggttccgtt cccatctgtt cggtctccgg cctttcgaca 540

ctccggggcg gggacaccct ttctccgatt ttcccccacg gggcatcgcc tctggttgca 600

ggggggcgtc gagtggaggt gcgtgtcata acactcaacg catcggtgcg gattgcacca 660

aggatctgat aaatagctgt gcgggctgcg cgccatgcgc gcgtcggact cacggcgcca 720

attaaacacg actctcggca acggatatct cggctctcgc cacgatgaag aatgtagcga 780

aatgcgatac ttagtgtgaa ttgcagaatc ccgtgaatca tcgagtcttt gaacgcaagt 840

tgcgcccgag gcctcggccg agggcacgtc tgcttgggcg tcgcactcta aaatcgactt 900

cccccgttcc tcggcgggag gatcggagat ggctgtccgt gcccaccagc ggcgcggtcg 960

gctaaatggg cacgagattt gtggccgatg tcacgatgaa cggtggccaa tgttggtcgg 1020

cgttggattg tggcccaagg tcccggattt gtgcggaact ttactcgttg ttattc 1076

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcggtaggat cattgtcg 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgggtgcacc agcgactc 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctgctttgca gaccggca 18

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcgaagggtc ccagaaattt ccacct 26

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cggtcgaagg gtccctga 18

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcccggcgac acttca 16

Claims

1.用于鉴定西藏红豆杉的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记位于SEQ IDNO.1所示序列的第314位碱基，若第314碱基为A，则鉴定为西藏红豆杉。

2.权利要求1所述SNP分子标记在西藏红豆杉鉴定中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，从南方红豆杉、曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉和云南红豆杉中鉴定出西藏红豆杉。

4.用于鉴定西藏红豆杉的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列包括SEQID NO.1，或者SEQ ID NO.1所对应的cDNA或mRNA，所述SEQ ID NO.1所示序列的第314位碱基为A。

5.一种鉴定西藏红豆杉的试剂盒，其特征在于，包括用于特异性检测SEQ IDNO.1序列第314位的碱基为A存在与否的一种或多种引物，或引物和探针的组合。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述引物和探针选自：用于测序鉴定的特异性扩增引物F1、R1和测序引物，引物序列分别为

上游引物F1：5'-GCGGTAGGATCATTGTCG-3'

下游引物R1：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'

测序引物：5'-GCGGTAGGATCATTGTCG-3'

上游引物F2：5'-TGGGTGCACCAGCGACTC-3'

下游引物R2：5'-CTGCTTTGCAGACCGGCA-3'

探针P2：5'-TCGAAGGGTCCCAGAAATTTCCACCT-3'；

或者，用于ARMS-PCR检测的特异性扩增引物，引物序列为：

上游引物F3：5'-CGGTCGAAGGGTCCCTGA-3'

下游引物R3：5'-GCCCGGCGACACTTCA-3' 。

7.根据权利要求5至6之一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于从南方红豆杉、曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉和云南红豆杉中鉴定出东北红豆杉。

8.一种制备鉴定西藏红豆杉试剂盒的方法，包括制备检测反应试剂的步骤，其特征在于，所述反应试剂包含用于特异性检测SEQ ID NO.1序列第314位的碱基为A存在与否的一种或多种引物，或引物和探针的组合。

9.用于鉴定西藏红豆杉的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸用于特异性检测SEQID NO.1序列第314位的碱基为A存在与否，所述寡核苷酸选自用于测序的特异性扩增引物序列和测序引物序列，分别为

上游引物F1：5'-GCGGTAGGATCATTGTCG-3'

下游引物R1：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'

测序引物：5'-GCGGTAGGATCATTGTCG-3'

上游引物F2：5'-TGGGTGCACCAGCGACTC-3'

下游引物R2：5'-CTGCTTTGCAGACCGGCA-3'

探针P2：5'-TCGAAGGGTCCCAGAAATTTCCACCT-3'；

上游引物F3：5'-CGGTCGAAGGGTCCCTGA-3'

下游引物R3：5'-GCCCGGCGACACTTCA-3'。

10.一种鉴定西藏红豆杉的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测植物的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，检测SEQ ID NO.1序列第314位的碱基为A存在与否；

(3)若经检测，SNP位点为A时，则判断该待测植物鉴定为西藏红豆杉。