CN110592202A - 基于线粒体标记的黄鲫群体遗传多样性的评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供基于线粒体标记的黄鲫群体遗传多样性的评价方法，属于海洋生物保护领域，包括以线粒体DNA控制区为分子标记，对黄鲫群体的DNA进行PCR扩增，对PCR扩增的产物进行纯化及测序；其中，采用乙醇乙酸钠纯化法对PCR扩增的产物进行纯化，具体步骤包括：在所述PCR扩增产物中依次加入乙酸钠，无水乙醇，氯代十六烷基吡啶，二硫苏糖醇，涡旋振荡，静置，离心，去上清；加入70％乙醇，离心，去上清，室温放置使乙醇自然挥发。本发明能够减少PCR产物损失量，提高测序效率，提高测序结果的准确率，提高黄鲫群体遗传多样性检测结果的可靠性。
Description
技术领域
本发明属于海洋生物保护领域，具体涉及基于线粒体标记的黄鲫群体遗传多样性的评价方法。
背景技术
黄鲫(Setipinna tenuifilis Valenciennes)隶属于鲱形目(Clupeiformes)，鳀科(Engraulidae)，黄鲫属，是一种常见的小型鳀科鱼类。分布于南至印度洋北部沿海，北至中国、朝鲜近海。中国沿海均产。黄鲫作为一种小型鳀科鱼类逐渐代替蓝点马鲛等传统经济鱼类成为重要经济种类，其承受的捕捞压力逐年增加，黄鲫的自然资源量呈显著下降状态。如何对黄鲫资源进行合理的开发利用，并进行科学的资源保护和修复工作，已成为亟待解决的问题。
鱼类是脊椎动物中最为原始、种类数量最大的类群。近年来，随着分子生物技术的发展及其向生物学领域的渗透，使用分子标记方法对鱼类的遗传和进化进行分析研究已成为热门课题。在分子水平上，选择合适的分子标记是有效地研究鱼类的遗传和进化的关键所在。鱼类线粒体DNA与其他许多脊椎动物的mt DNA一样，具有以下特点：严格的母系遗传；几乎不发生重组；分子结构简单；进化速率较快；不同区域进化速率存在差异。上述特点使鱼类线粒体DNA成为分子群体遗传学和分子系统地理学研究的重要标记手段。以线粒体DNA作为分子标记探讨鱼类的群体遗传和系统发育已取得许多结果。为鱼类种质资源的合理利用和科学保护，提供重要的理论依据。
现有技术如授权公告号为CN 103387980 B的中国发明专利，提供一种三疣梭子蟹微卫星位点及多态性引物，即提供5个三疣梭子蟹的微卫星位点，其核苷酸序列为SEQ IDNO:1-5中的任一个。本发明还提供从上述微卫星位点设计的引物，用于三疣梭子蟹种群遗传多样性检测。该发明从三疣梭子蟹公共数据库中筛选出5个微卫星位点，并根据微卫星两端的侧翼序列设计特异性引物，扩增结果具有高度的多态性和稳定性，可用于三疣梭子蟹的群遗传多样性检测、亲缘关系鉴定，遗传连锁图谱的构建以及分子标记辅助育种领域。
发明内容
本发明的目的在于提供基于线粒体标记的黄鲫群体遗传多样性的评价方法，该方法能够减少PCR产物损失量，提高测序效率，提高测序结果的准确率，提高黄鲫群体遗传多样性检测结果的可靠性。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
提供基于线粒体标记的黄鲫群体遗传多样性的评价方法，包括：以线粒体DNA控制区为分子标记，对黄鲫群体的DNA进行PCR扩增，对PCR扩增的产物进行纯化及测序，进行遗传多样性分析；其中，采用乙醇乙酸钠纯化法对PCR扩增的产物进行纯化，具体步骤包括：在PCR扩增产物中依次加入乙酸钠、无水乙醇、氯代十六烷基吡啶、二硫苏糖醇，涡旋振荡，静置，离心，去上清；加入70％乙醇，离心，去上清，室温放置使乙醇自然挥发。通过对乙醇/醋酸钠法进行优化，能够减少PCR产物损失量，提高PCR产物的纯化效果，测序图谱清晰、波峰适中、无杂带，能够提高测序效率，提高测序结果的准确率，提高黄鲫群体遗传多样性检测结果的可靠性。
在某些实施方式中，采用苯酚-氯仿法对上述黄鲫群体进行DNA提取；其中，DNA的材料来源为肌肉组织，肌肉组织保存在92-95％的乙醇中。肌肉组织中具有较少的DNA酶，提取到的DNA质量较好。
在某些实施方式中，上述DNA提取前，先用蛋白酶K对肌肉组织进行消化。用蛋白酶K消化肌肉组织后再用酚氯仿抽提DNA时，核酸释放充分，且不容易出现蛋白污染。
在某些实施方式中，上述PCR扩增的反应体系为：DNA聚合酶0.25μL，模板DNA 1μL，正向引物1μL，反向引物1μL，dNTP 2μL，10×PCR buffer 2.5μL，补加去离子水至25μL。本发明提供的PCR扩增的反应体系具有较高的反应效率，能够减少错配和非特异性扩增现象的发生，增加反应产物的特异性，提高测序准确率。
在某些实施方式中，上述正向引物为：5’-CACTCCTAACTCCCGGAGCTA-3’；上述反向引物为：5’-GGCCCAAAGATTACTGCGTAG-3’。该PCR扩增引物不会发生互补，形成引物二聚体，且能与特异片段很好的配对结合，有效的扩增出特异性目的序列。
在某些实施方式中，上述测序为双向测序。双向测序法效率高、灵敏度高且准确性极高。
在某些实施方式中，上述黄鲫群体遗传多样性的分析内容包括：检测不同群体黄鲫所测序列中目的序列的单倍型，多态位点数，转换和颠换值，并计算单倍型多样性、核苷酸多样性、平均核苷酸差异数。
在某些实施方式中，上述目的序列为非重复序列。
在某些实施方式中，采用Arlequin 3.0软件对上述单倍型多样性、核苷酸多样性、平均核苷酸差异数进行计算。
本发明还提供上述评价方法在黄鲫的资源保护和管理中的用途。检测黄鲫群体遗传多样性对黄鲫的遗传基础、分化规律、进化过程的研究和群体遗传改良、合理利用、黄鲫资源的保护都有重要意义。
本发明的有益效果为：
1)本发明通过对PCR扩增产物的纯化方法进行优化，能够减少PCR产物损失量，提高PCR产物的纯化效果，测序图谱清晰、波峰适中、无杂带，能够提高测序效率，提高测序结果的准确率，提高黄鲫群体遗传多样性检测结果的可靠性；
2)本发明对DNA提取和PCR扩增条件的优化，减少错配和非特异性扩增现象的发生，增加反应产物的特异性，提高测序准确率。
附图说明
图1为本发明的黄鲫群体的线粒体控制区非重复序列变异位点图；
图2为本发明的实施例1、对比例1、对比例2、对比例3的PCR产物纯化后的损失率图；
图3为本发明的实施例1、对比例1、对比例2、对比例3中的部分测序图。
附图标记说明：“·”代表与单倍型Hap1相应位点相同的碱基。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
本试验所用221尾黄鲫样品于2014-2018年采自中国沿海7个地点，分别为：东营、烟台、舟山、象山、宁海、黄海海域、威海。各地区鱼样群体编号分别为DY、YT、ZS、XS、NH、HH、WH。分别剪活体肌肉用95％乙醇固定后，置于-80℃保存。
DNA提取：将样品从-80℃条件下取出，置于冰盒中，剪取0.05g样品，用无菌水冲洗，除去样品表面的乙醇；将样品放入1.5mL离心管中，置于冰上，加入500μL缓冲液(100mmol/L NaCl；10mmol/L Tris-Cl,pH8.0；1mmol/L EDTA,pH8.0)、50μL 10％SDS溶液、10μL 20mg/μL的蛋白酶K，用研磨棒进行研磨，56℃水浴，期间每10min上下颠倒混匀一次，至溶液变清亮；待溶液冷却至室温后，分别加入250μL饱和苯酚和250μL氯仿和异戊醇(v/v＝24/1)，轻柔晃动10min，室温12000rpm离心5min，取上清，重复提取1次。将上层液体转移到新的1.5mL离心管中，加入500μL氯仿-异戊醇，轻柔晃动10min，室温12000rpm离心5min，取上清，再重复上述步骤1次，取上清转移到新的1.5mL离心管中，加入50μL 3mol/L NaAc和1mL无水乙醇，-20℃下放置10min，12000rpm离心10min，得到核酸沉淀；用预冷的75％乙醇漂洗两次，预冷的无水乙醇洗涤沉淀，自然干燥，加入60μL TE缓冲液，再加入终浓度为0.05mg/mL的RNA酶以除去RNA。在10000rpm条件下离心10min后弃上清液，晾干后在离心管中加入100μL去离子水，溶解DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，使用Qubit荧光仪测量DNA浓度，将样品稀释至100ng/μL。
PCR扩增：采用正向引物：5’-CACTCCTAACTCCCGGAGCTA-3’和反向引物：5’-GGCCCAAAGATTACTGCGTAG-3’对所用样本的线粒体DNA控制区进行扩增。PCR扩增反应采用30μL反应体系：DNA聚合酶0.25μL，模板DNA 1μL，正向引物1μL，反向引物1μL，dNTP 2μL，10×PCR buffer 2.5μL，补加去离子水至25μL。反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性45s，52℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保温。
纯化：采用乙醇乙酸钠法对PCR扩增的产物进行纯化，具体步骤包括：在PCR扩增产物中依次加入2μL 3mol/L乙酸钠、50μL无水乙醇、2μL 140mmol/L氯代十六烷基吡啶、5μL1.6mol/L二硫苏糖醇，涡旋振荡3次，室温静置20min，4℃下7000rpm离心45min，去上清；加入70％乙醇，4℃下7000rpm离心20min，去上清，室温放置使乙醇自然挥发，再加入10μL甲酰胺溶解DNA。
测序：使用ABI Prism 3730型DNA序列分析仪对纯化的PCR产物进行正反链测序，测序引物为扩增引物，以纯化后的PCR扩增的产物为模板，测序反应采用10μL反应体系：模板20ng，BigDye Mix 1.5μL，测序引物0.5μmol/L，反应条件为：96℃预变性2min，96℃变性10s，55℃退火10s，60℃延伸4min，35个循环，4℃保温。测序反应产物用70％乙醇沉淀法进行纯化。
线粒体DNA控制区序列数据处理：利用DNAStar软件包对序列进行拼接，并辅以人工校正，确保序列的准确性。采用Arlequin 3.0软件检测不同群体黄鲫所测序列中目的序列的单倍型(Hap)，特有的单倍型(pHap)、多态位点数(S)，转换和颠换值，并计算单倍型多样性(h)、核苷酸多样性(π)、平均核苷酸差异数(k)。使用MEGA 5.0软件求出序列的核苷酸组成。
共测序获得221尾黄鲫的线粒体控制区序列，线粒体控制区序列长度大小为486-567bp，在该片段的前段发现串联重复序列，将非重复序列进行比对和校正，最后用于群体数据分析的序列长度为317bp，图1为黄鲫的线粒体控制区序列变异位点，由图1可以看出，317个位点中，多态位点38个，占位点总数的11.99％，共有32个转换，7个颠换，其中包括分布在第23、38、52、55、80、91、120、189、238、299、311位点上的11个简约信息位点和分布在第18、31、43、46、59、64、72、99、112、133、145、146、167、173、179、198、202、216、226、261、266、274、277、288、295、303、306位点上的27个单一可变位点。经MEGA 5.0软件分析，得到A、T、C、G碱基的平均含量分别为41.24％、31.1％、18.57％、9.09％，G碱基相对较缺乏，A+T含量(72.34％)明显高于G+C含量(27.66％)，表明出现了明显的AT偏好和很强的反G偏倚，这与大多数鱼类的特性是一致的。
基于线粒体控制区获得的种群遗传多样性见表1，在7个地理种群的146条序列中共发现36种单倍型，其中31个单倍型为单个采样点独享的单倍型，其余5个单倍型为2个或多个采样点共享的单倍型，单倍型Hap32由7个采样点所共享。在特有的单倍型中，东营(DY)5种、烟台(YT)3种、舟山(ZS)8种、象山(XS)4种、宁海(NH)4种、黄海海域(HH)2种、威海(WH)5种。从各个黄鲫种群的角度看，其遗传多样性水平并不一致，象山(XS)黄鲫种群的单倍型多样性和核苷酸多样性都是最低的(0.462±0.023,0.002±0.001)，舟山(ZS)黄鲫种群的单倍型多样性和核苷酸多样性都是最高的(0.805±0.040,0.009±0.005)，东营(DY)黄鲫种群的单倍型多样性和核苷酸多样性次之。
表1 7个群体的遗传多样性参数
对比例1：
采用乙醇乙酸钠法对PCR扩增的产物进行纯化时，未加入氯代十六烷基吡啶，其他部分与实施例1完全一致。
对比例2：
采用乙醇乙酸钠法对PCR扩增的产物进行纯化时，未加入二硫苏糖醇，其他部分与实施例1完全一致。
对比例3：
采用乙醇乙酸钠法对PCR扩增的产物进行纯化时，未加入氯代十六烷基吡啶和二硫苏糖醇，其他部分与实施例1完全一致。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
图2为实施例1、对比例1、对比例2、对比例3中PCR产物进行纯化后的损失率。由图2可以看出，实施例1中PCR产物的损失率明显低于对比例1、对比例2、对比例3，这说明，采用乙醇乙酸钠法对PCR扩增的产物进行纯化时，加入氯代十六烷基吡啶和二硫苏糖醇，通过对乙醇/醋酸钠法进行优化，能够减少PCR产物损失率。
图3为实施例1、对比例1、对比例2、对比例3的部分测序图谱。由图3可以看出实施例1核苷酸曲线峰的背景无噪音，每一小峰对应特定碱基，对比例1、对比例2、对比例3的背景噪音杂，信噪比低，序列曲线有噪峰出现，结果不易判读。这说明，采用乙醇乙酸钠法对PCR扩增的产物进行纯化时，加入氯代十六烷基吡啶和二硫苏糖醇，纯化效果较好，纯化后的PCR产物质量较高，测序图谱清晰、波峰适中、无杂带，能够提高测序效率，提高测序结果的准确率，从而提高黄鲫群体遗传多样性检测结果的可靠性。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 基于线粒体标记的黄鲫群体遗传多样性的评价方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cactcctaac tcccggagct a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcccaaaga ttactgcgta g 21
Claims (10)
1.基于线粒体标记的黄鲫群体遗传多样性的评价方法，包括：以线粒体DNA控制区为分子标记，对所述黄鲫群体的DNA进行PCR扩增，对所述PCR扩增的产物进行纯化及测序，进行遗传多样性分析；
其中，采用乙醇乙酸钠纯化法对所述PCR扩增的产物进行纯化，具体步骤包括：在所述PCR扩增产物中依次加入乙酸钠、无水乙醇、氯代十六烷基吡啶、二硫苏糖醇，涡旋振荡，静置，离心，去上清；沉淀中再加入70％乙醇，离心，去上清，室温放置使乙醇自然挥发，即可。
2.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于：采用苯酚-氯仿法对所述黄鲫群体进行DNA提取；
其中，所述DNA的材料来源为肌肉组织，所述肌肉组织保存在92-95％的乙醇中。
3.根据权利要求2所述的评价方法，其特征在于：所述DNA提取前，先用蛋白酶K对所述肌肉组织进行消化。
4.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为：DNA聚合酶0.25μL，模板DNA 1μL，正向引物1μL，反向引物1μL，dNTP 2μL，10×PCR buffer 2.5μL，补加去离子水至25μL。
5.根据权利要求4所述的评价方法，其特征在于：所述正向引物为：5’-CACTCCTAACTCCCGGAGCTA-3’；
所述反向引物为：5’-GGCCCAAAGATTACTGCGTAG-3’。
6.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于：所述测序为双向测序。
7.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于：所述黄鲫群体遗传多样性的分析内容包括：检测所述不同群体黄鲫所测序列中目的序列的单倍型，多态位点数，转换和颠换值，并计算单倍型多样性、核苷酸多样性、平均核苷酸差异数。
8.根据权利要求7所述的评价方法，其特征在于：所述目的序列为非重复序列。
9.根据权利要求7所述的评价方法，其特征在于：采用Arlequin 3.0软件对所述单倍型多样性、核苷酸多样性、平均核苷酸差异数进行计算。
10.权利要求1-9任一项中所述的评价方法在黄鲫的资源保护和管理中的用途。
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