CN117070511B

CN117070511B - 一种用于扩增人类线粒体全基因组的引物组及其应用

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Publication number: CN117070511B
Application number: CN202311033025.7A
Authority: CN
Inventors: 汤雅男; 廖春根; 邹琼; 黄展鸿
Original assignee: Guangzhou Qingze Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Qingze Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-08-16
Filing date: 2023-08-16
Publication date: 2024-02-02
Anticipated expiration: 2043-08-16
Also published as: CN117070511A

Abstract

本发明公开了一种用于扩增人类线粒体全基因组的引物组及其应用。所述引物组的核酸序列由SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.18所示的序列组成。本发明创造性地设计了用于扩增人类线粒体全基因组的引物组，采用小段扩增的方式，能够针对微量样本有效扩增，能够获取石蜡样品中线粒体全基因组，并结合二代测序的技术手段，获得人类线粒体全基因组信息，为更深入地研究人类起源、遗传疾病和进化等问题提供了新的手段。

Description

一种用于扩增人类线粒体全基因组的引物组及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于人类扩增线粒体全基因组的引物组及其应用。

背景技术

线粒体基因组是细胞中的能量中心，线粒体基因的突变会导致线粒体功能障碍，并引发一些遗传性疾病，例如线粒体疾病和罕见疾病等。研究线粒体基因组能够更好地了解这些疾病的起因和机制，为开发治疗线粒体疾病的方法提供依据。线粒体基因组有着高度的个体特异性和不可逆性，在法医学中可以用于个体鉴定的研究领域，例如鉴定死者身份。进化遗传研究：线粒体基因组具有快速突变的特性，研究线粒体基因组在人类群体中的演化和扩散，可以加深我们对人类起源、迁徙和亲缘关系的认识。因此，对人线粒体基因组的研究对促进医学、法医学、进化遗传学等多个领域有着重要的意义。在日常的临床样品存贮中石蜡标本保存条件简单，经济，在临床检测中应用广泛。冰冻样品存储要求高，昂贵。所以在做线粒体研究如果能用石蜡样品进行，将大大节约医疗成本费用。目前市面上还缺少针对石蜡样品中线粒体DNA的全基因扩增产品。主要是石蜡样品存贮时间过长或者处理过程不当，会导线粒体DNA的断裂降解，不易用过长片段扩增获取。

CN113308526A公开了一种融合引物直扩法人类线粒体全基因组高通量测序试剂盒，包括文库制备试剂盒、测序模板制备试剂盒和测序试剂盒；文库制备试剂盒包含不同样本标签标记的多重PCR引物池、免DNA提取PCR扩增酶、PCR反应缓冲液、2800对照DNA和DNA纯化磁珠。此发明采用融合引物直扩法对血液样本中人类线粒体全基因组进行高通量测序试剂盒，检测成本低，操作方便。

CN110885880A公开了一种用于人类线粒体全基因组检测的引物、方法和试剂盒。所述引物包括扩增覆盖线粒体全基因组(16569bp)37个基因编码区的正、反向引物。基于NGS技术的检测方法包括：特异性引物与目标模板DNA序列结合、通用引物扩增待测样本目标区域、磁珠纯化文库、对得到的文库进行高通量测序并分析线粒体基因的突变。此发明公开的引物、方法和试剂盒可对线粒体DNA的罕见突变进行准确检测，具有超高灵敏度。

综上所述，目前仍缺少针对石蜡样品中线粒体DNA的全基因扩增的引物及方法。如何提供一种用于扩增线粒体全基因组的引物及其应用，用于获取石蜡样本中线粒体全基因组，并结合二代测序的技术手段，获得人类全基因组信息，已成为目前生物技术领域亟待解决的问题之一。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于扩增人类线粒体全基因组的引物及其应用，解决现有技术成本高、步骤多、灵敏度低、周期长和易污染等问题，本发明能够将石蜡样品中已降解的总DNA中扩增出完整的人类线粒体产物，并结合二代测序的技术手段获得人类全基因组信息。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种用于扩增人类线粒体全基因组的引物组，其特征在于，所述引物组的核酸序列由SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.18所示的序列组成。

本发明中创造性地设计了用于扩增线粒体全基因组的引物组，采用小段扩增的方式，通过18对引物可以实现人线粒体全长的覆盖，覆盖率达99％以上，可以在极少的数据量下获得更高的测序深度，降低测序成本。所述扩增引物组可以降低模板使用量，可以稳定检测低至5ng的样品，针对低质量微量的石蜡样品也能够有效扩增，获取人类线粒体全基因组信息。

SEQ ID NO.1：cataccccgaaccaaccaaacc。

SEQ ID NO.2：gagacagctgaaccctcgtggag。

SEQ ID NO.3：aaccgtgcaaaggtagcataatca。

SEQ ID NO.4：aggattatggatgcggttgctt。

SEQ ID NO.5：cctcgttccacagaagctgccatca。

SEQ ID NO.6：cggagtagtaagttacaatatgggag。

SEQ ID NO.7：gaagtttatattcttatcctaccaggcttcg。

SEQ ID NO.8：gttcgtcctttagtgttgtgtatgg。

SEQ ID NO.9：ccaacaatgactaatcaaactaacctcaa。

SEQ ID NO.10：actagtagggctaggcccaccgctg。

SEQ ID NO.11：gtgcctattgccatactagtctttgc。

SEQ ID NO.12：gaacagttggaataggttgttagcg。

SEQ ID NO.13：actcagacccaaacattaatcagttcttca。

SEQ ID NO.14：gggaggtcgatgaatgagtggttaattaat。

SEQ ID NO.15：ccatcgttgtatttcaactacaagaacac。

SEQ ID NO.16：gagtattttgttttcaattagggagatagt。

SEQ ID NO.17：ctcattctaacctgaatcggagg。

SEQ ID NO.18：gtgatgtgagcccgtctaaac。

第二方面，本发明提供了第一方面所述的用于扩增人类线粒体全基因组的引物组在制备用于检测人类线粒体疾病的试剂盒中的应用。

第三方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于扩增人类线粒体全基因组的引物组。

第四方面，本发明提供了一种以非疾病诊断或治疗为目的的人类线粒体全基因组DNA扩增方法，所述方法包括：

采用第一方面所述的引物组，以总DNA为模板，进行PCR扩增，所述总DNA的来源包括石蜡样本、唾液样本、血液样本或组织样本中的任意一种。

优选地，所述PCR扩增的体系包括：第一方面所述的引物组、高保真酶和总DNA。

优选地，所述引物组中每个引物的用量为1～2μL。

上述1～2μL中点值具体可以选择1μL、1.1μL、1.2μL、1.3μL、1.4μL、1.5μL、1.6μL、1.8μL、1.9μL、2μL。

优选地，所述总DNA的用量为5～55ng。

上述5～55ng中点值具体可以选择5ng、6ng、7ng、10ng、15ng、20ng、30ng、40ng、50ng、53ng、54ng、55ng。

优选地，所述高保真酶的用量为20～30μL。

上述20～30μL中点值具体可以选择20μL、21μL、22μL、23μL、24μL、25μL、26μL、28μL、29μL、30μL。

优选地，所述PCR扩增的程序包括：

(1)94～96℃，5～10min；(2)94～96℃，20～30s；56～59℃，20～30s；68～72℃，40～60s；共30个循环；(3)68～72℃，5～10min。

上述94～96℃中点值具体可以选择94℃、94.1℃、94.2℃、95℃、95.1℃、95.2℃、95.3℃、95.4℃、95.7℃、95.8℃、96℃等。

上述5～10min中点值具体可以选择5min、5.1min、5.1min、5.1min、5.7min、5.9min、6、7、8min、9min、9.6min、9.9min、10min等。

上述20～30s中点值具体可以选择20s、21s、22s、23s、24s、25s、26s、27s、28s、29s、30s等。

上述56～59℃中点值具体可以选择56℃、56.2℃、57℃、58℃、58.2℃、58.3℃、58.4℃、58.7℃、58.8℃、59℃等。

上述40～60s中点值具体可以选择40s、41s、42s、43s、44s、45s、50s、57s、58s、59s、60s等。

上述68～72℃中点值具体可以选择68℃、69℃、70℃、71℃、71.2℃、71.3℃、71.4℃、71.7℃、71.8℃、72℃等。

第五方面，本发明提供了一种以非疾病诊断或治疗为目的的人类线粒体全基因组测序方法，所述人类线粒体全基因组测序方法包括：采用第四方面所述的方法扩增得到人类线粒体全基因组DNA，构建测序文库，采用高通量测序平台进行全基因组测序；

所述测序文库的制备方法包括：

打断第四方面所述的方法扩增得到人类线粒体全基因组DNA基因组DNA，末端修复加A尾，加测序接头，PCR扩增，目的片段筛选纯化，得到测序文库；

所述目的片段的为1400～2000kb。

上述1400～2000kb中点值具体可以选择1400kb、1500kb、1600kb、1700kb、1800kb、1900kb、2000kb等。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

附图说明

图1为实施例1电泳检测结果图；

图2为实施例2电泳检测结果图；

图3A为使用Snapgene软件比对分析测序数据和人线粒体基因组结果图；

图3B为使用AlignX软件分析结果图；

图4为二代测序鉴定结果图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

引物设计。

设计的引物如表1所示。

表1

反应体系如表2所示。

反应程序：(1)95℃，5min；(2)95℃，20s；58℃，20s；72℃，40s；共30个循环；(3)72℃，5min。

上游引物和下游引物使用的为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.18所示的序列。

获得的扩增产物进行电泳检测。结果如图1所示，表明本发明设计筛选的引物能够有效的扩增出人线粒体基因组条带。

实施例2

本实施例与实施例1区别仅在于引物组中的序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.9-SEQ ID NO.14替换为SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.26所示的序列。

电泳结果如图2所示。1、5号引物出现非特异现象，6、7号出现未扩增现象，经过引物测试调试，扩增出目的片段。其中第7号引物区段比较难扩增，这段区域为ND5-NADHdehydrogenase subunit 5和ND6-NADH dehydrogenase subunit 6，这两个亚基的翻译区段，该区段AT含量高达55％，重复序列含量高，结构复杂经过多次测试调整，更换引物才能稳定扩增出来。

测试例1

一代测序鉴定。

扩增产物切胶回收，经一代测序(送至艾基生物公司检测)比对验证，从NCBI中下载人类线粒体基因组序列，使用Snapgene软件将测序数据和人线粒体基因组进行比对分析结果如图3A所示，用Alignment软件进行比对分析，结果如图3B所示，结果表明序列与人线粒体基因组相符，引物扩增区域为人类线粒体基因组序列，属于特异性扩增，所扩增的引物片段与基因组比对基本重叠(除SNP位点突变外)。

测试例2

二代测序鉴定。

将实施例1所述引物扩增产物混合进行二代测序(同实施例1)，有效测序数据通过BWA(Li H et al.)(比对到参考基因组(chrM,hg38)，得到BAM格式的最初的比对结果。然后，用picard对比对结果进行排序；再用gatk标记重复reads(mark duplicate reads)。最后，利用重复标记后的比对结果进行覆盖度、深度的统计，结果如图4所示样本1和样本2可全面覆盖度高达99％以上。

综上所述，本发明中创造性地设计了用于扩增线粒体全基因组的引物组，采用小段扩增的方式，通过18对引物可以实现人线粒体全长的覆盖，覆盖率达99％以上，可以在极少的数据量下获得更高的测序深度，降低测序成本。所述扩增引物组可以降低模板使用量，可以稳定检测低至5ng的样品，针对低质量微量的石蜡样品也能够有效扩增，获取人类线粒体全基因组信息。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种用于扩增人类线粒体全基因组的引物组，其特征在于，所述引物组的核酸序列由SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.18所示的序列组成。

2.权利要求1所述的用于扩增人类线粒体全基因组的引物组在制备用于检测人类线粒体疾病的试剂盒中的应用。

3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于扩增人类线粒体全基因组的引物组。

4.一种以非疾病诊断或治疗为目的的人类线粒体全基因组DNA扩增方法，其特征在于，所述方法包括：采用权利要求1所述的引物组，以总DNA为模板，进行PCR扩增；

所述总DNA的来源包括石蜡样本、唾液样本、血液样本或组织样本中的任意一种。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系包括：权利要求1所述的引物组、高保真酶和总DNA。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述引物组中每个引物的用量为1~2 μL。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述总DNA的用量为5~55 ng。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述高保真酶的用量为20~30 μL。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序包括：

（1）94~96℃，5~10 min；（2）94~96℃，20~30 s；56~59℃，20~30 s；68~72℃，40~60 s；共30个循环；（3）68~72℃，5~10 min。

10.一种以非疾病诊断或治疗为目的的人类线粒体全基因组测序方法，其特征在于，所述人类线粒体全基因组测序方法包括：采用权利要求4-9中任一项所述的方法扩增得到人类线粒体全基因组DNA，构建测序文库，采用高通量测序平台进行全基因组测序；

所述测序文库的制备方法包括：

打断权利要求4-9任一项所述的方法扩增得到人类线粒体全基因组DNA，末端修复加A尾，加测序接头，PCR扩增，目的片段筛选纯化，得到测序文库；

所述目的片段为1400~2000 kb。