CN108841941B - 利用线粒体nadh5基因精准鉴别金边鲤的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用线粒体NADH5基因精准鉴别金边鲤的方法，该方法包括以下内容：（1）提取待鉴定金边鲤的DNA；（2）利用引物对金边鲤个体DNA模板进行PCR扩增；（3）对扩增产物进行回收；（4）对引物的PCR扩增产物进行克隆并测序；（5）对序列进行比对分析。本发明利用线粒体NADH5基因鉴别金边鲤，发现金边鲤NADH5基因序列与公开提交的鲤鱼序列相似度为99%，即金边鲤属于鲤鱼的一种；但金边鲤序列的247位点和559位点的碱基分别为A和C，与其他鲤鱼对应位点的G和T碱基又有所不同，从而能精准地鉴别出金边鲤。使用本发明的方法鉴别金边鲤，弥补了形态学鉴别的不足，为金边鲤地方品种的保护与解决养殖种的商业纠纷提供了参考。

Description

利用线粒体NADH5基因精准鉴别金边鲤的方法
技术领域
本发明属于鉴定鱼类物种的生物技术领域，具体涉及一种用于鉴别金边鲤和其他鲤鱼的精准方法，实际是利用线粒体NADH5基因精准鉴别金边鲤的方法。
背景技术
鲤鱼学名：Cyprinus carpio。原产亚洲，后引进欧洲、北美以及其他地区，杂食性。鳞大，上腭两侧各有二须，单独或成小群地生活于平静且水草丛生的泥底池塘、湖泊、河流中。从营养价值角度说，鲤鱼的蛋白质不但含量高，而且质量也佳，人体消化吸收率可达96%，并能供给人体必需的氨基酸、矿物质、维生素A和维生素D；每100g肉中含蛋白质17.6g、脂肪4.1g、钙50mg、磷204mg及多种维生素；鲤鱼的脂肪多为不饱和脂肪酸，能很好的降低胆固醇，可以防治动脉硬化、冠心病，因此，多吃鲤鱼可以健康长寿。从药用角度说，鲤鱼性平、味甘，具有健脾养胃，利水消肿，通乳安胎，止咳平喘等作用。可用于脾胃虚弱、食少乏力、脾虚水肿等症。鲤鱼还具有观赏价值。
鲤鱼是我国南北各地广泛分布的鱼类，由于它具有很高的经济价值和改善库塘养殖条件，提高产量的特点，成为养殖家鱼的主要品种。鲤鱼呈柳叶形，背略隆起，嘴上有须，鳞片大且紧，鳍齐全且典型，肉多刺少。鲤鱼的种类很多，按生长水域的不同，鲤鱼可分为河鲤鱼、江鲤鱼、池鲤鱼。
融水苗族自治县位于广西壮族自治区北部，云贵高原苗岭山地向东延伸部分，地处东经109°14′，北纬25°04′，全年平均气温17℃至19.6℃。年内极端最高气温36.9℃，县城年极端最低气温0.5℃，其中高寒山区最低气温-4.1℃，常年雨水充足，适宜淡水鱼、冷水鱼、亚冷水鱼养殖。融水金边鲤就是生活在这一特定地理环境下的一个地方鲤鱼种群。近几年，融水金边鲤以绿色生态、肉质鲜美以及较高的抗洪抗病性能，在湘、黔、桂交界地区享有较高的名气，经济价值也逐年提高。但该种群只有约10%的个体头部顶端上缘一直到尾部上缘的皮肤为金色，连续或断续连成一条金色粗线，似一条“金边”在鱼的背部，其余90%的个体的外形与多个鲤鱼地理种群和人工选育品种相似，尤其是鱼种阶段，难以通过外形区别鉴定，因此，有必要发明一种精准鉴别金边鲤的方法，为金边鲤种群的早期鉴别、品种种质鉴定以及商业养殖中产生的纠纷提供准确的鉴定依据。
线粒体基因组作为一个小分子量环状分子(脊椎动物中约为16kb)，一般认为它具有比核DNA高几倍的进化率。由于在绝大多数动物中它们是单亲(系)遗传，因而没有像核基因存在的重组现象。线粒体DNA作为遗传标记被越来越广泛地应用于群体遗传和系统进化的研究。专利CN 104450921 A，公开通过比较鲫鱼线粒体NADH4 基因中110-866 位点序列信息与鲤鱼线粒体基因序列的相似度，可以精确鉴定长丰鲫。
发明内容
基于此，本发明提供了一种利用线粒体NADH5基因精准鉴别金边鲤的方法，利用线粒体NADH5基因鉴别金边鲤，发现金边鲤NADH5基因序列与公开提交的鲤鱼序列相似度为99%，即金边鲤属于鲤鱼的一种；但金边鲤序列的247位点和559位点的碱基分别为A和C，与其他鲤鱼在对应位点的G和T碱基又有所不同，从而精准地鉴别出金边鲤，弥补了形态学鉴别的不足，为金边鲤地方品种的保护与解决养殖种的商业纠纷提供了参考。
本发明所述利用线粒体NADH5基因精准鉴别金边鲤的方法包括以下内容：
1、提取待鉴定金边鲤的DNA，采用TIANGEN基因组DNA提取试剂盒提取，具体包括以下步骤：
（1）将少量鱼鳍组织（约10mg）剪碎于1.5 mL离心管中，加入200μL GA溶液混匀；
（2）加入20μL蛋白酶K溶液混匀，56℃水浴消化直至组织溶解（约3h）；
（3）加入200μL GB缓冲液，充分颠倒摇匀，70℃水浴10 min；
（4）加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，将溶液转移至吸附柱CB3中，CB3吸附柱放入收集管中，12000 rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
（5）加入500μL GD溶液，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
（6）向吸附柱CB3中加入600μL PW漂洗液，12000rpm离心30s，弃废液，重复此操作一次；
（7）12000 rpm离心2min，倒掉废液，吸附柱CB3开盖置于室温放置8min，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；
（8）将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜中滴加100μL TE缓冲液，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
2、利用引物对金边鲤个体DNA模板进行PCR扩增：
（1）引物为：
F：CTCCCTAATCTTCGTCCCAA；
R：TTGGTGTTTTTATTGGTGGG。
（2）PCR反应体系：
DNA模版（80ng/μl） 1.0μL；
正向引物（10μM） 0.5μL；
反向引物（10μM） 0.5μL；
ddH2O 8.0μL；
2×LA Taq PCR Mix 10.0μL。
（3）PCR反应程序：先在94℃预变性5 min；再将以下程序循环30次：94℃变性30s，退火 55℃ 1min，72 ℃延伸30s。
3、对扩增产物进行回收，使用Biospin胶回收试剂盒回收琼脂糖凝胶中的DNA片段，具体步骤如下：
（1）在凝胶成像系统下，用干净、锋利的手术刀切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，称重；
（2）加入Extraction Buffer溶胶液，将凝胶和溶胶液以凝胶质量毫克数：溶胶液体积微升数=1：3的比例混合；
（3）50℃恒温水浴约10min，每隔2~3min摇匀一次，使胶块充分融化；
（4）将溶液转移至Spin Column内，6000g离心1min，弃废液；
（5）向Spin Column内加入500μL Extraction Buffer，12000 rpm离心30s，弃废液；
（6）向Spin Column内加入750μL Wash Buffer，静置5min，12000 rpm离心30 s，弃废液；
（7）再次于12000 rpm离心1 min，然后将Spin Column转移到无菌的1.5mL离心管中；
（8）向Spin Column内加50μL Elution Buffer，恒温静置1 min；
（9）于12000rpm离心1min，收集溶液得到回收产物。
4、对引物的PCR扩增产物进行克隆并测序：
（1）反应体系：
pMD18-T载体 1.0μL；
DNA片段 4.0μL；
Solution I 5.0μL。
（2）操作步骤：
1）将引物的PCR扩增产物在16℃反应2h；
2）再将产物加入感受态细胞中，冰浴30 min；
3）经42℃加热45s后，再在冰中放置2min；
4）加入500μL不含Amp LB液体培养基，在37℃、200rpm/min震荡30min；
5）取100μL上述所得溶液涂于含有Amp的LB固体培养基平板上，培养大约14h；
6）挑取单菌落，至含Amp液体培养基中，在37℃、200rpm/min培养3h；
7）将挑选并培养后的单菌落送至测序公司测序。
5、对序列进行比对分析，将测序公司测定的序列输入NCBI(美国国立生物技术信息中心)数据库进行信息比对（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#alnHdr_146142357），获得序列信息的详细比对信息，发现测定的序列与公开提交的鲤鱼序列相似度达到99%。再利用DNASTAR·Lasergene7.1软件包中的MegAlign软件将测序获得的序列与GenBank公开发表的鲤鱼序列做比较，发现金边鲤序列在247位点和559位点的碱基分别为A和C，而其他鲤鱼对应位点的碱基分别为G和T，从而能精准地鉴别出金边鲤。
本发明的有益效果是：
本申请人利用线粒体NADH5基因精准鉴别金边鲤，对金边鲤的线粒体基因组测序后发现，金边鲤线粒体基因组的序列与公开提交的鲤鱼序相似度达到99%，利用序列比对软件DNASTAR·Lasergene7.1软件包中的MegAlign软件将测序获得的序列与GenBank公开发表的鲤鱼序列做比较，在247位点和559位点的碱基分别为A和C，而其他鲤鱼在对应位点的碱基分别为G和T。这两个位点的鲤鱼基因组信息为金边鲤独特的基因信息，利用该基因信息，可以精确区分金边鲤与其他所有鲤鱼种群。
本发明首次针对金边鲤地理种群，发明了一种利用分子生物学方法准确鉴定金边鲤和其他鲤鱼的技术，即利用线粒体NADH5基因鉴别金边鲤，先鉴定其和鲤鱼的基因序列相似度达99%，判断金边鲤属于鲤鱼的一种；再在此基础上，鉴别金边鲤与其他鲤鱼的不同，精准地鉴别出金边鲤种群。利用本发明的鉴别方法能在早期精确鉴别金边鲤种群，弥补了形态学鉴别的不足，为金边鲤地方品种的保护与解决养殖种的商业纠纷提供了参考。
附图说明
图1为金边鲤测定的序列输入NCBI数据库进行信息比对的结果展示图；
图2为利用序列比对软件MegAlign软件将测序获得的序列与GenBank公开发表的序列做比较，在247位点及其附近的碱基序列比对结果展示图；
图3为利用序列比对软件MegAlign软件将测序获得的序列与GenBank公开发表的序列做比较，在559位点及其附近的碱基序列比对结果展示图。
具体实施方式
为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。
实施例1
利用线粒体NADH5基因精准鉴别金边鲤的方法包括以下内容：
1、提取待鉴定金边鲤的DNA，采用TIANGEN基因组DNA提取试剂盒提取，具体包括以下步骤：
（1）将少量鱼鳍组织（约10mg）剪碎于1.5mL离心管中，加入200μLGA溶液混匀；
（2）加入20μL蛋白酶K溶液混匀，56℃水浴消化直至组织溶解（约3h）；
（3）加入200μL GB缓冲液，充分颠倒摇匀，70℃ 水浴10min；
（4）加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，将溶液转移至吸附柱CB3中，CB3吸附柱放入收集管中，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
（5）加入500μL GD溶液，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
（6）向吸附柱CB3中加入600μL PW漂洗液，12000rpm离心30s，弃废液，重复此操作一次；
（7）12000rpm离心2min，倒掉废液，吸附柱CB3开盖置于室温放置8min，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；
（8）将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜中滴加100μL TE缓冲液，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
2、利用引物对金边鲤个体DNA模板进行PCR扩增：
（1）引物为：
F：CTCCCTAATCTTCGTCCCAA；
R：TTGGTGTTTTTATTGGTGGG。
（2）PCR反应体系：
DNA模版（80ng/μL） 1.0μL；
正向引物（10μM） 0.5μL；
反向引物（10μM） 0.5μL；
ddH2O 8.0μL；
2×LA Taq PCR Mix 10.0μL。
（3）PCR反应程序：先在94℃预变性5min；再将以下程序循环30次：94℃变性30s，退火55℃ 1min，72℃延伸30s。
3、对扩增产物进行回收，使用Biospin胶回收试剂盒回收琼脂糖凝胶中的DNA片段，具体步骤如下：
（1）在凝胶成像系统下，用干净、锋利的手术刀切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，称重；
（2）加入Extraction Buffer溶胶液，将凝胶和溶胶液以凝胶质量毫克数：溶胶液体积微升数=1：3的比例混合；
（3）50℃恒温水浴约10min，每隔2~3min摇匀一次，使胶块充分融化；
（4）将溶液转移至Spin Column内，6000g离心1min，弃废液；
（5）向Spin Column内加入500μL Extraction Buffer，12000rpm离心30s，弃废液；
（6）向Spin Column内加入750μL Wash Buffer，静置5min，12000rpm离心30s，弃废液；
（7）再次于12000rpm离心1min，然后将Spin Column转移到无菌的1.5mL离心管中；
（8）向Spin Column内加50μL Elution Buffer，恒温静置1min；
（9）于12000rpm离心1min，收集溶液得到回收产物。
4、对引物的PCR扩增产物进行克隆并测序：
（1）反应体系：
pMD18-T载体 1.0μL；
DNA片段 4.0μL；
Solution I 5.0μL。
（2）操作步骤：
1）将引物的PCR扩增产物在16℃ 反应2h；
2）再将产物加入感受态细胞（北京全式金公司）中，冰浴30 min；
3）经42℃加热45s后，再在冰中放置2min；
4）加入500μL不含Amp LB液体培养基，在37℃、200rpm/min 震荡30min；
5）取100μL上述所得溶液涂于含有Amp的LB固体培养基平板上，培养大约14h；
6）挑取单菌落，至含Amp液体培养基中，在37℃、200rpm/min培养3h；
7）将挑选并培养后的单菌落送至测序公司测序（深圳华大基因科技有限公司），获得金边鲤的标准碱基序列，见碱基序列表。
5、对序列进行比对分析，将测序公司测定的序列输入NCBI(美国国立生物技术信息中心)数据库进行信息比对（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#alnHdr_146142357），获得序列信息的详细比对信息，发现测定的序列与公开提交的鲤鱼序列相似度达到99%，如图1所示。再利用DNASTAR·Lasergene7.1软件包中的MegAlign软件将测序获得的序列与GenBank公开发表的鲤鱼序列做比较，发现金边鲤序列的247位点和559位点的碱基分别为A和C，而其他鲤鱼在对应位点的碱基分别为G和T，如图2和图3所示。
序列表
<110> 广西壮族自治区水产引育种中心
<120> 利用线粒体NADH5基因精准鉴别金边鲤的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1184
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctccctaatc ttcgtcccaa tcgccctata cgtcacctga tcaattttag aattcgcact 60
atgatatata cactccgacc ccaacattga ccgattcttc aaatacttac tcacattcct 120
agtagccata attatcctag ttacagccaa caacatattc caactattta tcggctgaga 180
aggcgtaggc atcatatcat tcctactcat cggatgatga catggacgag cagacgccaa 240
caccgcagct ctccaagctg ttatttacaa ccgagtagga gacattggac taattataac 300
tatagcctga ctagcaataa accttaattc ctgagaaatt caacaaatct ttgccctgtc 360
aaaaaacttt gatataacaa ttcccctaat aggacttgcc ctagcggcaa caggaaaatc 420
agcccaattt ggcctccacc catgactccc gtccgccatg gagggcccta caccagtatc 480
cgccctactc cattcaagta ctatagtcgt cgcaggaatt ttcctactaa tccgccttca 540
ccccctcata gaaaacaacc aactagccct aacaacctgc ctctgcctcg gagcattaac 600
ctcactattt acagccacct gcgccctaac ccaaaacgac atcaaaaaaa ttgtagcctt 660
ctcaacatcc agccaactag gactaataat agttacaatc ggactaaacc aaccacaact 720
agcattcctc cacatttgca cccatgcctt cttcaaggca atgctcttcc tgtgttcagg 780
gtcgatcatt cacagcctaa atgacgaaca agacatccga aaaataggag gcctattcaa 840
cattatgccc gccacctcaa cctattttac aattggcagc ctagccttaa caggaacccc 900
cttcctagca ggattcttct caaaggacgc aattattgaa gccctaaaca cctcctacct 960
aaacgcctga gccctaaccc taacactaat cgctacatca ttcaccgcag tatacagttt 1020
tcgactagta tactttgtaa ttataggaac cccacgattc ctgcccctat ctccaatcaa 1080
cgaaaataac ccactagtaa ttaactccat caaacgactt gcctgaggaa gcattattgc 1140
aggactcatt attacacaaa atttcccacc aataaaaaca ccaa 1184

Claims (1)

1.利用线粒体NADH5基因早期鉴别金边鲤的方法，其特征在于，鉴别的步骤为：
（1）提取待鉴定金边鲤的DNA；所述提取待鉴定金边鲤的DNA是采用TIANGEN基因组DNA提取试剂盒提取，提取步骤为：
a、将10mg鱼鳍组织剪碎于1.5mL离心管中，加入200μL GA溶液混匀；
b、加入20μL蛋白酶K溶液混匀，56℃水浴消化直至组织溶解；
c、加入200μL GB缓冲液，充分颠倒摇匀，70℃水浴10min；
d、加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，将溶液转移至吸附柱CB3中，CB3吸附柱放入收集管中，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
e、加入500μL GD溶液，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
f、向吸附柱CB3中加入600μL PW漂洗液，12000rpm离心30s，弃废液，重复此操作一次；
g、12000rpm离心2min，倒掉废液，吸附柱CB3开盖置于室温放置8min，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；
h、将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜中滴加100μL TE缓冲液，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；
（2）利用引物对金边鲤个体DNA模板进行PCR扩增；
所述引物为：
F：CTCCCTAATCTTCGTCCCAA；
R：TTGGTGTTTTTATTGGTGGG；
PCR反应体系利用引物对金边鲤个体DNA模板进行PCR扩增，扩增内容为：
1）PCR反应体系：
80ng/μL DNA模板 1.0μL；
10μM正向引物F 0.5μL；
10μM反向引物R 0.5μL；
ddH2O 8.0μL；
2×LA Taq PCR Mix 10.0μL；
2）PCR反应程序：先在94℃预变性5 min；再将以下程序循环30次：94℃变性30s，退火55℃1min，72℃延伸30s；
（3）对扩增产物进行回收；
所述对扩增产物进行回收为使用Biospin胶回收试剂盒回收琼脂糖凝胶中的DNA片段，具体步骤如下：
a、在凝胶成像系统下，用干净、锋利的手术刀切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，称重；
b、加入Extraction Buffer溶胶液，将凝胶和溶胶液以凝胶质量毫克数：溶胶液体积微升数=1：3的比例混合；
c、50℃恒温水浴10min，每隔2～3min摇匀一次，使胶块充分融化；
d、将溶液转移至Spin Column内，6000g离心1min，弃废液；
e、向Spin Column内加入500μL Extraction Buffer，12000rpm离心30s，弃废液；
f、向Spin Column内加入750μL Wash Buffer，静置5min，12000rpm离心30s，弃废液；
g、再次于12000rpm离心1min，然后将Spin Column转移到无菌的1.5mL离心管中；
h、向Spin Column内加50μL Elution Buffer，恒温静置1min；
i、于12000rpm离心1min，收集溶液得到回收产物；
（4）对引物的PCR扩增产物进行克隆并测序；
所述对引物的PCR扩增产物进行克隆并测序，具体内容为：
1）反应体系：
pMD18-T载体 1.0μL；
DNA片段 4.0μL；
Solution I 5.0μL；
2）操作步骤：
a、将引物的PCR扩增产物在16℃反应2h；
b、再将产物加入感受态细胞中，冰浴30min；
c、经42℃加热45s后，再在冰中放置2min；
d、加入500μL不含Amp的LB液体培养基，在37℃、200 rpm/min震荡30min；
e、取100μL上述所得溶液涂于含有Amp的LB固体培养基平板上，培养14h；
f、挑取单菌落，至含Amp液体培养基中，在37℃、200rpm/min培养3h；
g、将挑选并培养后的单菌落送至测序公司测序；
（5）对序列进行比对分析；所述对序列进行比对分析是将测序公司测定的序列输入NCBI数据库进行信息比对，获得序列信息的详细比对信息；再利用DNASTAR·Lasergene7.1软件包中的MegAlign软件将测序获得的序列与GenBank公开发表的鲤鱼序列做比较，序列在序列表序列1的247位点和559位点的碱基分别为A和C则为金边鲤，而其他鲤鱼对应位点的碱基分别为G和T。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000034476A9 (en) * 1998-12-10 2002-08-22 Tufts College Nucleic acid molecules of shrimp
CN104152451A (zh) * 2014-08-19 2014-11-19 淮南师范学院 一种太湖新银鱼物种分子鉴定的引物和方法
CN104911182A (zh) * 2015-06-01 2015-09-16 中国水产科学研究院 鱼类线粒体全基因组dna扩增
CN107557478A (zh) * 2017-09-15 2018-01-09 中国长江三峡集团公司中华鲟研究所 一种基于简并引物组合扩增长江鱼类线粒体基因全序的方法及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105653899B (zh) * 2014-09-30 2018-02-09 深圳华大基因研究院 同时确定多种样本的线粒体基因组序列信息的方法和系统
CN106947817B (zh) * 2017-04-11 2020-10-02 中国海洋大学 一种用于蛸科物种鉴定的dna条形码

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000034476A9 (en) * 1998-12-10 2002-08-22 Tufts College Nucleic acid molecules of shrimp
CN104152451A (zh) * 2014-08-19 2014-11-19 淮南师范学院 一种太湖新银鱼物种分子鉴定的引物和方法
CN104911182A (zh) * 2015-06-01 2015-09-16 中国水产科学研究院 鱼类线粒体全基因组dna扩增
CN107557478A (zh) * 2017-09-15 2018-01-09 中国长江三峡集团公司中华鲟研究所 一种基于简并引物组合扩增长江鱼类线粒体基因全序的方法及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Cyprinus carpio mitochondrial DNA, complete genome";Mabuchi,K.等;《GenBank Database》;20120811;Accession No.AP009047.1 *
"Cyprinus multitaeniata mitochondrion, complete genome";Li,Q.;《GenBank Database》;20170425;Accession No.KU373073.1 *
"推广"生态养殖"柳州模式促进水产畜牧产业发展";韦丽梅;《广西水产科技》;20180515(第Z1期);第26-29页 *
"稻田种养，成就广西版的"梦田"";王林秀等;《友农之家》;20170801(第8期);第30-31页 *

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