CN106755456A - 用于线粒体全基因组检测的引物组合及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及线粒体全基因组检测的引物组合及试剂盒，本发明利用PCR和Sanger测序技术检测线粒体全基因组以辅助诊断由于mtDNA突变导致的线粒体病。本发明先利用6对特异性引物来扩增整个线粒体基因组，每个扩增产物大小在2700‑3500bp之间，且相邻的扩增片段具有200bp以上的重叠，然后利用21个测序引物对扩增产物直接测序，测序范围覆盖整个线粒体基因组。利用本发明的引物组合，只需6个扩增反应和21个测序反应就能检测整个线粒体基因组，大大减少了检测工作量，同时检测成本也大幅减少。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术检测领域，具体涉及线粒体全基因组检测的引物及试剂盒。
背景技术
线粒体病(mitochondriopathy)是由遗传缺损引起线粒体代谢酶缺陷，导致ATP合成障碍，能量来源不足而出现的一组多系统疾病或组织特异性疾病。线粒体是细胞内产生能量的细胞器。除了红血细胞外，它存在于人体内的每一个细胞中。线粒体的主要功能是提供细胞所需要的能量-三磷酸腺苷(ATP)。线粒体有自己的一套遗传控制系统，同时也受到核DNA的控制。线粒体DNA(mtDNA)一旦发生突变，将会导致编码线粒体氧化代谢过程必需的酶或载体发生障碍，糖原和脂肪酸等不能进入线粒体使得ATP合成受阻，导致能量代谢障碍和产生复杂的临床症状。
据文献报道，线粒体病发病率大约为1/5000，线粒体病可由核基因组DNA突变或mtDNA突变导致，而由mtDNA突变导致的线粒体病大约占15％。常见的线粒体病主要有线粒体病伴高乳酸血症和卒中样发作综合征(MELAS)、肌阵挛性癫痫伴肌肉蓬毛样红纤维综合征(MERRF)、慢性进行性眼外肌麻痹综合征(KSS)、原发性线粒体脑病Leigh综合征、Leber遗传性视神经病(LHON)、Pearson综合征等。
人类线粒体基因组全长16569bp，总共包含37个基因，其中13个编码功能蛋白(呼吸链复合物)，2个编码rRNA(16S和12S)，2个编码tRNA。mtDNA突变在人群中非常普遍，据文献报道，200个初生儿中就有一个携带有10个常见mtDNA致病性突变的其中一个突变。mtDNA突变遍布整个线粒体基因组，已发现的点突变种类就多达500多种，常见的点突变位点有m.3243A>G、m.3460G>A、m.1555A>G、m.8344A>G等。线粒体基因组结构和常见突变位点的分布情况如图1所示。
对mtDNA进行检测，常用的也是最简单的方法就是设计特异性引物对线粒体基因组进行扩增，然后对扩增产物进行测序。目前用于mtDNA检测的方法主要分为2大类：
1.Sanger测序。该方法相对简单，为目前主流的检测方法。目前此方法存在的主要问题是扩增反应和测序反应数均较多，文献报道的扩增反应数大多在10个以上(最少9个)，测序反应数最多达到66个。
2.高通量测序(NGS)。检测流程为先利用长片段PCR扩增出整个线粒体全基因组，之后将扩增产物片段化并进行文库制备，然后将文库上机测序，最后对测序数据进行分析和解读。虽然该方法通量很高，但流程复杂，成本也较高。
Sanger测序技术自从上世纪70年代诞生以来，目前已在临床检测领域广泛应用，并成为基因检测的金标准。Sanger测序读长最大能达到1000bp。由于线粒体基因组全长16kb，要想通过Sanger测序技术获得线粒体基因组全长必须设计多个引物分段扩增，测序后再进行拼接，虽然较小的扩增片段(500-1000bp)的最适合后续的Sanger测序，但需要做30-40个扩增反应以及40个以上的测序反应，不仅工作量大，检测成本也较高。另外，虽然可以通过1-4个长片段PCR(Long-range PCR)就能扩增出线粒体基因组全长，然而长片段的产物不适合进行后续的Sanger测序。综合来看，用Sanger测序技术来检测线粒体基因组其扩增产物大小在3000-4000bp最适宜。
利用Sanger测序来检测mtDNA最大的难点在于引物设计，主要原因是：
1.线粒体基因组序列与核基因组序列具有高度同源性(核基因组中存在大量的NUMTs)，引物设计不当将会对核基因组DNA进行非特异性扩增。
2.线粒体基因组序列具有高度的多态性，如果引物设计在具有多态性的位置，那么会由于引物与模板序列错配而导致扩增失败。
我们经过大量的工作和尝试，在引物上精心设计，在扩增体系和条件上不断优化，最终开发出一个操作简便、时间短、成本低的用于线粒体全基因组检测的体系。
发明内容
本发明提供了线粒体全基因组的检测引物、检测体系和试剂盒。本发明利用特异性扩增线粒体基因组的引物和对扩增产物进行测序的引物，通过PCR和Sanger测序技术，检测线粒体基因组的微小变异，从而辅助诊断因mtDNA突变导致的线粒体病。利用本发明的引物和检测体系，只需6个扩增反应和21个测序反应就可以对线粒体全基因组进行检测。
根据本发明的一个方面，提供线粒体全基因组检测的引物组合，包括6组扩增引物对，分别是：
用于扩增m.14835-m.1691区域MC1的引物对，其碱基序列为：
MC1-F：GATGAAACTTYGGCTCACTCCT
MC1-R：GGGTTTGGGGCTAGGTTTAGC；
用于扩增m.1216-m.3959区域MC2的引物对，其碱基序列为：
MC2-F：CGATAAACCCCGATCAACCTCA
MC2-R：CCTGCGGCGTATTCGATGTT；
用于扩增m.3706-m.6808区域MC3的引物对，其碱基序列为：
MC3-F：CGAGCAGTRGCCCARACAATC
MC3-R：GYGTGTCTACGTCTATTCCTACTG；
用于扩增m.6418-m.9776区域MC4的引物对，其碱基序列为：
MC4-F：AACCCCCTGCCATAACCCA
MC4-R：TCGGAAATRGTGAAGGGRGA；
用于扩增的m.8963-m.12214区域MC5的引物对，其碱基序列为：
MC5-F：ATCAGCCTRYTCATTCAACCAA
MC5-R：GCTTYCTCGGTAAAYAAGGGGT；
用于扩增m.11965-m.15364区域MC6的引物对，其碱基序列为：
MC6-F：CACAGCCCTATACTCCCTCTACAT
MC6-R：GTTTGATCCYGTTTCGTGYAA；
其中上述扩增引物中的简并碱基Y是C和/或T，并且简并碱基R是A和/或G。
以上扩增引物在线粒体基因组上的分布如图2所示。MC1-MC6的扩增引物对的产物大小在2700-3500bp之间，并且相邻的扩增产物具有重叠区间，重叠区间大于200bp。
本发明的引物组合中的各对扩增引物的Tm值都在(60±3)℃的范围内，确保用于扩增的引物在相同体系及扩增条件下，所有的引物对均能出现明亮且较单一的目的条带，确保用于测序的引物在相同体系和条件下均能对目标产物成功测序。
根据本发明的另一个方面，提供线粒体全基因组检测的扩增反应体系，所述扩增反应体系包括6个单独的扩增反应体系，每个单独的扩增反应体系分别包含MC1-MC6扩增引物对中的一对、聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP和模板DNA。
在优选的实施方案中，所述聚合酶是Taq酶。更优选地，所述聚合酶是热启动Taq酶。
在优选的实施方案中，所述反应体系的体积为25μl或50μl。
根据本发明的另一个方面，提供线粒体全基因组检测试剂盒，所述试剂盒包含上述任一种引物组合。
在优选的实施方案中，所述试剂盒中还进一步包含聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP。
在优选的实施方案中，所述聚合酶是Taq酶。更优选地，所述聚合酶是热启动Taq酶。
根据本发明的另一个方面，提供线粒体全基因组检测方法，包括以下步骤：
(1)制备上述扩增反应体系；
(2)进行PCR扩增，扩增程序是：在95℃变性5-15分钟；然后进行30-35个循环，每个循环中94℃变性30秒，然后60-65℃退火30-90秒，然后60-72℃延伸60-180秒；最后在60-72℃延伸10-30分钟。
在一些实施方案中，所述线粒体全基因组检测方法还包括步骤(3)：对扩增获得的序列进行测序。在优选的实施方案中，所述测序为Sanger测序。在优选的实施方案中，使用下述测序引物对扩增获得的序列进行测序：
用于对m.14835-m.1691区域MC1的扩增产物进行测序的引物，其碱基序列为：
MC1-SP1：GATGAAACTTYGGCTCACTCCT
MC1-SP2：CGTCCTTGCCCTATTACTATC
MC1-SP3：CTGTATCCGACATCTGGTTCCT
MC1-SP4：TCACCCCCCAACTAACACATT；
用于对m.1216-m.3959区域MC2的扩增产物进行测序的引物，其碱基序列为：
MC2-SP1：CGATAAACCCCGATCAACCTCA
MC2-SP2：AGGAACAGCTCTTTGGACACT
MC2-SP3：ACAAGTTACCCTAGGGATAACA；
用于对m.3706-m.6808区域MC3的扩增产物进行测序的引物，其碱基序列为：
MC3-SP1：CGAGCAGTRGCCCARACAATC
MC3-SP2：TATTTCCTCACGCAAGCAAC
MC3-SP3：CACGCTACTCCTACCTATCT；
用于对m.6418-m.9776区域MC4的扩增产物进行测序的引物，其碱基序列为：
MC4-SP1：AACCCCCTGCCATAACCCA
MC4-SP2：ACCCCGATGCATACACCACATG
MC4-SP3：CATGAGCTGTCCCCACATTA；
用于对m.8963-m.12214区域MC5的扩增产物进行测序的引物，其碱基序列为：
MC5-SP1：ATCAGCCTRYTCATTCAACCAA
MC5-SP2：CACAGGCTTCCACGGACTTC
MC5-SP3：TAGTCTTTGCCGCCTGCGAA
MC5-SP4：AATACGCCTCACACTCATTC；
用于对m.11965-m.15364区域MC6的扩增产物进行测序的引物，其碱基序列为：
MC6-SP1：CACAGCCCTATACTCCCTCTACAT
MC6-SP2：TTAGTTACCGCTAACAACCTAT
MC6-SP3：GCAGGAATACCTTTCCTCACAG
MC6-SP4：TTCTTCTTCCCACTCATCCT；
其中这些测序引物中的简并碱基Y是C和/或T，并且简并碱基R是A和/或G。
其中模板DNA为样品的全基因组DNA。
在优选的实施方案中，所述扩增反应液的体积为25μl或50μl。
在优选的实施方案中，所述聚合酶是Taq酶。更优选地，所述聚合酶是热启动Taq酶。
在优选的实施方案中，步骤(2)的扩增程序是：95℃变性10分钟；然后进行30个循环，每个循环中94℃变性30秒，然后60℃退火30秒，然后65℃延伸2分钟；最后65℃延伸10分钟。
根据本发明的另一个方面，提供上述任一种引物组合或扩增反应体系在制备用于检测线粒体全基因组的试剂中的应用。
在一些实施方案中，扩增引物中和/或测序引物中的任一个兼并碱基Y独立地是C或T。
在一些实施方案中，扩增引物中和/或测序引物中的任一个兼并碱基R独立地是A或G。
在一些实施方案中，扩增引物中和/或测序引物中的任一个包含简并碱基Y的引物序列独立地是简并碱基Y为C的序列和简并碱基Y为T的序列的混合物，优选在该混合物中简并碱基Y为C的序列和简并碱基Y为T的序列的质量比为1：1。
在一些实施方案中，扩增引物中和/或测序引物中的任一个包含简并碱基R的引物序列独立地是简并碱基R为A的序列和简并碱基R为G的序列的混合物，优选在该混合物中简并碱基R为A的序列和简并碱基R为G的序列的质量比为1：1。
本发明所述的热启动Taq酶是指通过对Taq酶进行修饰，使Taq酶的活性在低温下被抑制并在高温下被激活，使用热启动Taq酶可以提高PCR扩增特异性。
本发明的优势在于：
1.操作简便，检测时间短，检测成本低。由于只需6个扩增反应和21个测序反应，操作起来非常简便，检测时间大大缩短，同时检测成本大幅降低。
2.检测结果准确可靠。由于引入了简并碱基，避免了由于多态性而导致扩增失败或异质性的现象。
附图说明
图1是线粒体基因组结构及常见突变位点的分布示意图。
图2是MC1-MC6扩增引物在线粒体全基因组上的分布示意图。
图3是MC1-MC6引物特异性测试的电泳检测结果。
图4是1例正常男性样本m.3243位点的Sanger测序结果分析图。
图5是1例MELAS患者m.3243A>G突变位点的Sanger测序结果分析图。
具体实施方式
本文使用的术语“引物”是能够指与靶核酸序列杂交以在合适的条件下引发引物延伸产物合成的短的线性寡核苷酸。在聚合反应体系中，引物可以是一条或多条。本文使用的术语“引物对”表示一组或一对引物，包括与靶核酸序列的5'末端的互补序列杂交的5'有义引物(也可被称为“正向引物”或“上游引物”，可以用简写“F”表示)，以及与靶序列的3'末端杂交的3'反义引物(也可被称为“反向”或“下游”，可以用简写“R”表示)。
本文使用的术语“扩增”是指增加样品中靶核酸序列拷贝数的体外方法，扩增反应通常由允许连续变性、退火和引物延伸循环的多轮重复温度循环组成。典型的扩增反应是PCR(Polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)。通常，PCR反应涉及一系列重复20-35次的热循环，所述循环包括变性步骤、引物退火步骤和延伸/延长步骤。PCR反应常常以5-100μ1的反应体积在小反应管中于热循环仪中进行。变性步骤在大约94℃-95℃的温度使核酸能够完全变性，这一步骤产生单链DNA。引物退火步骤通常在比引物-靶序列DNA双链体的解链温度低大约5℃的温度下进行，在这一步骤中，寡核苷酸引物特异性结合于单链靶序列。延伸步骤在约72℃进行，但这依赖于所用的DNA聚合酶。例如Taq DNA聚合酶的最佳条件为72℃，在这一步中，DNA聚合酶通过从5'到3'方向上添加dNTP的引物延伸来合成与靶链互补的新DNA链。
聚合酶是扩增体系的重要组分，本文使用的术语“聚合酶”是指能从核苷三磷酸或脱氧核苷三磷酸合成核酸链(例如RNA或DNA)的酶。本发明的“聚合酶”优选地是DNA聚合酶，包括但不限于Taq酶。多种Taq酶都满足本发明的需要，如Takara的LA Taq和HS Taq、KAPA的HiFi Taq、Life的AmpliTaq Gold酶等均能得到较好的扩增效率和特异性。本发明所使用的聚合酶优选为热启动聚合酶，更优选为热启动Taq酶。本文使用的术语“热启动聚合酶”是指这样的聚合酶，它的酶活性在非许可温度(例如大约25℃至大约45℃)下受到抑制而在与PCR反应相匹配的温度(例如，大约55℃至大约95℃)下被激活或“热诱导”。例如，Relia热启动酶是通过化学修饰的方法封闭酶的活性中心，低温下化学小分子和酶活性中心结合，酶无活性，当温度升高至大约95℃，两者脱离，酶活性中心暴露，开始指导体系扩增。热启动聚合酶(例如热启动Taq酶)可以极大地提高扩增的特异性和灵敏度。热启动聚合酶是本领域众所周知的，可以从市场上购买获得。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
1、引物组合的设计
根据线粒体基因组序列设计扩增引物，引物序列如表1所示。
表1：扩增引物序列
| 引物名称 | 引物序列 |
| MC1-F | GATGAAACTTCGGCTCACTCCT(SEQ ID NO:1) |
| MC1-R | GGGTTTGGGGCTAGGTTTAGC(SEQ ID NO:2) |
| MC2-F | CGATAAACCCCGATCAACCTCA(SEQ ID NO:3) |
| MC2-R | CCTGCGGCGTATTCGATGTT(SEQ ID NO:4) |
| MC3-F | CGAGCAGTAGCCCAAACAATC(SEQ ID NO:5) |
| MC3-R | GTGTGTCTACGTCTATTCCTACTG(SEQ ID NO:6) |
| MC4-F | AACCCCCTGCCATAACCCA(SEQ ID NO:7) |
| MC4-R | TCGGAAATGGTGAAGGGAGA(SEQ ID NO:8) |
| MC5-F | ATCAGCCTACTCATTCAACCAA(SEQ ID NO:9) |
| MC5-R | GCTTTCTCGGTAAATAAGGGGT(SEQ ID NO:10) |
| MC6-F | CACAGCCCTATACTCCCTCTACAT(SEQ ID NO:11) |
| MC6-R | GTTTGATCCCGTTTCGTGCAA(SEQ ID NO:12) |
为了验证6对扩增引物的特异性(即特异性扩增线粒体基因组)，将全基因组DNA电泳后进行切胶回收以去除mtDNA(回收产物先用一对特异性扩增核基因组DNA的引物进行PCR，若能扩增出目的产物则说明回收成功)，然后用去mtDNA后的核基因组DNA做模板进行扩增，同时用切胶回收前的全基因组DNA做对照，结果显示6对引物以全基因组DNA为模板均能扩增出目的产物，而以去除mtDNA后的核基因组DNA为模板则无扩增产物出现(如图3所示)。
根据线粒体基因组序列和扩增产物分布情况设计测序引物，引物序列如表2所示。
表2：测序引物序列
| 引物名称 | 引物序列 |
| MC1-SP1 | GATGAAACTTCGGCTCACTCCT(SEQ ID NO:13) |
| MC1-SP2 | CGTCCTTGCCCTATTACTATC(SEQ ID NO:14) |
| MC1-SP3 | CTGTATCCGACATCTGGTTCCT(SEQ ID NO:15) |
| MC1-SP4 | TCACCCCCCAACTAACACATT(SEQ ID NO:16) |
| MC2-SP1 | CGATAAACCCCGATCAACCTCA(SEQ ID NO:17) |
| MC2-SP2 | AGGAACAGCTCTTTGGACACT(SEQ ID NO:18) |
| MC2-SP3 | ACAAGTTACCCTAGGGATAACA(SEQ ID NO:19) |
| MC3-SP1 | CGAGCAGTAGCCCAAACAATC(SEQ ID NO:20) |
| MC3-SP2 | TATTTCCTCACGCAAGCAAC(SEQ ID NO:21) |
| MC3-SP3 | CACGCTACTCCTACCTATCT(SEQ ID NO:22) |
| MC4-SP1 | AACCCCCTGCCATAACCCA(SEQ ID NO:23) |
| MC4-SP2 | ACCCCGATGCATACACCACATG(SEQ ID NO:24) |
| MC4-SP3 | CATGAGCTGTCCCCACATTA(SEQ ID NO:25) |
| MC5-SP1 | ATCAGCCTACTCATTCAACCAA(SEQ ID NO:26) |
| MC5-SP2 | CACAGGCTTCCACGGACTTC(SEQ ID NO:27) |
| MC5-SP3 | TAGTCTTTGCCGCCTGCGAA(SEQ ID NO:28) |
| MC5-SP4 | AATACGCCTCACACTCATTC(SEQ ID NO:29) |
| MC6-SP1 | CACAGCCCTATACTCCCTCTACAT(SEQ ID NO:30) |
| MC6-SP2 | TTAGTTACCGCTAACAACCTAT(SEQ ID NO:31) |
| MC6-SP3 | GCAGGAATACCTTTCCTCACAG(SEQ ID NO:32) |
| MC6-SP4 | TTCTTCTTCCCACTCATCCT(SEQ ID NO:33) |
2、常规PCR扩增体系及条件的建立
2.1 Taq酶
使用热启动Taq酶作为DNA聚合酶。
2.2反应体积的选择
分别采用了25μl和50μl体系进行了复合扩增，这2种不同的体系效果相当(即产物在琼脂糖凝胶电泳图中的条带亮度相当，均无杂带)。
2.3反应程序的优化
退火及延伸温度：考察了退火温度从60℃到65℃之间各温度下的扩增情况，结果显示在60-65℃范围内扩增产物在琼脂糖凝胶电泳图中的条带亮度相当，均无杂带。在以下变性、退火及延伸温度下各时间范围内(见表3)的扩增可以得到较好的结果(即产物在琼脂糖凝胶电泳图中的条带明亮，均无杂带)：
表3：温度与时间
| 温度 | 时间 |
| 95℃(变性) | 5-15min |
| 60-65℃(退火) | 30-90s |
| 60-72℃(延伸) | 30-60s |
| 65-72℃(最后延伸) | 10-30min |
扩增循环数：考察了循环数在30至35之间各循环数下的扩增情况，结果显示在30-35范围内均能得到较好结果(即产物在琼脂糖凝胶电泳图中的条带明亮，均无杂带)。
3、实验验证
在以下实施例中，采用本发明的检测体系分别对1例MELAS患者血液样本和1例正常男性血液样本进行检测。
3.1 DNA提取
采用QIAGEN公司的FlexiGene DNA Kit对2例血液样本进行全基因组DNA提取，具体操作按说明书进行。
3.2 PCR反应
将6对扩增引物干粉(引物序列见表2)分别溶解并配成浓度为5μM的工作液。
将各反应试剂(ddH2O、2×GoldStar Taq Master Mix、Primer)振荡混合后按表4体积比配成PCR反应混合液(模板除外)，分装23μl PCR反应混合液于PCR反应管中，每个样本包括分别以MC1-MC6为扩增引物的6个PCR反应，共包括6个PCR反应管，每个PCR反应管含有MC1-MC6中的一对扩增引物，最后往各反应管加入2μl模板，离心后进入下一步。
表4 PCR体系
备注：2×GoldStar Taq Master Mix购于北京康为世纪生物科技有限公司，由GoldStar Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs及PCR稳定剂和增强剂组成。
3.3 PCR反应程序
将PCR反应管置于扩增仪(ABI 2720循环扩增仪)上，运行如下程序：
第1步：95℃变性10分钟，第2步：94℃变性30秒，第3步60℃退火30秒，第4步：65℃延伸2分钟，重复2至4步30次，最后65℃延伸10分钟。运行结束置于冰箱4℃保存。
3.4琼脂糖凝胶电泳检测(仪器为六一牌DYCP-31CN型电泳仪)
预先配制1.5％的琼脂糖凝胶，取上一步得到的PCR扩增产物3μl点样于凝胶上，电压100v条件下进行电泳，30min后置于凝胶成像仪上观察结果并拍照保存。
3.5 Sanger测序(仪器为ABI 3500Dx)
将每一PCR反应管中剩余的22μl扩增产物进行纯化(纯化试剂为购至康为世纪的快速DNA产物纯化试剂盒CW2301S，操作按标准Protocol)，然后进行测序模板的制备(各扩增片段对应的测序引物如表5所示，测序试剂为购自Invitrogen公司的BigDye Terminatorv3.1 Cycle Sequencing Kit，操作按标准Protocol)，最后将测序模板(每个样本21个)置于96孔PCR板上，加入10μl甲酰胺(Hi-DiTM Formamide，Invitrogen)，变性后置于ABI3500Dx测序仪上进行测序。
表5扩增片段与测序引物对应表
3.6测序结果分析
3.6.1序列组装(软件：DNAStar，美国DNASTAR公司)
将正常男性样本测序所得的21个测序结果(原始文件)导入DNASTAR软件的SeqMan程序中，添加要拼接的序列，手工去除序列两端质量差的序列后进行序列拼接，以FASTA格式导出拼接好的序列，并与从MITO MAP网站下载的Revised Cambridge ReferenceSequence(rCRS)of the Human Mitochondrial DNA参考序列进行比对，结果(未展示)显示除少数多态性位点的碱基不同外，其余序列均一致，说明通过所设计的6对扩增引物得到的扩增片段经21个测序反应后能得到全部的线粒体基因组序列。
3.6.2变异位点分析(软件：MutationSurveyor，美国SoftGenetics公司)
将正常男性样本和MELAS患者测序所有的测序结果(原始文件)分别导入MutationSurveyor软件中，将正常男性样本的结果做为参照，然后将MELAS患者的序列与之比较，发现在m.3243位点处发生A>G的异质性突变，如图5所示(正常样本该位点为A，如图4所示)。
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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gatgaaactt cggctcactc ct 22
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<212> DNA
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gggtttgggg ctaggtttag c 21
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cgataaaccc cgatcaacct ca 22
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cctgcggcgt attcgatgtt 20
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cacagcccta tactccctct acat 24
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ttcttcttcc cactcatcct 20
Claims (9)
1.线粒体全基因组检测的引物组合，包括6组扩增引物对，分别是：
用于扩增m.14835-m.1691区域MC1的引物对，其碱基序列为：
MC1-F：GATGAAACTTYGGCTCACTCCT
MC1-R：GGGTTTGGGGCTAGGTTTAGC；
用于扩增m.1216-m.3959区域MC2的引物对，其碱基序列为：
MC2-F：CGATAAACCCCGATCAACCTCA
MC2-R：CCTGCGGCGTATTCGATGTT；
用于扩增m.3706-m.6808区域MC3的引物对，其碱基序列为：
MC3-F：CGAGCAGTRGCCCARACAATC
MC3-R：GYGTGTCTACGTCTATTCCTACTG；
用于扩增m.6418-m.9776区域MC4的引物对，其碱基序列为：
MC4-F：AACCCCCTGCCATAACCCA
MC4-R：TCGGAAATRGTGAAGGGRGA；
用于扩增的m.8963-m.12214区域MC5的引物对，其碱基序列为：
MC5-F：ATCAGCCTRYTCATTCAACCAA
MC5-R：GCTTYCTCGGTAAAYAAGGGGT；
用于扩增m.11965-m.15364区域MC6的引物对，其碱基序列为：
MC6-F：CACAGCCCTATACTCCCTCTACAT
MC6-R：GTTTGATCCYGTTTCGTGYAA；
其中上述扩增引物中的简并碱基Y是C和/或T，并且简并碱基R是A和/或G。
2.线粒体全基因组检测的扩增反应体系，所述扩增反应体系包含6个单独的扩增反应体系，其中每个单独的扩增反应体系分别包含权利要求1或2的引物组合中的一组引物对、聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP和模板DNA。
3.根据权利要求2的扩增反应体系，其中所述聚合酶是热启动Taq酶。
4.根据权利要求2的扩增反应体系，其中所述反应体系的体积为25μl-50μl。
5.线粒体全基因组检测试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1的引物组合。
6.权利要求1的引物组合或权利要求2-4任一项的扩增反应体系在制备用于检测线粒体全基因组的试剂中的应用。
7.线粒体全基因组检测方法，包括以下步骤：
(1)制备权利要求2-4任一项的扩增反应体系；
(2)进行PCR扩增，扩增程序是：在95℃变性5-15分钟；然后进行30-35个循环，每个循环中94℃变性30秒，然后60-65℃退火30-90秒，然后60-72℃延伸60-180秒；最后在60-72℃延伸10-30分钟。
8.权利要求7的线粒体全基因组检测方法，还包括步骤(3)：对扩增获得的序列进行测序。
9.权利要求8的线粒体全基因组检测方法，其中所述测序是Sanger测序。
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