CN107904318A

CN107904318A - 一种基于分子生物学的黄腿螯蜂的鉴别引物及方法

Info

Publication number: CN107904318A
Application number: CN201711458336.2A
Authority: CN
Inventors: 田俊策; 吕仲贤; 王国荣; 郑许松; 徐红星
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-12-28
Filing date: 2017-12-28
Publication date: 2018-04-13
Anticipated expiration: 2037-12-28
Also published as: CN107904318B

Abstract

本发明公开了一种基于分子生物学的黄腿螯蜂的鉴别引物及方法。所述的鉴别引物包括CBYF和CBYR，其序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。该方法包括以下步骤：提取待检测样本的基因组DNA作为PCR的模板；对待检测样本基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物并进行电泳分离鉴定；于342bp处观察到条带，则该待测样本为黄腿螯蜂；否则，则该待测样本不是黄腿螯蜂。本发明可以简单快速有效的在分子生物学水平对黄腿螯蜂进行分子鉴定。

Description

一种基于分子生物学的黄腿螯蜂的鉴别引物及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种基于分子生物学的黄腿螯蜂的鉴别引物及方法。

背景技术

黄腿螯蜂(Pseudogonatopus flavifemur)属于膜翅目肿腿蜂总科(Bethyloidea)螯蜂科(Dryinidae)，雌雄异形的外寄生蜂。雌虫无翅，咀嚼式口器，不仅寄生寄主致死还主动捕获取食寄主致死，是十分具有生物防治潜力的天敌。

稻田中还有其他3种常见的螯蜂，包括黑腹螯蜂(Haplogonatopus atratus)、稻虱红螯蜂(Haplogonatopus japonicus)和双色螯蜂(Echthrodelphax bicolor)。这4种螯蜂是水稻重要害虫稻飞虱(包括褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱)的寄生性天敌，由于螯蜂兼具寄生性和捕食性，对稻飞虱的发生具有较好的抑制作用，特别是黄腿螯蜂喜好寄生和取食近年频繁爆发为害的褐飞虱，对褐飞虱的为害具有十分良好的控制作用。但是由于螯蜂的雌雄虫在形态上十分相似，特别是雄虫形态上基本无法区分，且寄生飞虱后其幼虫形成的幼虫囊即使在显微镜下也能难区分。因此，目前只能通过专业的昆虫分类专家对其进行形态学上的区分。

物种鉴定难的现状限制了对黄腿螯蜂的进一步研究和利用，如在调查田间稻飞虱被螯蜂寄生率时就很难明确黄腿螯蜂所占的比例，或是在田间采集到螯蜂茧未能羽化或羽化出雄蜂也非常难鉴定为何种螯蜂。为了解决这一难题，需要寻找一找分子生物学区分方法进行鉴别。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种基于分子生物学的黄腿螯蜂的鉴别引物及方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种基于分子生物学的黄腿螯蜂的鉴别引物，包括CBYF和CBYR，其序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明还公开了一种基于分子生物学的黄腿螯蜂的鉴别方法，包括以下步骤：

步骤1、提取待检测样本的基因组DNA作为PCR的模板；

步骤2、对待检测样本基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物并进行电泳分离鉴定；

步骤3、于342bp处观察到条带，则该待测样本为黄腿螯蜂；

否则，则该待测样本不是黄腿螯蜂。

进一步地，所述PCR扩增体系如下：PCR体系25μL，包括ddH₂O 9.5μL、2*Taq PCRMaster Mix：12.5μL、待检测样本DNA模板：1.0μL、引物CBYF:1.0μL、引物CBYR：1.0μL。

进一步地，所述PCR扩增程序为：94℃下预变性5min，94℃下变性30s，62℃下退火30s，72℃下延伸1min，35个循环；循环结束后，72℃下延伸10min，最后反应终止在4℃。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明不需要传统分类相关领域的专业分类知识。

2)本发明可以简单快速有效的在分子生物学水平对黄腿螯蜂进行分子鉴定。

3)本发明成本低廉、操作简单、鉴定准确率高。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明设计黄腿螯蜂特异性引物用的4种螯蜂的Cytb基因比对结果；

图2是是本发明黄腿螯蜂Cytb基因特异性引物的验证，其中，M：Marker；1：黄腿螯蜂；2：黑腹螯蜂；3：红螯蜂；4：双色螯蜂；5：褐飞虱；6：白背飞虱；7：灰飞虱；

图3是本发明田间螯蜂样本检验结果，其中，M：Marker；1：L1；2：L2；3：L3；4：L4；5：L5；6：L6；7：P1；8：P2；9：P3；10：P4。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1基于分子生物学的黄腿螯蜂的鉴别方法的构建

步骤1、采用杭州爱思进的AxyPrep基因组DNA小量试剂盒提取样本基因组DNA，具体操作如下：

(1)将已经过形态学特征鉴定的1头黄腿螯蜂雌成虫、1头黑腹螯蜂雌成虫、1头红螯蜂雌成虫和1头双色螯蜂雌成虫，分别放入1.5ml离心管中，加入350μl Buffer PBS和0.9μl RNase A后充分研磨30s。

(2)收集350μl研磨好的组织匀浆并转入2ml离心管。如匀浆体积不足350μl，补充PBS至350μl。加入150μl Buffer C-L和20μl蛋白酶K。立即漩涡振荡1min混合均匀。短暂离心后,将离心管置56℃水浴10min。

(3)加入350μl Buffer P-D，漩涡振荡30s混合均匀，12,000×g离心10min。

(4)将DNA制备管置于2ml离心管中，将步骤3中的混合液移至制备管中，12，000×g离心1min。

(5)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入500μl Buffer W1，12，000×g离心1min。

(6)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入700μl Buffer W2，12，000×g离心1min，以同样的方法，用700μl Buffer W2再洗涤一次。

(7)弃滤液，将制备管置回原来的2ml离心管中，12，000×g离心1min。

(8)将DNA制备管置于另一洁净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加100-200μlEluent或去离子水，室温静置1min，12，000×g离心1min洗脱DNA。离心管中液体即为基因组DNA。

步骤2、PCR扩增体系的配制

使用25μl的PCR反应体系，包括：2.5μl的10×PCR Buffer(Mg²⁺Free)、2μl的dNTPs(2.5mmol/L)、1.5μl的MgCl₂(25mmol/L)、上游和下游引物(10μmol/L)各1μl(F：5’-TATGTACTACCATGAGGACAAATATC-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，R：5'-ATTACACCTCCTAATTTATTAGGAAT-3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)、样品基因组DNA1μl、0.125μl的Taq DNA Polymerase，再加灭菌水补足25μl。

步骤3、PCR扩增程序

94℃5min；95℃30s、62℃20s、72℃1min(35个循环)；72℃5min；然后进行PCR扩增。

步骤4、扩增产物测序

将步骤3得到的扩增产物纯化后加入ABI3730XL测序仪中进行序列测定。

步骤5、序列分析及特异性引物设计

将样品序列导入GENEDOC软件中去掉多余序列后，分别得到序列Haplogonatopusatratus、序列Haplogonatopus japonicas、序列Echthrodelphax bicolor和序列Pseudogonatopus flavifemur。将4种螯蜂的序列进行比对分析(图1)，根据黄腿螯蜂与其他3种螯蜂序列的差异设计黄腿螯蜂的特异性引物CBYF5’-GGGTCTGATAATATGTATGGGT-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；CBYR，5’-TTTTGGGGAGCAACAGTAAT-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

步骤6、判定结果

采用PCR体系25μL，包括ddH₂O 9.5μL、2*Taq PCR Master Mix：12.5μL、Template(DNA模板)：1.0μL、引物CBYF:1.0μL、引物CBYR：1.0μL；PCR扩增程序如下：94℃下预变性5min，94℃下变性30s，65℃下退火30s，72℃下延伸1min，35个循环；循环结束后，72℃下延伸10min，最后反应终止在4℃，得到PCR产物。将此PCR产物以1.5％琼脂糖凝胶(含EB)电泳分离，于342bp(其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)处有特异性条带的为黄腿螯蜂样品。

实施例2黄腿螯蜂特异引物有效性验证

(1)将已经过形态学特征鉴定的1头黄腿螯蜂雌成虫、1头黑腹螯蜂雌成虫、1头红螯蜂雌成虫、1头双色螯蜂雌成虫、褐飞虱1头、白背飞虱1头和灰飞虱1头，分别放入1.5ml离心管中，加入350μl Buffer PBS和0.9μl RNase A后充分研磨30s。

步骤2、PCR扩增

采用PCR体系25μL，包括ddH₂O 9.5μL、2*Taq PCR Master Mix：12.5μL、Template(DNA模板)：1.0μL、引物CBYF:1.0μL、引物CBYR：1.0μL；PCR扩增程序如下：94℃下预变性5min，94℃下变性30s，65℃下退火30s，72℃下延伸1min，35个循环；循环结束后，72℃下延伸10min，最后反应终止在4℃。

步骤3、电泳分离

利用黄腿螯蜂的CBY特异性引物对对4种螯蜂和3种飞虱进行PCR扩增，PCR产物以1.5％琼脂糖凝胶(含EB)电泳分离，仅在黄腿螯蜂的样品中出现了特异性片段，产物大小在350bp左右，而其他3种螯蜂(黑腹螯蜂、红螯蜂和双色螯蜂)和3种飞虱(褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱)均未能扩增出任何条带(图2)。

实施例3

利用本发明提供的特异性引物对待检测样本是否为黄腿螯蜂进行验证。

2016年我们在田间采集到6份寄生螯蜂幼虫标本(L1、L2、L3、L4、L5和L6)和4份螯蜂茧的标本(P1、P2、P3和P4)，非传统分类学教育背景的人通过形态学观察无法确定是否为黄腿螯蜂，利用实施例2中的鉴别方法对待检测样本(L1、L2、L3、L4、L5、L6、P1、P2、P3和P4)进行鉴定。

检测结果显示，六份幼虫样品中L1、L2、L3、L5和L6是黄腿螯蜂而L4不是黄腿螯蜂；四份茧样品中P2和P4是黄腿螯蜂，P1和P3不是黄腿螯蜂(图3)。

同时，在样品提取DNA之前，所有幼虫和茧样品先经由分类学专业人员通过形态学区分进行比较，发现通过形态学区别的结果于本发明检验的结果是一样的，这进一步说明采用本发明可以快速准确的区分黑腹螯蜂和稻虱红螯蜂。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 浙江农业科学院

<120> 一种基于分子生物学的黄腿螯蜂的鉴别引物及方法

<130> 2017

<141> 2017-12-28

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

gggtctgata atatgtatgg gt 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

ttttggggag caacagtaat 20

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

tatgtactac catgaggaca aatatc 26

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

attacacctc ctaatttatt aggaat 26

<210> 5

<211> 342

<212> DNA

<213> 黄腿螯蜂(Pseudogonatopus flavifemur)

<400> 5

gggtctgata atatgtatgg gttaaaaaat actaatattc ttaataatat aattattatt 60

ataaatccta gaatgtcttt gatagtaaaa taaatatgga aaggaatttt atataagttt 120

cttttagatc caagaggatt tgaagaacca gtttgatgaa gaaaagttaa atggattaaa 180

attaatatta taataataaa aggtaaaata aaatgaaaag aataaaatcg atttaatgtt 240

gcattattaa ttgaaaatcc tcctcataat caagcaacaa tctgatcacc aattatagga 300

atagctgaaa ttaaatttgt aattactgtt gctccccaaa aa 342

Claims

1.一种基于分子生物学的黄腿螯蜂的鉴别引物，其特征在于，包括CBYF和CBYR，其序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

2.一种基于分子生物学的黄腿螯蜂的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、提取待检测样本的基因组DNA作为PCR的模板；

步骤3、于342bp处观察到条带，则该待测样本为黄腿螯蜂；

否则，则该待测样本不是黄腿螯蜂。

3.根据权利要求2所述的鉴别方法，其特征在于，所述PCR扩增体系如下：PCR体系25μL，包括ddH₂O 9.5μL、2*Taq PCR Master Mix：12.5μL、待检测样本DNA模板：1.0μL、引物CBYF:1.0μL、引物CBYR：1.0μL。

4.根据权利要求2所述的鉴别方法，其特征在于，所述PCR扩增程序为：94℃下预变性5min，94℃下变性30s，62℃下退火30s，72℃下延伸1min，35个循环；循环结束后，72℃下延伸10min，最后反应终止在4℃。