CN105506103A - 线粒体基因组扩增的通用引物混合物及其设计和扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例公开了一种用于动物线粒体基因组扩增的通用引物混合物及其设计和扩增方法，以及包含所述通用引物混合物的试剂盒。利用本发明的提供引物混合物或试剂盒和提供的动物线粒体基因组扩增方法，结合新兴的高通量测序技术，可以高效低成本地获得动物线粒体基因组信息。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种用于动物线粒体基因组扩增的通用引物混合物及其设计和扩增方法，以及包含所述通用引物混合物的试剂盒。
背景技术
线粒体是细胞内半自主性细胞器，来自于母系遗传并具有自身的一套基因组，其基因稳定、排列保守几乎不发生重组，易于扩增和测序已成为研究动物进化的重要分子标记，被广泛用于种群遗传结构、杂交、基因漂流生物及系统发育等方面的研究。
大多数动物线粒体基因组的结构为闭合环状双链DNA(某些低等刺胞动物线粒体基因组的结构为线性)，包含了从分子序列到基因结构的全面信息，长度一般在14-20kb之间。在进行动物线粒体基因组研究时，目前主要的测序策略，包括基于物理分离线粒体DNA的克隆文库测序、基于传统PCR扩增产物直接测序的方法，以及新兴的高通量线粒体基因组测序技术，后者又包括基于传统PCR预扩增线粒体DNA的高通量方法、鸟枪式高通量测序方法以及从转录组数据中获得线粒体基因组序列的方法(ZardoyaandSuárez2007,沙淼,林立亮etal.2013,Cameron2014)。
然而，克隆文库测序方法成本高而速度慢，基于传统的PCR方法，则受限于引物通用性与扩增效率的平衡，常需针对特定类群设计特异引物，或需根据已测出片段重新设计引物扩增未知区域，大大拖慢了项目进展速度。鸟枪式高通量测序方法也存在着诸多问题，如易混入基因组DNA来源的线粒体假基因，以及因读长片段短而含重复片段的控制区难以拼接完整等。且所需测序通量大，生物信息拼接过程相对复杂。从转录组数据中获得线粒体基因组序列的方法，成本较高且需结合传统PCR方法以获得完整线粒体基因组。而由于多数无脊椎动物身体微小，测定线粒体基因组原则上只能采用一个个体的总DNA，物理、化学分离方法(如差速离心，密度梯度离心、碱变性法)所得的富集线粒体DNA，其总量也不足以完成高通量测序所需的建库工作。
发明内容
为了解决上述问题，本发明实施例公开了一种用于动物线粒体基因组扩增的通用引物混合物及其设计和扩增方法，以及包含所述通用引物混合物的试剂盒。利用本发明的提供引物混合物或试剂盒和提供的动物线粒体基因组扩增方法，结合新兴的高通量测序技术，可以高效低成本地获得动物线粒体基因组信息。
本发明提供一种用于扩增动物线粒体基因组的通用引物混合物，其包含具有以下序列的通用引物或其化学修饰衍生物：
SEQIDNO.1：5’-CCATTTCAYTGATGRTTYCC-3’；
SEQIDNO.2：5’-GGTAAAAATCCTADAAAWGGNGG-3’；
SEQIDNO.3：5’-TGATTCTTTGGWCAYCCAGAAGT-3’；
SEQIDNO.4：5’-GGTAATCAGARTATCGWCGNGG-3’；
SEQIDNO.5：5’-ACWATTGGWCAYCAATGATAYTG-3’；
SEQIDNO.6：5’-CCACARATTTCTGARCATTG-3’；
SEQIDNO.7：5’-GTTGATCAAAGHCCWTGRCC-3’；
SEQIDNO.8：5’-TCWACAAARTGTCARTAYCA-3’；
SEQIDNO.9：5’-TTAAATCCTTWGARTAAAAYCC-3’；
SEQIDNO.10：5’-TTAGGTTGRGATGGNYTAGG-3’；
SEQIDNO.11：5’-CCHGAAGAACATAANCCRTG-3’；
SEQIDNO.12：5’-TGAGGATATCAACCNGARCG-3’；
SEQIDNO.13：5’-TAGAACAYRATGAAAYTTTGGWTC-3’；
SEQIDNO.14：5’-TTCTACTGGTCGWGCTCCAATYCA-3’；
SEQIDNO.15：5’-CCGGTYTGAACTCARATCATGTAA-3’；
SEQIDNO.16：5’-ATTTATTGTACCTTKTGTATCAG-3’；
SEQIDNO.17：5’-GTACAMCYACTRTGTTACGACTT-3’和
SEQIDNO.18：5’-GTGCCAGCADYYGCGGTTANAC-3’，
其中所述动物为除刺胞动物以外的具有环状线粒体基因组的无脊椎动物，以及蛙、蛇或鼠。
在一个具体的实施方案中，所述通用引物3’端的两个碱基进行硫代修饰。
在另一个具体的实施方案中，所述动物线粒体基因组可以来自以下动物：家衣鱼、广斧螳螂、勇斧螳螂、丽拟丝蟌、樱桃蟑螂、马达加斯加蟑螂、金边地鳖、杜比亚蟑螂、中华真地鳖、麻皮蝽、细纹小家蚁、琵琶甲、椰心叶甲、竹虫、黄粉虫、洋虫、康瘿蚊、椰子织蛾、球鼠妇、雷达蝎、毛蚶、泥蚶、青蛤、兰蛤、通俗腔蚓、菲牛蛭、雨蛙、大泛树蛙、中国林蛙、乌梢蛇或小鼠。
本发明还提供了所述通用引物的设计方法，其特征在于，登录NCBI网站中的GenBank数据库搜索已测定的编号为U37541.1、NC_002084.1、NC_002355.1、KP163643.1、NC_003081.2、NC_001712.1、NC_002609.1、NC_002651.1、NC_004371.1、NC_006895.1、NC_005437.1、NC_006515.2、AJ270997.1、AB018440、X54252.1、NC_011581.1、KF897830、NC_002184.1、NC_013188.1、KF750628、NC_023925.1、NC_023836.1和NC_006665的部分无脊椎动物线粒体基因组序列，进行多序列对位比对分析，找到保守序列，将搜寻到的保守序列载入引物设计软件，设计出所述用于动物线粒体基因组扩增的通用引物。
本发明还提供一种利用所述的通用引物混合物进行动物线粒体基因组扩增的方法，其特征在于，扩增体系包括样品体系和反应体系，
其中每5μl样品体系包含：
每15μl反应体系包含：
扩增条件为：
在一个具体的实施方案中，其中每5μl样品体系包含：
每15μl反应体系包含：
扩增条件为：
在另一个具体的实施方案中，所述退火缓冲液是pH为7.6，Tris-HCl终浓度为80mMMgCl2终浓度为20mM的混合溶液。
本发明还提供了一种用于扩增动物线粒体基因组的试剂盒，其包含所述的通用引物混合物，其中所述动物为除刺胞动物以外的具有环状线粒体基因组的无脊椎动物，以及蛙、蛇或鼠。
其中所述试剂盒还可以包括退火缓冲液、双蒸水、Phi29酶、焦磷酸酶、dNTP、Phi29缓冲液，及操作说明书。
本发明提供的动物线粒体DNA通用引物混合物，结合Phi29酶滚环扩增方法，可以高效特异性地富集多种动物线粒体基因组，将线粒体DNA占总基因组DNA的质量比例从约1％提升至80％左右，结合后续高通量测序方法可获得线粒体基因组完整序列。可有效排除核基因组来源的假基因对拼接的污染，而富集扩增产物一般在10K以上，可结合长读长的三代测序技术(PacBioRSII等)，跨越高重复性的线粒体控制区。且由于无脊椎动物线粒体基因组较小(通常小于20Kb)，经本技术处理后，很小的测序通量即可实现线粒体基因组的深度覆盖，拼接计算复杂度低，计算机时成本大幅下降。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为应用本方法富集扩增线粒体DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
其中M：DNA分子量标准(λ-EcoT14Idigest，Takara)，1-12：依次为：家衣鱼、广斧螳螂、丽拟丝蟌、金边地鳖、麻皮蝽、椰心叶甲、椰子织蛾、雷达蝎、青蛤、通俗腔蚓、雨蛙、乌梢蛇。13号为负对照。
图2为杜比亚蟑螂Blapticadubia的线粒体基因组结构示意图；
图3为金边地鳖Opisthoplatiaorientalis的线粒体基因组结构示意图；
图4为台湾宽斧螳螂Hierodulaformosana的线粒体基因组结构示意图；
图5为麻皮蝽Erthesinafullo的线粒体基因组结构示意图；
图6为椰子织蛾Opisinaarenosella的线粒体基因组结构示意图；
图7为康瘿蚊Contariniamaculipennis的线粒体基因组结构示意图；
图8为黄粉虫Tenebriomolitor的线粒体基因组结构示意图；
图9为雷达蝎Typopeltiscrucifer的线粒体基因组结构示意图；
图10为金头蜈蚣Scolopendrasubspinipes的线粒体基因组结构示意图；
图11为通俗腔蚓Metaphirevulgaris的线粒体基因组结构示意图；
图12为泥蚶Tegillarcagranosa的线粒体基因组结构示意图；
图13为青蛤Cyclinasinensis的线粒体基因组结构示意图；
图14为雨蛙Hylatsinlingensis的线粒体基因组结构示意图；
图15为大泛树蛙Rhacophorusdennysi的线粒体基因组结构示意图；
图16为乌梢蛇Ptyasdhumnades的线粒体基因组结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的技术方案公开了一种用于扩增动物线粒体基因组的通用引物混合物。
本发明的技术方案还公开了所述通用引物的设计方法，具体为：登录NCBI网站中的GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库搜索已测定的编号为U37541.1、NC_002084.1、NC_002355.1、KP163643.1、NC_003081.2、NC_001712.1、NC_002609.1、NC_002651.1、NC_004371.1、NC_006895.1、NC_005437.1、NC_006515.2、AJ270997.1、AB018440、X54252.1、NC_011581.1、KF897830、NC_002184.1、NC_013188.1、KF750628、NC_023925.1、NC_023836.1和NC_006665的部分无脊椎动物线粒体基因组序列(如表1所示)，将其载入BioEdit软件，利用ClustalW算法进行多序列对位比对分析，找到保守序列，将搜寻到的保守序列载入Oligo软件，手动调试设计出用于动物线粒体基因组扩增的通用引物。获得设计引物后可利用PremierPrimer软件考察引物间形成同源或异源二聚体的可能性并排除形成同源或异源二聚体的可能性大的那些。
表1部分无脊椎动物线粒体基因组
利用本发明的引物结合Phi29DNA聚合酶扩增方法，可将线粒体DNA占总基因组DNA的比例从约为1％提升至80％左右，结合后续高通量测序方法可获得线粒体基因组完整序列。体现出该扩增方法的适用范围广，可为获取正确的动物线粒体基因组序列以进行种类鉴定、种质资源调查以及物种多样性研究提供一个有力保障。并且，Phi29DNA聚合酶能够高效合成DNA，每一次结合到DNA链上可以引导至多70,000碱基的掺入。该酶还具有3’-5’核酸外切酶高保真纠错功能，错误率仅为5×10-6，大约比TaqDNA聚合酶低100倍。这一恒温扩增方法可以从纳克量级起始DNA模板得到微克量级DNA产物。
需要说明的是，单位mM表示为mmol/L；μM表示为μmol/L。引物是由生物公司合成成品，为了减少Phi29DNA聚合酶对引物3’端进行3’-5’外切酶活性切割，引物3’端的两个碱基可以进行硫代修饰(如表2所示)。
表2通用引物列表
需要进一步说明的是，在进行DNA扩增前，优选对使用的设备和试剂，如微量移液器，PCR管，双蒸水等进行灭菌。灭菌可选用紫外灭菌30分钟左右或高压湿热灭菌20分钟左右，具体的灭菌方式，本领域技术人员可根据实际经验自行把握，本发明在此不作赘述。本发明所述的孵育可以为恒温水浴也可以在PCR仪上保温，此为本领域常用的技术手段，本发明不作具体限定。本发明的技术方案对水的要求很高，通常纯水是指水电阻率为18.2MΩ*cm的水，一般双蒸水(ddH2O)即可达到此标准。
需要说明的是，本发明所使用的Phi29DNA聚合酶、10×Phi29DNA聚合酶buffer、焦磷酸酶和dNTP皆市售可得，本领域技术人员可根据产品的使用说明书配制和使用。本发明所说的动物总DNA和通用引物混合物可为将动物总DNA或通用引物混合物溶解在双蒸水或1×TE缓冲液(10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH＝8.0)中。
由于除少数刺胞动物以外的绝大部分无脊椎动物的线粒体基因组皆为闭合环状双链DNA，并且其线粒体基因组的脱氧核苷酸数量一般在14～20kb之间，因此，本发明的技术方案更适用于除部分刺胞动物以外的大多数无脊椎动物线粒体基因组扩增。
需要说明的是，本发明所说的无脊椎动物是指背侧没有脊柱的动物，所说的刺胞动物，也叫腔肠动物，属于刺胞动物门或腔肠动物门，包括珊瑚、水螅、海蜇(jellyfish)、僧帽水母(Portugueseman-of-war)和海葵(seaanemone)等。
本发明技术方案中，动物线粒体基因组扩增方法优选适用的实施例动物为杜比亚蟑螂Blapticadubia(蜚蠊目，昆虫纲，无脊椎动物)、金边地鳖Opisthoplatiaorientalis(蜚蠊目，昆虫纲，无脊椎动物)、台湾宽斧螳螂Hierodulaformosana(螳螂目，昆虫纲，无脊椎动物)、麻皮蝽Erthesinafullo(半翅目，昆虫纲，无脊椎动物)、椰子织蛾Opisinaarenosella(鳞翅目，昆虫纲，无脊椎动物)、康瘿蚊Contariniamaculipennis(双翅目，昆虫纲，无脊椎动物)、黄粉虫Tenebriomolitor(鞘翅目，昆虫纲，无脊椎动物)、雷达蝎Typopeltiscrucifer(蝎目，蛛形纲，无脊椎动物)、金头蜈蚣Scolopendrasubspinipes(蜈蚣目，唇足纲，无脊椎动物)、通俗腔蚓Metaphirevulgaris(寡毛纲，环节动物，无脊椎动物)、泥蚶Tegillarcagranosa(列齿目，双壳纲，软体动物，无脊椎动物)、青蛤Cyclinasinensis(帘蛤目，双壳纲，软体动物，无脊椎动物)、雨蛙Hylatsinlingensis(无尾目，两栖纲，脊椎动物)、大泛树蛙Rhacophorusdennysi(无尾目，两栖纲，脊椎动物)、乌梢蛇Ptyasdhumnades(蛇亚目，爬行纲，脊椎动物)等。
本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。
实施例所用到的试剂均市售可得。
实施例1通用引物的设计
登录NCBI网站中的GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库搜索已测定的部分无脊椎动物线粒体基因组的ND2、COI、COII、COIII、ND5、ND4、cytB、16S和12S基因序列，将序列载入BioEdit软件，利用ClustalW算法进行多序列对位比对分析，找到保守序列，将搜寻到的保守序列载入Oligo6软件，手动调试设计出所述无脊椎动物线粒体基因组扩增引物(参见表2)。获得设计引物后可利用PremierPrimer5.0软件考察引物间形成同源或异源二聚体的可能性并排除形成同源或异源二聚体的可能性大的那些。引物3’端两个碱基为硫代修饰，以防止Phi29DNA聚合酶对引物3’端进行3’-5’外切酶活性切割。
由苏州金唯智公司根据发明人的要求合成具有表2所示核苷酸序列的通用引物，纯化方式为HPLC。
实施例2酚氯仿法抽提动物总DNA
取剪碎的新鲜动物组织100mg(如为微小动物，则保留必要残体后全部使用)，经液氮研磨后，使用100μL的TE缓冲液(10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH＝8.0)重悬，加入5μL10％SDS，0.8μL25mg/mlRnaseA，1μL10mg/mlProK后，50℃孵育60分钟。后加入55μL苯酚，55μL氯仿：异戊醇(24：1)，混匀后12000g离心6分钟，保留上清。再加入100μL氯仿：异戊醇(24：1)，混匀后12000g离心6分钟，保留上清。以上溶液，加入270μL无水乙醇，-80℃保存20分钟后，12000g离心20分钟，保留沉淀。加入预冷的500μL70％乙醇，-80℃保存10分钟后，12000g离心20分钟，保留沉淀。50℃温育沉淀2分钟，使乙醇挥发干净后，使用30μLTE缓冲液重悬，得到总DNA提取液。
本实施例新鲜动物组织分别来源于家衣鱼、广斧螳螂、勇斧螳螂、丽拟丝蟌、樱桃蟑螂、马达加斯加蟑螂、金边地鳖、杜比亚蟑螂、中华真地鳖、麻皮蝽、细纹小家蚁、琵琶甲、椰心叶甲、竹虫、黄粉虫、洋虫、康瘿蚊、椰子织蛾、球鼠妇、雷达蝎、毛蚶、泥蚶、青蛤、兰蛤、通俗腔蚓、菲牛蛭、雨蛙、大泛树蛙、中国林蛙、乌梢蛇、小鼠。
实施例3线粒体基因组的扩增
分别精密量取1μL应用实施例2的方法得到的动物总DNA(10-100ng)，加入4μL样品缓冲液，94℃加热3分钟，后缓慢冷却至室温。此后加入14μL反应缓冲液，0.5μLPhi29DNA聚合酶(储液浓度为10U/μL)，0.5μL焦磷酸酶(Pyrophosphatase)(储液浓度为0.04U/μL)，30℃下孵育12至18小时，然后65℃孵育10分钟使反应终止。获得富集的12种动物线粒体基因组。其中，样品缓冲液的组成：50μL引物混合物(0.5μL的100μM引物，共18条引物，以及41μL的ddH2O)，125μL的2×退火缓冲液(80mMTris-HClpH7.6，20mMMgCl2)，以及25μL的ddH2O，共计200μL，每离心管分装50μL并于-20℃保存。反应缓冲液的组成：100μL的Phi2910×buffer，加入40μL的10mMdNTPs，560μL的ddH2O，共计700μL，每离心管分装100μL并于-20℃保存。图1为应用本实施例方法获得的12种动物的含有富集的线粒体基因组的总DNA的琼脂糖凝胶电泳图。
将应用实施例3的方法得到的含有富集的线粒体基因组的总DNA应用于二代测序(IonTorrentPGM，318chip)及三代测序(PacBioRSII，1SMRTcell)，从可匹配到线粒体基因组的有效reads比例来看，本发明可将线粒体DNA占总基因组DNA的质量比例从约1％提升至80％左右。再将测序结果进行拼接，其中所获得的15种动物的线粒体基因组的结构示意图详见图2-16。表3列出了15种线粒体基因组对应的序列编号。
表3
以上对本发明所提供的用于动物线粒体基因组扩增的通用引物混合物及其设计和扩增方法进行了详细介绍。本文中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其中心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护。
Claims (10)
1.一种用于扩增动物线粒体基因组的通用引物混合物，其包含具有以下序列的通用引物或其化学修饰衍生物：
SEQIDNO.1：5’-CCATTTCAYTGATGRTTYCC-3’；
SEQIDNO.2：5’-GGTAAAAATCCTADAAAWGGNGG-3’；
SEQIDNO.3：5’-TGATTCTTTGGWCAYCCAGAAGT-3’；
SEQIDNO.4：5’-GGTAATCAGARTATCGWCGNGG-3’；
SEQIDNO.5：5’-ACWATTGGWCAYCAATGATAYTG-3’；
SEQIDNO.6：5’-CCACARATTTCTGARCATTG-3’；
SEQIDNO.7：5’-GTTGATCAAAGHCCWTGRCC-3’；
SEQIDNO.8：5’-TCWACAAARTGTCARTAYCA-3’；
SEQIDNO.9：5’-TTAAATCCTTWGARTAAAAYCC-3’；
SEQIDNO.10：5’-TTAGGTTGRGATGGNYTAGG-3’；
SEQIDNO.11：5’-CCHGAAGAACATAANCCRTG-3’；
SEQIDNO.12：5’-TGAGGATATCAACCNGARCG-3’；
SEQIDNO.13：5’-TAGAACAYRATGAAAYTTTGGWTC-3’；
SEQIDNO.14：5’-TTCTACTGGTCGWGCTCCAATYCA-3’；
SEQIDNO.15：5’-CCGGTYTGAACTCARATCATGTAA-3’；
SEQIDNO.16：5’-ATTTATTGTACCTTKTGTATCAG-3’；
SEQIDNO.17：5’-GTACAMCYACTRTGTTACGACTT-3’和
SEQIDNO.18：5’-GTGCCAGCADYYGCGGTTANAC-3’，
其中所述动物为除刺胞动物以外的具有环状线粒体基因组的无脊椎动物，以及蛙、蛇或鼠。
2.如权利要求1所述的用于扩增动物线粒体基因组的通用引物混合物，所述通用引物3’端的两个碱基进行硫代修饰。
3.如权利要求1所述的用于扩增动物线粒体基因组的通用引物混合物，其中所述动物选自：扁形动物、线形动物、星虫动物、环节动物、软体动物、节肢动物、苔藓动物、腕足动物、棘皮动物以及蛙、蛇或鼠。
4.如权利要求1或3所述的用于扩增动物线粒体基因组的通用引物混合物，其中所述动物选自：家衣鱼、广斧螳螂、勇斧螳螂、丽拟丝蟌、樱桃蟑螂、马达加斯加蟑螂、金边地鳖、杜比亚蟑螂、中华真地鳖、麻皮蝽、细纹小家蚁、琵琶甲、椰心叶甲、竹虫、黄粉虫、洋虫、康瘿蚊、椰子织蛾、球鼠妇、雷达蝎、毛蚶、泥蚶、青蛤、兰蛤、通俗腔蚓、菲牛蛭、雨蛙、大泛树蛙、中国林蛙、乌梢蛇或小鼠。
5.如权利要求1所述的通用引物的设计方法，其特征在于，登录NCBI网站中的GenBank数据库搜索已测定的编号为U37541.1、NC_002084.1、NC_002355.1、KP163643.1、NC_003081.2、NC_001712.1、NC_002609.1、NC_002651.1、NC_004371.1、NC_006895.1、NC_005437.1、NC_006515.2、AJ270997.1、AB018440、X54252.1、NC_011581.1、KF897830、NC_002184.1、NC_013188.1、KF750628、NC_023925.1、NC_023836.1和NC_006665的部分无脊椎动物线粒体基因组序列，进行多序列对位比对分析，找到保守序列，将搜寻到的保守序列载入引物设计软件，设计出所述用于动物线粒体基因组扩增的通用引物。
6.一种利用如权利要求1所述的通用引物混合物进行动物线粒体基因组扩增的方法，其特征在于，扩增体系包括样品体系和反应体系，
其中每5μl样品体系包含：
每15μl反应体系包含：
扩增条件为：
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，
其中每5μl样品体系包含：
每15μl反应体系包含：
扩增条件为：
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述退火缓冲液是pH为7.6，Tris-HCl终浓度为80mMMgCl2终浓度为20mM的混合溶液。
9.一种用于扩增动物线粒体基因组的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的通用引物混合物，其中所述动物为除刺胞动物以外的具有环状线粒体基因组的无脊椎动物，以及蛙、蛇或鼠。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括退火缓冲液、双蒸水、Phi29酶、焦磷酸酶、dNTP、Phi29缓冲液，及操作说明书。
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