CN104480207A - 一种检测人线粒体基因组特异性的引物组 - Google Patents
一种检测人线粒体基因组特异性的引物组 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测人线粒体基因组特异性的引物组，该引物组包括SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.32所示的引物序列。设计16对引物，而后PCR产物直接测序，最后进行拼接的方法，相比于现有技术中长片段测序，本发明所设计引物的扩增产物覆盖了整个线粒体的全基因组序列，每对引物的扩增产物长度在1200～1300bp，且相邻两对引物获得的序列重叠100～300bp。因此可以一次性地准确地获得线粒体基因组的信息，检测到线粒体基因组上的所有突变，辅助进行线粒体相关疾病的诊断。
Description
技术领域
本发明属基因组学领域，涉及一种新型人类线粒体全基因组序列的扩增引物。
背景技术
线粒体是真核生物细胞内非常重要的细胞器，是真核生物进行氧化代谢的主要部位，是糖类等物质在细胞中最终氧化释放能量的场所。线粒体自身具有一套独立的基因组，它只在卵母细胞中进行分裂，因此具有母系遗传的特点，即只通过女性向下一代进行传递。线粒体DNA基因突变的传递有一定数量上的特点。
每个细胞中含有大量线粒体，如果细胞内所有的线粒体DNA上的某一位点均为同一类型的碱基，即全部都是正常基因或同为突变基因，则该细胞为纯质的；如果细胞内所有的线粒体DNA上的某一位点同时存在正常基因和突变基因，则该细胞为异质的。当异质率到达一定的水平后，就有可能对细胞的正常功能产生影响。
研究显示，线粒体基因的突变会导致：KSS综合症，Leigh氏病或称亚急性坏死性脑肌病，ELAS综合症，MERRF综合症，Leber氏遗传性视神经萎缩症，Alper综合症，慢性进行性外眼肌麻痹，线粒体神经消化道脑肌病，Pearson综合症等。
长片段测序，对于样品以及Taq酶要求较高，也不能保证较高的准确性。本法方法设计16对引物，而后PCR产物直接测序，最后进行拼接的方法，能有效地提高数据的准确率，同时还能检测出线粒体基因的异质率。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种检测人线粒体基因组特异性的引物组，利用提供的引物，扩增出人类线粒体基因组的片段后进行测序拼接，从而确定某个人类个体的线粒体全基因组序列，在对其进行突变位点分析后，为线粒体相关疾病的治疗和预防提供相关依据。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种检测人线粒体基因组特异性的引物组，该引物组包括：
第一引物对：如SEQ ID NO.1所示的的正向引物；如SEQ ID NO.2所示的的反向引物；
第二引物对：如SEQ ID NO.3所示的的正向引物；如SEQ ID NO.4所示的的反向引物；
第三引物对：如SEQ ID NO.5所示的的正向引物；如SEQ ID NO.6所示的的反向引物；
第四引物对：如SEQ ID NO.7所示的的正向引物；如SEQ ID NO.8所示的的反向引物；
第五引物对：如SEQ ID NO.9所示的的正向引物；如SEQ ID NO.10所示的的反向引物；
第六引物对：如SEQ ID NO.11所示的的正向引物；如SEQ ID NO.12所示的的反向引物；
第七引物对：如SEQ ID NO.13所示的的正向引物；如SEQ ID NO.14所示的的反向引物；
第八引物对：如SEQ ID NO.15所示的的正向引物；如SEQ ID NO.16所示的的反向引物；
第九引物对：如SEQ ID NO.17所示的的正向引物；如SEQ ID NO.18所示的的反向引物；
第十引物对：如SEQ ID NO.19所示的的正向引物；如SEQ ID NO.20所示的的反向引物；
第十一引物对：如SEQ ID NO.21所示的的正向引物；如SEQ ID NO.22所示的的反向引物；
第十二引物对：如SEQ ID NO.23所示的的正向引物；如SEQ ID NO.24所示的的反向引物；
第十三引物对：如SEQ ID NO.25所示的的正向引物；如SEQ ID NO.26所示的的反向引物；
第十四引物对：如SEQ ID NO.27所示的的正向引物；如SEQ ID NO.28所示的的反向引物；
第十五引物对：如SEQ ID NO.29所示的的正向引物；如SEQ ID NO.30所示的的反向引物；
第十六引物对：如SEQ ID NO.31所示的的正向引物；如SEQ ID NO.32所示的的反向引物。
本发明的有益效果是：本发明设计16对引物，而后PCR产物直接测序，最后进行拼接的方法，相比于现有技术中长片段测序，本发明所设计引物的扩增产物覆盖了整个线粒体的全基因组序列，每对引物的扩增产物长度在1200～1300bp，且相邻两对引物获得的序列重叠100～300bp。因此可以一次性地准确地获得线粒体基因组的信息，检测到线粒体基因组上的所有突变，辅助进行线粒体相关疾病的诊断。
附图说明
图1是实施例1中提取的人类基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图。
图2是实施例1中人类基因组DNA的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
由于扩增大片段的线粒体基因组对样品质量以及Taq酶有很高的要求，一次性扩增出线粒体基因组会有较高的错配率。目前最准确的Sanger测序方法有效读取长度为700-800bp。本发明使用16对引物分别扩增出片段，而后进行拼接，能提高数据的准确性。下面将本发明的16个引物对应用于人线粒体基因组特异性检测，以进一步说明本发明。
1.选择研究对象：实验标本来自上海血库，共8个标本。
2.全基因组DNA的抽提：按血液基因组DNA抽提试剂盒操作说明进行操作，试剂盒为DNeasyBlood&TissueKit。提取后DNA电泳图参见图1。
3.引物设计：
第一引物对的正向引物的序列（SEQ ID NO.1）为5’-TTAACCACTCACGGGAGCT-3’，反向引物的序列（SEQ ID NO.2）为5’-GGTTTGCTGAAGATGGCGGT-3’；
第二引物对的正向引物的序列（SEQ ID NO.3）为5’-CCCCACTATGCTTAGCCCTA-3’，反向引物的序列（SEQ ID NO.4）为5’-ATCTGACGCAGGCTTATGC-3’；
第三引物对的正向引物的序列（SEQ ID NO.5）为5’-ACAGCTCTTTGGACACTAGGA-3’，反向引物为的序列（SEQ ID NO.6）为5’-TTAGGAATGCCATTGCGAT-3’；
第四引物对的正向引物的序列（SEQ ID NO.7）为5’-CCGGAGTAATCCAGGTCGGT-3’，反向引物的序列（SEQ ID NO.8）为5’-AGGTTTGAGGGGGAATGCTG-3’；
第五引物对的正向引物的序列（SEQ ID NO.9）为5’-TTCGAACAGCATACCCCCGA-3’，反向引物的序列（SEQ ID NO.10）为5’-CCATTTGGGCAAAAAGCCGGT-3’；
第六引物对的正向引物的序列（SEQ ID NO.11）为5’-CAGTTCTACCGTACAACCCT-3’，反向引物的序列（SEQ ID NO.12）为5’-GGGAGTAGTTCCCTGCTAAGG-3’；
第七引物对的正向引物的序列（SEQ ID NO.13）为5’-ATAATCGGAGGCTTTGGCA-3’，反向引物的序列（SEQ ID NO.14）为5’-GTCACTCCAGGTTTATGGAGG-3’；
第八引物对的正向引物的序列（SEQ ID NO.15）为5’-CCCACAACACTTTCTCGGCCT-3’，反向引物的序列（SEQ ID NO.16）为5’-TTATGGTGGGCCATACGGT-3’；
第九引物对的正向引物的序列（SEQ ID NO.17）为5’-ACTTTCACCGCTACACGAC-3’，反向引物的序列（SEQ ID NO.18）为5’-GGCCTTTTTGGACAGGTGGT-3’；
第十引物对的正向引物的序列（SEQ ID NO.19）为5’-GTAAAACCCAGCCCATGAC-3’，反向引物的序列（SEQ ID NO.20）为5’-TAAATGAGGGGCATTTGGT-3’；
第十一引物对的正向引物的序列（SEQ ID NO.21）为5’-GCCCTAAGTCTGGCCTATGAG-3’，反向引物的序列为（SEQ ID NO.22）为5’-CTACGAGGGCTATGTGGCT-3’；
第十二引物对的的正向引物的序列（SEQ ID NO.23）为5’-AAAACTAGGCGGCTATGGT-3’，反向引物的序列为（SEQ ID NO.24）为5’-ACGAACAATGCTACAGGGA-3’；
第十三引物对的的正向引物的序列（SEQ ID NO.25）为5’-GACACTGAGCCACAACCCA-3’，反向引物的序列（SEQ ID NO.26）为5’-TGACAGCGAGGGCTGTGAG-3’；
第十四引物对的的正向引物的序列（SEQ ID NO.27）为5’-ACAGGTCAACCTCGCTTCC-3’，反向引物的序列为（SEQ ID NO.28）为5’-AAAGGCGGTTGAGGCGTCTG-3’；
第十五引物对的的正向引物的序列（SEQ ID NO.29）为5’-ATTCTCGCACGGACTACAACC-3’，反向引物的序列（SEQ ID NO.30）为5’-ACTACAAGGACAGGCCCAT-3’；
第十六引物对的的正向引物的序列（SEQ ID NO.31）为5’-AACTAGGAGGCGTCCTTGC-3’，反向引物的序列（SEQ ID NO.32）为5’-GGAAAGTGGCTGTGCAGAC-3’；
4. PCR扩增：将干粉状的引物稀释到工作浓度10mM，PCR扩增体系为20ul，其中包括基因组DNA模板1ul（模板浓度至少为20ng/ul），正反向引物各1ul，10×PCR Buffer 2μl(含Mg2+)，dNTPs （0.2mM Each） 4μl，Hotstar Taq 1u。使用PCR仪为ABI 2720 Thermal Cycler；
扩增条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，35个循环后，72℃延伸10分钟，最后4℃终止反应。
5. PCR产物电泳鉴定：
称取2g琼脂糖放于锥形瓶中，再量取200ml的1×TBE溶液混合，放于微波炉中煮沸，至溶液清彻透明为止。冷却到60℃时加2μl核酸染料，摇匀。
组装好制胶器，并调至水平。将胶倒于制胶器中，插好梳子。待40分钟胶冷却凝固后，就可放于倒好电泳缓冲液的电泳槽中进行点样。
取5μl样品溶液，加1-2μl 6×loading Dye，混合均匀后进行点样。调电泳仪各参数进行电泳：U：150V；A；150mA；T：30min。
16对引物经行PCR后，PCR产物的电泳图如图2所示。
6. 将每个样品所有的16条PCR产物送杭州吉洛生物科技有限公司进行测序，测序引物为PCR扩增相对应的16对上下游引物。
7. 测序结果使用MutationSurveyor软件与在NCBI网站上公布的人类线粒体基因组序列（NC_012920.1）进行比对，同时对基因的突变位点进行分析。经过比对，序列的覆盖度达到100%，
表1：8个样本中所发现的突变位点
| 样品名称 | 突变位点 |
| 1号样品 | 5178，8414，10400，14484，15043 |
| 2号样品 | 8414，8701，10398，10400，12706，14668，15301 |
| 3号样品 | 5178，8701，9540，10400，10873，12706，14484，14783，15043 |
| 4号样品 | 5178，8701，9540，10400，10873，12706，14484，14783，15043 |
| 5号样品 | 5178，8701，9540，10400，10873，12706，14484，14668，14783，15043 |
| 6号样品 | 5178，8701，9540，10400，10873，12706，14484，14668， 15043 |
| 7号样品 | 8701，9540，10400，10873，12706，14484，14668，14783，15043 |
| 8号样品 | 5178，8701，9540， 10873，12706，14668，14783，15043 |
表2：发现的突变位点信息
| Psition | Gene | Codon change | Residue change |
| 5178 | ND2 | CTA-ATA | Leu-Ile |
| 8414 | ATP8 | CTC-TTC | Leu-Phe |
| 8701 | ATP6 | ACC-GCC | Thr-Ala |
| 9540 | COX3 | TTA-CTA | Leu-Leu |
| 10398 | ND3 | ACC-GCC | Thr-Ala |
| 10400 | ND3 | ACC-ACT | Thr-Thr |
| 10873 | ND4 | CCT-CCC | Pro-Pro |
| 12706 | ND5 | ATC-ATT | PHE-LEU |
| 14484 | ND6 | GTA-GTT | Met-Val |
| 14668 | ND6 | ATG-ATA | Met-Ile |
| 14783 | CYTB | TTA-CTA | Leu-Leu |
| 15043 | CYTB | GGG-GGA | Gly-Gly |
| 15301 | CYTB | TTG-TTA | Leu-Leu |
从表1和表2可以看出，在所测定的8个样品中，发现了5178，8414，8701，9540，10398，10400，10873，12706，14484，14783，15043，15301等多个突变位点。其中，5178，8414，8701，10398，12706，14484，14668突变位点的突变导致相关基因的氨基酸序列发生改变，可能是导致疾病的突变位点。14484位点是已经报道与Leber遗传病密切相关的位点。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州吉洛生物医药科技有限公司
<120> 一种检测人线粒体基因组特异性的引物组
<160> 32
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ttaaccactc acgggagct 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ggtttgctga agatggcggt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ccccactatg cttagcccta 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
atctgacgca ggcttatgc 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
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acagctcttt ggacactagg a 21
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
ttaggaatgc cattgcgat 19
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ccggagtaat ccaggtcggt 20
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<212> DNA
<213> 人工合成
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aggtttgagg gggaatgctg 20
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ttcgaacagc atacccccga 20
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ccatttgggc aaaaagccgg t 21
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<212> DNA
<213> 人工合成
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cagttctacc gtacaaccct 20
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gggagtagtt ccctgctaag g 21
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ataatcggag gctttggca 19
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
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gtcactccag gtttatggag g 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
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cccacaacac tttctcggcc t 21
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
ttatggtggg ccatacggt 19
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<212> DNA
<213> 人工合成
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actttcaccg ctacacgac 19
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ggcctttttg gacaggtggt 20
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gtaaaaccca gcccatgac 19
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 20
taaatgaggg gcatttggt 19
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gccctaagtc tggcctatga g 21
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 22
ctacgagggc tatgtggct 19
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 23
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gacactgagc cacaaccca 19
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<212> DNA
<213> 人工合成
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tgacagcgag ggctgtgag 19
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<211> 19
<212> DNA
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<400> 27
acaggtcaac ctcgcttcc 19
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<212> DNA
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<400> 28
aaaggcggtt gaggcgtctg 20
<210> 29
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<212> DNA
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<400> 29
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<212> DNA
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actacaagga caggcccat 19
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 31
aactaggagg cgtccttgc 19
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 32
ggaaagtggc tgtgcagac 19
Claims (1)
1.一种检测人线粒体基因组特异性的引物组，其特征在于，该引物组包括：
第一引物对：如SEQ ID NO.1所示的的正向引物；如SEQ ID NO.2所示的的反向引物；
第二引物对：如SEQ ID NO.3所示的的正向引物；如SEQ ID NO.4所示的的反向引物；
第三引物对：如SEQ ID NO.5所示的的正向引物；如SEQ ID NO.6所示的的反向引物；
第四引物对：如SEQ ID NO.7所示的的正向引物；如SEQ ID NO.8所示的的反向引物；
第五引物对：如SEQ ID NO.9所示的的正向引物；如SEQ ID NO.10所示的的反向引物；
第六引物对：如SEQ ID NO.11所示的的正向引物；如SEQ ID NO.12所示的的反向引物；
第七引物对：如SEQ ID NO.13所示的的正向引物；如SEQ ID NO.14所示的的反向引物；
第八引物对：如SEQ ID NO.15所示的的正向引物；如SEQ ID NO.16所示的的反向引物；
第九引物对：如SEQ ID NO.17所示的的正向引物；如SEQ ID NO.18所示的的反向引物；
第十引物对：如SEQ ID NO.19所示的的正向引物；如SEQ ID NO.20所示的的反向引物；
第十一引物对：如SEQ ID NO.21所示的的正向引物；如SEQ ID NO.22所示的的反向引物；
第十二引物对：如SEQ ID NO.23所示的的正向引物；如SEQ ID NO.24所示的的反向引物；
第十三引物对：如SEQ ID NO.25所示的的正向引物；如SEQ ID NO.26所示的的反向引物；
第十四引物对：如SEQ ID NO.27所示的的正向引物；如SEQ ID NO.28所示的的反向引物；
第十五引物对：如SEQ ID NO.29所示的的正向引物；如SEQ ID NO.30所示的的反向引物；
第十六引物对：如SEQ ID NO.31所示的的正向引物；如SEQ ID NO.32所示的的反向引物。
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