CN104911182A

CN104911182A - 鱼类线粒体全基因组dna扩增

Info

Publication number: CN104911182A
Application number: CN201510292241.2A
Authority: CN
Inventors: 李炯棠; 薛尉; 肖贵宝; 孙效文
Original assignee: China Aquatic Scientific Research Institute
Current assignee: China Aquatic Scientific Research Institute
Priority date: 2015-06-01
Filing date: 2015-06-01
Publication date: 2015-09-16
Anticipated expiration: 2035-06-01
Also published as: CN104911182B

Abstract

本发明提供了鱼类线粒体全基因组DNA扩增。首先本发明提供了鱼类线粒体全基因组DNA扩增的引物对，本发明还提供了利用上述引物组合来扩增鱼类线粒体全基因组DNA的方法。通过本发明提供的扩增方法，能够成功地获得各种鱼类线粒体基因组的克隆产物。并且本发明设计和筛选得到的引物对具有扩增性能好、产生副产物较少等优秀性质。

Description

鱼类线粒体全基因组DNA扩增

技术领域

本发明涉及遗传学和分子生物学领域，具体地涉及鱼类线粒体基因组DNA扩增的引物对以及扩增方法。

背景技术

鱼类线粒体基因组(mtDNA)是细胞质中具自主复制、转录和翻译能力的闭合环状双链DNA，包括一条重链和一条轻链。鱼类线粒体基因组主要包括37个编码基因(13个疏水蛋白基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因)、1个负责复制和转录起始的控制区(D-loop)和1个轻链复制起始区。疏水蛋白基因编码的多肽包括了与线粒体内膜相结合的酶复合体的亚单位:细胞色素b(Cyt b)、2个ATP合成酶的亚单位(ATPase6和ATPase8)、3个细胞色素c(Cyt c)氧化酶的亚单位(COX1、COX2和COX3)和7个氢化辅酶I(NADH)脱氢酶的亚单位(ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5和ND6)。2个rRNA基因为12SrRNA和16SrRNA基因。22个tRNA基因编码的氨基酸为:Pro、Thr、Glu、Leu、Ser、His、Arg、Gly、Lys、Asp、Ser、Tyr、Cys、Asn、Ala、Trp、Met、Ile、Glu、Leu、Val和Phe。

同核基因组相比，mtDNA上的基因排列极其紧凑，且无内含子，编码效率较高。线粒体基因组能以自身为模板进行复制，能转录生成信使RNA(mRNA)、转运RNA(tNA)和核糖体RNA(rRNA)，也能编码合成一些维持自身结构和功能所必需的蛋白质，具有很大的独立性。同时，线粒体的遗传行为受到核基因的调控，这种调控主要是通过向线粒体输入核DNA编码蛋白质和一些小的RNA，特别是tRNA来实现的。

鱼类线粒体中蛋白序列极为保守，几乎完全一样。如上所述的37个编码基因(13个疏水蛋白基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因)，在鱼类中非常保守。但是这些蛋白所对应的核酸序列具有较高的突变率。同样，非编码基因区的保守性也非常低。大量研究表明线粒体DNA突变频率较核基因组高10倍以上。

线粒体基因组是一种位于核外的胞质遗传系统，几乎仅遵从母系遗传，一般不发生重组，父本线粒体在受精过程中被迅速降解或此后不久在复制时被丢失了。线粒体基因组有相对恒定的进化速率，因此在种内水平及种间水平的分子生态学特别是分子系统地理学的研究中，是广泛应用的主流分子标记。另外，线粒体基因组还是进行物种鉴定的重要资源。通过扩增获得未知物种的线粒体基因组，并与其他物种已有序列比对，可以了解该物种所属。

目前已经公开有针对鱼类线粒体部分区域的扩增方法，比如，针对线粒体COI序列的通用引物和扩增方法，和D-loop区域扩增引物及其设计方法。但是这些方法仅能获得鱼类线粒体基因组较短片段。

目前常用的鱼类线粒体DNA的一种扩增方法，是利用近源物种的mtDNA序列设计引物。该方法成功率较高，但是依赖于近源物种的mtDNA信息。

另一种常用的鱼类线粒体DNA扩增方法，是利用二代测序技术方法测序后组装。在提取核DNA和mtDNA后，对全基因组序列进行高通量测序并进行组装。这种方法不依赖于近源物种的mtDNA信息，对于未知物种的mtDNA比较有效。但是这种方法要求有高深度的基因组测序，成本高；同时，对全基因组组装技术要求较高；测序和组装结果主要是核基因组DNA。

考虑到扩增鱼类全长线粒体基因组的重要性，有必要开发一种全新的获得鱼类线粒体基因组的方法。

发明内容

为克服上述技术缺陷，本发明的一个目的是提供了一种用于鱼类线粒体全基因组序列扩增的引物对。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的一个方面，提供了用于扩增鱼类线粒体全基因组DNA的引物对，所述引物对包括以下1)～4)中的至少一对引物，优选含有1)～4)中的所有4对引物：

1)为序列表中的序列1和序列2所示的核苷酸序列；

2)为序列表中的序列3和序列4所示的核苷酸序列；

3)为序列表中的序列5和序列6所示的核苷酸序列；

4)为序列表中的序列7和序列8所示的核苷酸序列。

本发明的另一个目的是提供了利用上述引物对来进行扩增鱼类线粒体全基因组DNA的方法。

本发明的一个优选方面，所述的扩增方法包括以鱼类DNA为模板，进行PCR扩增。

进一步地，所述PCR扩增时，各引物对的退火温度为48～60℃，优选为56℃和58℃。

本发明还提供了含有上述引物对的制剂。

本发明还提供了含有上述的引物对的试剂盒。

进一步地，所述试剂盒用于鱼类线粒体全基因组DNA的扩增。

本发明提供的鱼类线粒体全基因组DNA扩增的简并性引物组合，适用于鱼类线粒体基因组的扩增，该引物对数适中，可以避免引物对数少对DNA模板的高要求，也可简化后续的PCR和纯化操作步骤。本发明进一步提供的鱼类线粒体全基因组DNA扩增方法，扩增长度适中，对Taq酶的要求不高，主流的Taq酶都可用于扩增。该方法可以检测线粒体所有基因，能够应用于鱼类基因组进化研究、物种分类、线粒体基因突变以及鱼类物种鉴定。

此外，通过本发明提供的方法得到的扩增产物经过纯化回收、测序后，将为鱼类的种内水平及种间水平的分子生态学、分子系统地理学的研究、鱼种的保种工作以及种群遗传多样性的保护具有非常重要的意义。

附图说明

图1为按照本发明方法得到的企鹅灯mtDNA扩增产物凝胶电泳图；其中，从左到右依次是分子标记物，引物1)扩增结果的条带，引物2)扩增结果的条带，引物3)扩增结果的条带，引物4)扩增结果的条带；

图2按照本发明方法得到的硬头鳟mtDNA扩增产物凝胶电泳图；其中，从左到右依次是分子标记物，引物1)扩增结果的条带，引物2)扩增结果的条带，引物3)扩增结果的条带，引物4)扩增结果的条带。

图3为按照本发明方法得到的虹鳟mtDNA扩增产物凝胶电泳图；其中，从左到右依次是分子标记物，引物1)扩增结果的条带，引物2)扩增结果的条带，引物3)扩增结果的条带，引物4)扩增结果的条带；

图4为按照本发明方法得到的鲫鱼mtDNA扩增产物凝胶电泳图；其中，从左到右依次是分子标记物，引物1)扩增结果的条带，引物2)扩增结果的条带，引物3)扩增结果的条带，引物4)扩增结果的条带；

图5为按照本发明方法得到的金鳟鱼mtDNA扩增产物凝胶电泳图；其中，从左到右依次是分子标记物，引物1)扩增结果的条带，引物2)扩增结果的条带，引物3)扩增结果的条带，引物4)扩增结果的条带；

图6为按照本发明方法得到的鲤鱼mtDNA扩增产物凝胶电泳图；其中，从左到右依次是分子标记物，引物1)扩增结果的条带，引物2)扩增结果的条带，引物3)扩增结果的条带，引物4)扩增结果的条带。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

本发明基于发现而合成了能够扩增出线粒体全基因组碱基的4对兼并性PCR引物：

(1)鱼类mtDNA在部分区域在核酸序列上高度保守，这些区域在不同物种中可能仅有几个碱基的差异。因此可以通过设计兼并性引物，优化引物组合和扩增条件，获得这些保守区域。(2)这些高度保守区域是分散在mtDNA的不同位置，而且扩增长度不一。通过筛选保留尽可能长的扩增区域，能够在减少引物对数的情况下获得鱼类的全长mtDNA序列。(3)选用引物对数适中，可以避免引物对数少对DNA模板的高要求，也可以避免引物对数多导致操作步骤繁琐。

本发明所涉及的这4对PCR引物经实验证明，能够对线粒体全基因组进行特异性扩增。

这4对引物见表1：

表1 4对简并性引物组合

其中，N代表A、T、C、G

这4对通用引物的PCR体系以及预扩增长度如表2。

表2 4对PCR引物扩增条件

由于不同鱼类线粒体长度不一，因此预期长度也不一样。

选用上述线粒体全基因组测序用4对PCR引物，将上下游引物稀释成10μmol/L，作为工作液。

PCR反应体系：体系总体积为20μL，其中含DNA模板1μL(含至少50ng全基因组DNA)，目的片段的相应上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，2×Taq酶反应混合液10μL(反应混合液包括0.1U/μL Taq酶,2×PCR反应缓冲液，3mmol/L MgCl2，和0.4mmol/L dNTP)，ddH₂O 8μl。

引物的PCR扩增基础参数为：94℃变性45s，根据PCR引物不同确定退火温度进行30s，72℃延伸3～5分钟，共计36个循环(表2列出的PCR扩增条件)。

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

实施例1：

本发明线粒体全基因组测序用PCR引物对见表1。

PCR扩增过程为：

线粒体全基因组测序选用上述包含了A、T、C、G所有组合的4对PCR引物，将上下游引物稀释成10μmol/L，作为工作液。PCR反应体系：体系总体积为20μL，其中含DNA模板1μL(含至少50ng全基因组DNA)，目的片段的相应上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，2×Taq酶反应混合液10μL(反应混合液包括0.1U/μL LA-Taq酶,2×PCR反应缓冲液，3mmol/L MgCl2，和0.4mmol/L dNTP)，ddH2O 8μl。

其中，上述DNA模板分别是企鹅灯、硬头鳟、虹鳟、鲫鱼、金鳟鱼和鲤鱼的基因组DNA，提取线粒体DNA的方法参见常规操作说明书。

本实验PCR反应所用试剂均为通用试剂，PCR产物的检测采用常规的方法。在本实验中，PCR扩增参数见表3。

表3 实施例的PCR扩增条件

上述几种鱼类的PCR扩增产物大小采用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果见图1～图6，从图中可见，使用本发明提供的引物对对6种鱼类进行扩增，能确保PCR扩增成功，并且每种引物扩增的单一性非常好，特异性也非常好，并且长度符合预期扩增长度。

实施例2

为验证扩增结果是否正确，我们挑选企鹅灯和硬头鳟的扩增产物分别进行测序。我们将PCR扩增产物进行纯化回收，并进行Sanger测序。对企鹅灯的4段测序结果进行拼接组装以获得完整线粒体基因组序列，其序列见序列表中的序列9所示。硬头鳟线粒体基因组序列组装也如上操作，其序列见序列表中的序列10所示。

企鹅灯线粒体全基因组序列长度为16524bp，与大部分鱼类线粒体基因组长度区间一致。该序列为第一次公开的企鹅灯线粒体全基因组序列。同源序列比对发现，该序列最相似的序列为盲鱼(Astyanax mexicanus)线粒体，序列相似性为80％，提示我们企鹅灯与墨西哥脂鲤之间的物种近缘关系。

硬头鳟线粒体全基因组序列长度为16653bp。硬头鳟为洄游型虹鳟鱼，是其一个亚种。将测序得到的序列与参考序列(16656bp)比对，长度仅相差3个碱基，覆盖度达到100％，共检测到33个差异位点，具体的差异位点结果见表4。

表4.硬头鳟线粒体基因组与虹鳟线粒体基因组差异位点

从表4中可见，通过本发明提供的线粒体DNA扩增方法得到的硬头鳟线粒体全基因组序列与亚种内其他的鱼类线粒体全基因组序列差异位点非常少，可见该方法能有效扩增出鱼类线粒体全基因组序列。

Claims

1.用于扩增鱼类线粒体全基因组DNA的引物对，其特征在于，所述引物对包括以下1)～4)中的至少一对引物，优选含有1)～4)中的所有4对引物：

1)为序列表中的序列1和序列2所示的核苷酸序列；

2)为序列表中的序列3和序列4所示的核苷酸序列；

3)为序列表中的序列5和序列6所示的核苷酸序列；

4)为序列表中的序列7和序列8所示的核苷酸序列。

2.一种使用权利要求1所述的引物对来进行扩增鱼类线粒体全基因组DNA的方法。

3.根据权利要求2所述的扩增方法，其特征在于，所述的扩增方法包括以鱼类DNA为模板，进行PCR扩增。

4.根据权利要求2或3所述的扩增方法，其特征在于，所述PCR扩增时，各引物对的退火温度为48～60℃，优选为56℃或58℃。

5.含有权利要求1所述的引物对的制剂。

6.一种包含权利要求1所述的引物对的试剂盒。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于鱼类线粒体全基因组DNA的扩增。