CN109680076B - 一种用于中华鳖遗传性别鉴定的分子标记及方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于水产生物技术领域，公开了一种用于中华鳖遗传性别鉴定的分子标记及方法，采用RAD技术对中华鳖雌雄个体进行测序，筛选雌雄特异性片段；根据雌雄特异性片段进行雌性基因组Walking，获得6532bp的特异性片段SEQ ID NO：1；基于特异性片段设计引物，进行引物筛选和验证获得特异性引物；采集中华鳖裙边组织，提取中华鳖基因组DNA，利用引物对在中华鳖个体中进行扩增；扩增结果进行电泳检测；进行遗传性别的鉴定。本发明解决了目前尚未见到中华鳖性别特异性标记用于遗传性别的鉴定，具有原创性。本发明准确鉴定成功率达到100％。

Description

一种用于中华鳖遗传性别鉴定的分子标记及方法

技术领域

本发明属于水产生物技术领域，尤其涉及一种用于中华鳖遗传性别鉴定的分子标记及方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

中华鳖(Pelodiscus sinensis)属爬行纲、龟鳖目、鳖科、鳖属，俗称甲鱼、水鱼、团鱼。在世界范围内，鳖主要分布于亚洲、非洲及北美，在亚洲主要分布于中国、俄罗斯东部、朝鲜、日本和越南。在我国分布范围广泛，除西藏、青海及新疆外各省市、自治区均有分布。由于其具有较高的营养价值和药用价值，一直以来深受广大消费者的喜爱。近些年来，中华鳖养殖业也得到较快发展，养殖产量在2016年已经达到34.5万吨。中华鳖呈现明显的雌雄异速生长，雄性生长速度快于雌性，且雄性的裙边宽厚，雄性苗种的价格较雌性高，雄性苗种深受广大养殖企业和养殖户的欢迎。因此，全雄或高雄性中华鳖苗种的培育将极大地提高养殖产量，增加养殖效益，中华鳖的性别控制育种也业已成为重要的研究课题。

目前中华鳖单性苗种生产常用的方法是人工挑选。孵化后的苗种经人工养殖一段时间，在出现明显异形特征时通过外部形态进行判别，目前通常以尾的长短作为第一辨别特征，雌性个体尾短，尾端不或很少自然伸出裙边外；雄性个体尾长，能够自然伸出裙边。虽然人工挑选的方法简单易行，但是对于尾部特征不明显的个体或者幼鳖鉴定效果较差，同时还必须在养殖到出现明显的外形判别特征时才能进行，需要将雌雄性苗种同时养殖一段时间，一般在温室养殖情况下需要3-4个月，在外塘养殖时间更长，而规格苗种出售时，通常养殖企业和养殖户只购买雄性苗种，绝大部分雌性个体只能作为商品鳖销售，而价格相对较低，直接影响了中华鳖苗种养殖的经济效益。

采用激素诱导性逆转和遗传学相结合的方法是中华鳖单性苗种生产的另外一条途径，也是目前研究的重点方向。该方法研究的基础是必须获得性逆转个体，进而准确鉴定出性逆转个体，也就是准确鉴定出生理性别和遗传性别不一致的个体。中华鳖遗传性别的鉴定对于开展中华鳖性别诱导、性别控制技术研究、中华鳖育种方案的制定和育种计划的有效管理具有重要的作用。因此发明一种可以用于中华鳖遗传性别鉴定的方法尤其必要。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)通常在生产实践中，现有常规技术主要是通过对中华鳖外形特征进行生理性别的鉴定，但是对于规格较小或外形特征不明显的中华鳖苗种，难以准确鉴定，鉴定效果不佳。

(2)在科研工作中，也可以通过组织切片等方式对中华鳖的生理性别进行鉴定，但是需要解剖采集性腺组织，造成中华鳖的死亡。

(3)在未发生性逆转，遗传性别与生理性别一致，通过生理性别可以间接鉴定遗传性别；但是如果是性逆转个体，遗传性别与生理性别不一致，无法通过生理性别的鉴定得到其遗传性别。

(3)在进行中华鳖性别控制研究时，中华鳖群体可能同时存在性逆转个体和未性逆转个体，外形鉴定和组织切片鉴定均无法获得真正的遗传性别。

解决上述技术问题的难度：

可以通过开发准确高效的性别特异性分子标记准确地中华鳖遗传性别，目前虽然性别特异性标记开发的技术方法很多，一些技术方法也均可以实现，不存在显著的技术障碍，但是在分子标记开发的过程中存在很大的不确定性，与使用的中华鳖群体、筛选分子标记的类型、采用分析方法、参数阈值的设置等都有密切的关系。

解决上述技术问题的意义：

中华鳖性别特异性标记的开发，不仅能实现早期对常规孵化苗种的遗传性别进行鉴定，促进单性苗种的培育和养殖，极大提高经济效益，而且对于开展中华鳖性别决定、性别控制和全雄苗种研究具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于中华鳖遗传性别鉴定的分子标记及方法。

本发明是这样实现的，一种用于中华鳖遗传性别鉴定方法，所述用于中华鳖遗传性别鉴定方法包括：

采用RAD技术对中华鳖雌雄个体进行测序，筛选雌雄特异性片段；

根据雌雄特异性片段进行雌性基因组Walking，获得6532bp的特异性片段SEQ IDNO：1；

基于特异性片段设计引物，进行引物筛选和验证获得特异性引物；

采集打孔器进行打孔采集中华鳖裙边组织，保存在无水乙醇中；

提取中华鳖基因组DNA，保存在超纯水中；

利用基于特异性片段SEQ ID NO：1开发的引物组Female1F/Female1R和Female2F/Female2R在中华鳖个体中进行扩增；

扩增结果进行电泳检测；

进行遗传性别的鉴定。

进一步，基于特异性片段设计引物中，引物包括：

引物组1：

Female1F：TGACTGGCACTGGAGAAGGA；

Female1R：GCATCAACCACAGCCCTACA；

引物组2：

Female2F：TCCAGGGCAGAAAGACACTC；

Female2R：ATGTCCCGGTGGATGGC。

进一步，采用RAD技术对中华鳖雌雄个体进行测序前需进行鉴定样本的收集；

采用打孔器在中华鳖的裙边进行打孔，采集雌雄性个体的组织样本，并保存在无水乙醇中，雌性记为Female，雄性记为Male。

进一步，提取中华鳖基因组DNA包括：

(1)取0.5g左右裙边组织，用超纯水反复冲洗组织表面的无水乙醇，经充分剪碎后放入1.5mL的离心管中；

(2)向离心管中加入10～15μL的蛋白酶K和500μL的HOM buffer，55℃消化4～6h；

(3)加入500μL 4.5M NaCL溶液和300μL的氯仿，充分混匀20min以后，在13000rpm下离心10min；

(4)将上清液转移到另一个灭菌的新管中，加入600μL无水异丙醇，充分摇匀20min，再13000rpm离心10min；

(5)弃上清液，加入500μL75％乙醇，置于55℃下消化5min，然后13000rpm离心5min；

(6)弃去上清液，将试管倒立在吸水纸上，室温下自然干燥；

(7)加100μL超纯水溶解DNA，4℃过夜；

(8)用1％的琼脂糖凝胶进行DNA检测后，在-20℃下保存备用。

进一步，步骤利用引物对Female1F/Female1R在中华鳖个体中进行扩增包括：

94℃预变性5min，25-40个循环，72℃延伸10min，4℃保存；94℃变性40sec，引物组1 50℃退火，引物组2 62℃30sec，72℃延伸1min。

进一步，扩增结果进行电泳检测包括：

扩增结束后，取2μL PCR扩增产物和2μL溴酚蓝混混匀后，在在1.5-2.0％的琼脂糖凝胶上上样，在最左边上样DL2000marker，120V电压，电泳30min关掉电源，然后用凝胶成像系统进行电泳结果的分析。

进一步，进行遗传性别的鉴定包括：

单个引物组进行单独判定：引物1或引物2进行电泳；

两个引物组进行联合判定：两个引物组分别进行电泳，根据电泳结果进行联合判定。

本发明的另一目的在于提供一种方法于所述用于中华鳖遗传性别鉴定方法的分子标记为SEQ ID NO：1。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明提供的采用打孔器用于中华鳖样本收集的方法，对中华鳖个体损伤较小，不对其成活造成影响。

本发明提供的中华鳖遗传性别鉴定分子标记和鉴定方法，操作方便，简单易行，鉴定成功率高，鉴定准确率达100％。

本发明提供的鉴定方法对于规格较小，或外形特征不明显的中华鳖个体也能准确鉴定，可进行中华鳖苗种的早期性别鉴定，可提早实现单性养殖，提高养殖产量，增加养殖效益。

本发明可一次性快速批量准确鉴定中华鳖的遗传性别。

本发明对于是否发生性逆转的个体均能准确鉴定。

本发明对于中华鳖性别决定、性别控制和全雄苗种培育具有重要的科研价值。

附图说明

图1是本发明实施例提供的用于中华鳖遗传性别鉴定的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的两个引物组分别进行电泳图。

图中：(a)、引物组1在中华鳖性别鉴定电泳结果；(b)、引物组2在中华鳖性别鉴定电泳结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

目前尚未见到中华鳖性别特异性标记用于遗传性别的鉴定。

为解决上述问题，下面结合具体方案对本发明作详细描述。

本发明实施例提供的用于中华鳖遗传性别鉴定方法包括：

采用RAD技术对中华鳖雌雄个体进行测序，筛选雌雄特异性片段。

根据雌雄特异性片段进行雌性基因组Walking，获得6532bp的特异性片段SEQ IDNO：1。

基于特异性片段设计引物，进行引物筛选和验证获得特异性引物。

采集中华鳖裙边组织，保存在无水乙醇中。

提取中华鳖基因组DNA，保存在超纯水中。

利用基于特异性片段SEQ ID NO：1的引物组Female1F/Female1R和Female2F/Female2R在中华鳖个体中进行扩增。

扩增结果进行电泳检测。

进行遗传性别的鉴定。

下面结合附图对本发明作进一步描述。

本发明实施例提供的用于中华鳖遗传性别鉴定的方法包括：

S101:鉴定样本的收集:根据中华鳖形态特征初步判断中华鳖的生理性别，雌性个体尾短，尾端不或很少自然伸出裙边外；雄性个体尾长，能够自然伸出裙边。采用打孔器在中华鳖的裙边进行打孔，采集雌雄性个体的组织样本，并保存在无水乙醇中，雌性记为Female，雄性记为Male，带回实验室。

S102:基因组DNA提取。

S103:性别特异性标记的扩增。

S104:性别特异性片段的电泳。

S105:遗传性别的鉴定。

步骤S102中，基因组DNA提取包括：

(1)取0.5g左右裙边组织，用超纯水反复冲洗组织表面的无水乙醇，经充分剪碎后放入1.5mL的离心管中。(2)向离心管中加入10～15μL的蛋白酶K和500μL的HOM buffer，55℃消化4～6h。(3)加入500μL 4.5M NaCL溶液和300μL的氯仿，充分混匀20min以后，在13000rpm下离心10min。(4)将上清液转移到另一个灭菌的新管中，加入600μL无水异丙醇，充分摇匀20min，再13000rpm离心10min。(5)弃上清液，加入500μL75％乙醇，置于55℃下消化5min，然后13000rpm离心5min。(6)弃去上清液，将试管倒立在吸水纸上，室温下自然干燥。(7)加100μL超纯水溶解DNA，4℃过夜。(8)用1％的琼脂糖凝胶进行DNA检测后，在-20℃下保存备用。

步骤S103中，性别特异性标记的扩增包括：

(1)引物Female1F/Female1R信息

引物组1：

Female1F：TGACTGGCACTGGAGAAGGA SEQ ID NO：2。

Female1R：GCATCAACCACAGCCCTACA SEQ ID NO：3。

引物组2

Female2F：TCCAGGGCAGAAAGACACTC SEQ ID NO：4。

Female2R：ATGTCCCGGTGGATGGC SEQ ID NO：5。

(2)PCR反应体系

25μL PCR反应体系：10×PCR buffer mix 2.5μL,10μM上下游引物0.5μL,5U/μLTaq DNA polymerase 0.5μL,50ng/μL DNA模板1μL,and 20μL超纯水。

(3)PCR反应过程：

引物组Female1F/Female1R：94℃预变性5min，22-24个循环，72℃延伸10min，4℃保存；94℃变性40sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min。

引物组Female2F/Female2R：94℃预变性5min，25-40个循环，72℃延伸10min，4℃保存；94℃变性40sec，62℃退火30sec，72℃延伸1min。

步骤S104中，性别特异性片段的电泳包括：扩增结束后，取2μL PCR扩增产物和2μL溴酚蓝混混匀后，在在1.5-2.0％的琼脂糖凝胶上上样，在最左边上样DL2000marker，120V电压，电泳30min关掉电源，然后用凝胶成像系统进行电泳结果的观察。

本发明实施例提供的分子标记的DNA序列为：

序列Sequence：

GTTTTCAGTCATGTGTTTTGGTGGGCAAAGGAGGCAGAAGGGGGAAAGGGATCAGATTTGTGCTTTTGCTGACAATTGACGCTAGGGATCTCATTTTAAAACTCCTGAACTAGGAGTGGAGGAGAGCTGGCATCTCCCTCTTTGCACATCTCAAATGTGAGGCAGCAGAATTGATTTAATTTCAGCTCCTGAAATGAATGAAAAGTAATAGTTGCTGGTTCTCAGCAGAAAATAATCTTTGACTATTTGGTAACCTTGTAGATATAGGCAGGCATATGGCTGGAATGTCTATAATTCTAGACTTGCGACAAGACCCTATACACATGAGACTGAACTCTGTGTAGCAGCTACTGCAGCTTAAAGGAACATTATTTGATACCTTTTAATAGAAATGTTGAAGCATTCGCATCTGTAAGAGTCTGAAGTCACAGCACAGAAGCATTAGAGTGTTAAAGCAAATGTTTATAATGGTCCAGCAGAGGATACCACCCACACCTTTAATCAAAGCATACGTGTAGCCAGACACCTACACCATCGGGGAGGTAGCCTAGGAGTTTTCATGGAACCTGTTGCCAAGGCACAGGGAAGGCGGGCCACTTGGTACAGACTCGATCCTCAAGTCCCTTACGGTACGTCTACACTACATGCCTCTGTCGGCAGAGGCATGTAGATTTGTTTATTCAGCAAAGGTAAATGAATCCGCGATTTAAATGATCGCGGCTTCATTTACATTTACATGGCTGCCACGCTGAGCCGACAAACAGCTGATCAGCCGACAAACATGGCCCATGGTTTGTCCTCTCCCCTCCTCTTTCTGACTATATCTTAGAGAATCTCTATCAATGGATTCTCCTCTGAGAGAAGTCTCCCTCCGATTTATGTGCATCTCCGCACCAATCGGCTTTCCCCCATCTCTTAGTTTAAAAACTGCTCTACGGCCTTTTTAATGTTTAGTGCCAGCAGTCTGGTTCCACCCTGGTTTAGGTGGAGCCCATCCTTCCTGTATAGGCTCCCCCTCTCCCAAAAGTGTCCCCAGTTCCTAATAAATCCAAACCCCTCTTCCCTACACCATCGTCTCATCCACACATTGAGACTCTGAAGCTCTGCCTGCCTACCTGGCCCTGCGCGTGGAACTGGAAGCATTTCCGAGAATGCCACCATAGAGGTCCTGGATTTCAGTCTCTTTCCTAGCAGCCTAAATGTGGCCTCCAGGACATCTCTCCTACCCTTCCCTACGTCATTGGTACCTACATGTACCACGACCACCGGCTCCTCCCCAGCACTACACATAAGTCTATCTAGATGTCTTGAGAGATCCGCAACCTTCGCACCAGGCAGGCAAGTGACCATACGGTTCTCCCGGTCATAACAAACCCAACTATCTATGTTTCTAACGATCGAATCACCCACTACTAACACCTGCCTCTTCCTAACTGGCATTCCCTCCCCATCAGAGGTATCCTCAGTGCGAGAGGATACCGCAACATCCTCTGGGAGGAGGGTCCCAACTATGGGATGGTTTCCCATAAGCAGATAAAAATCAAACCCCCAGCTCATTGGGGACGAAAATCCCTCTAGTTATTTAAGCTTTCTTCATTTTCCTCCCTCTTTTTAATTTCATCCAGGTGAGGCTCTGGGAGTTCCTTTTTCTCTCTGCAGCAGGGTAAAGCAAGCAGAGGATTTCCAGCTCTCTGGAGACATGCCTATAGTCTACCACAGCGTGGATATAAACCTGCAATAAAAGACCACCCAAGGGACTGGGCACAAGTGGTCCCACAGAAAGAAAGGCAGAAAGAGGCATTTTGTTTGAAAAGGCTGAGGCACAATTATCCAAAGCAGAAAAACAACAGCACGAAATTTCCTGCTCTGCTTTTCCCTGGGAGAGCTGATAACCAAGAGAGCTCACCCGATGCTGGGCATTCATTGTTTCCAGGTTGAACAAACTGCCCTGGGTGTCTCGGCGGGGGGTTGTGAACATGTGTGCATGTGTGTCATTGTCTATTAGCCTTTTTAAGGGCTGAGGAGCTCACAAACACTTTACACTGTTTTCCCCCCACAATAACTCTAAATAATTACTTGTTACTGCCCTAGAGCAAATGACCTCAAAGAGCAGCCCTTTGAAGACACTGGGTTGTTGCGGCTTTCAACAACAAACTTACATAACCCTTTGCCCCACATCTACCCTCAGCAACAAAAATGAGAACAATGTTCTCATGCAGCTGTATCTGCTGCATGTAGTGATGGGTATATAGAACAGCTGGGGCCCCAGCACTTAGCTTGCGGGACTGTGACAGGGTGTACCAACCTAGAGAGTCCCGCCCCCACAGCCCTGCTGGGCATGCTCCAGGTGGAGGACAGATAGAAAGGCCACTGGAGCAGCTCAGTCTGGGCTGACTGGCACTGGAGAAGGAGGTGCAGCCAGAGTTCTGGAGGAGCAGCAGGCAGAATGAACTGTGGAGGCCAGTCAGTGAGGAACAGTGGGAGAAGCCCCCATTCAGGAGGAAAGTGGTGAAGAACGCTGCTGGGGTGAGTCTGGTAGGAAGTAGCACAGGGTGGGGAGTCAGATCCCTGAGAGCTCAGTGTGTTTTGGTCAGATTCCCTGCTGCGCTAGAGGTGGGCCACCCCACCACTGACAGGGCCCTGGGCTGGGACCCGGTGGAGAGGGTGGGCCCAGGTCTCCCTACCCCATCCCCATTAATTCCCAAAAGGGGTGCTACCACTGTTGATATTGACTCTGGCAGCGGGACCTCACTGCCCTTCAAGAAGGGGGTGTTTTTACTTACTGTGGCTGTTAGGCTGGACTGCCTCATTGGGACAGGGTGTAGCTGTTGGCCCTGAGCTATAGGGACCAATATGCACACGGGGTGAAGCACTCATTGAGAGGCCTTCGAGGCCTAACACCCTGCCTCTGAGGGGGCCCAGGCATACCCACCCCATGACAGGGACATTGAGGAATTTGTATTTCCACAGATGACACATCTACAGTTAAATACACTGAATTCTGCCCTCCCTGACTGAGGGGGTGAGAGCAGCAGGAGGCAAAGGAGGTGAGACAAAGTAGGGCCTGTGAATGGAGCTTGCTGGTCAAGGCCCCCAATACAAATCCAAGAACACCCTGGAAAACAAAAATAAAAAGTGGGAAAGGAGCCACATATTAACTTCCTTACTTTTTCATTTCTGACACTGTTTTCCCCTCATTTCAATCTAAGAACTTCAAGCTAATGTCTGAAGGGCAGAAATATCTATTTGCCAATATGCCTGCTGCAGCTTTTTCACCAATCGACTGCCCTTCTTGGTATAATCAGTGGGACATTGATTGATATAATCTCAATTTGCTAGAGCATCATCAAAAAAGCTATCAGTACAAACAGCATCTTTGAAAAAATACCAGCAATCTAAGACGAGCTACTTTACTCCTCCTTTAATACTAGCAGTGCACAGCGAGGCCCAGCCCTGGGGTAACAGCCCCTGAGAGACAGAAAGCTTATGCCCAGGGCAACCAGCCCACACCTGGGATATGCAGCCCTCTGAAGGGCCAGGCTCTCCCACAGGGTTATGAGCCCAGAGGGGCTTGATGAAGAGGATGCATAAGGGCACACTATTAGCATATTGCTGACATTGGGCCCATTGTGTTGCCCTCAATTGATTTACCATAGATACCACATAGGGGCAGGGCTGTCCACCTGTAGGGCTGTGGTTGATGCAGAGAGGCCTCGCCCGGGCTTTGAGATGTAGGTGAGAGCAGCAAGGTGTCATTGCACTGTCAGGGTATATCTACACAGCAGGGCTATTTTGGGATACCAGAAGTATCCTGAAATAGTGGGCACGTTCAAAAGACGTGGGGTAGCTATTTCGAGATAATGTACTATTTCGAGACCTATTTCGAAATTTGGCGCTGTGTAGATGCGCCAAATTTTGAAATATGCTATTTCAAAAATCAATTGAAATAAGATACGCAATTTGCACTATGCAAATTGCGTATCTTATTTCAAGTTTAGGGTGCTGTATAGATGCACCCTCAGGATGTGCAGGTCACAGGCTCTCAACTCAAGAAAACAACATTAAGGAGCTCAAACAACTCCCCCTTTCCTCCCAAGAACAGAACCCAAAGACAGCAATGCAACTATTATGTGGGGTGGTTGCCCAATGAATAACTGTGCTGCATGGACAATGGCCCTTAAATGTTGCCAATTGACACCTGAGGAGCACACAATGGCCCCTTGCCTAAAAAAGACATACCTGGGTACCCCAAGGCTCCTTGCCTAAAAGGGACATGGTGATCATGTGATCAGCTCCAGTTTGGAAGGTACCATAATTCAGGAGAACAATGGATTTCCACTCCACATGGGCAAGGTTATAAAAGGATCCTGGGGGTGGTTCCTCCATCTATGTCTTCGCTCCTGCTCTCCACTCCAGAAGCAACTTTGCAAAGGACAGAGGGCCCGGAAGGATTCATGGATCCATCCTACCATAGGATGCACACCAGAGACTTTTAAGCTGGCAGTTTATATATCTCCATCACCAAGTTCTTGTTGCAGGTTCTTAGCAGAGATGTAATAATGTGGTTTCTTTAACAATCCTATTCTCAACCTTTTCTTTCTTTTATTAATAAACCTTTAGGCTACGTCTACATTGCACTCTCTTGCGCAATAACATATGCAAATGAGGCATGGCAATGAATATCGCTGCGTCTTATTTGCATACTTAATGAGCCGCCACTTTTGCACAAGGGGCTTTTGTGCAAGAAGGCGCAAAACATAACATAACAGCCGTTATTCCAGAAAAAACAATACTTTCATCTACACTGCAATTGCATTCTTTCAACAAAAAGTTAAAAGAACTGAGGGGGTTTTCCGATGGCAGTAACCTCTTTCTATGAGGAAGAATGCCTTTTCTGAAAAAGCTTTTTCGGAAAAAGGCGTGTGTGGATGTGGAAGAGGGAGTTATTTCCTGGAGGCCTCTTTTTTCGAAAGAACACAAGGTGCCCTGCTGGCCATGCCGTCCAAACTCATCACAACTCTATAGTTCCTGTCTCCCGGCAGCTCTTAAAGCCGCAGGCAGCCGGGACAAGGCTTGCAGCAGGAAGCCGGCCCTGGGAGCTTCACCTCACTGCGTGGCTGCCACTGCCATACTCCTTGGCACCCATGGCCCAGCCTCAAGCCACCTGAGAGCCCACTGGCCCTCACAGGGAGCATGGCCAGGGCTCCCAGGACCCTGCCAGGGGGACAAAAATTCATGCGCTGTCGTGGTCTGGGGCGGAGATCCTGGTCCTCCTGGAGGTATGGGGTGAGGAGGAGAACCTCCAGGATCTCCACTCCAGACGGCACAACACAGACATCTATGGTCAGATGGCCAAGGCCCTGGCTGCAAGGGGCCACCACCCCAGGAGTCTTGAGTAGGTGCGCAGAAAGGCCAAGAAGCTGCGGCAGGGCTACACCACGGCCAGGGGGCACAATTCTCACTCCAGGGCAGAAAGACACTCCTGCCTCTACTTCAACGAGCTGCACCGCATCCTGGGGGCTGGGGCAGCCCCTTCCCCACTCCTGGTTGTGGACTTGGGGCTGGAGACGCCCGTCGTCGCCTGCCCGGGGGTCCCAGCTGACGAGGAGAAGGAGGATGCTGAGCTGGAGGAGGAGGGAGACACAGCCAGCACCATCACCCTAACCCCAGGGCCTGGATGTCTCCCAGGCCACACACACGTCTGACCCCAGGGCGGGGGGACGCCCTCCTGGGGGACGCCCTCCCACCACCAGCCACCGCTGGAAGCAGGCTGGGGACAGGGACACATGCATGCACACAGATTGAGGAGTACCACACACGTCACATAGGCATGCCTGCCCACTCGAGGCACCACTCCATCCCGGGGACAGCATTGCCAGGTGCAGGTGTGTGTGTGGCCCCCATGGAAGGCCAGGCTGCTCCAGGCCCCTCTCCCACCCATAGGATCCCAGTGTGACTGGACACTTCCCTTGCCTACTTGTCCGTGGGATGGGGGCAGGGGTGGGAAGCATGGTCCCCTCAGCACCGCTGGGCCCCTGTGAGGCAGGGCCTGCTGTCCAGACCACACATGGCCTTGCTCCCAGGACATCACTGTCCTGTGCCCCAAGGACTGTTGCTCGCAGCTCACAGAGGAGGGCAAGGGATCAGGGACAGTGTCTGCATGGATGACTGACTGCCTCTCCCTCTTTAGTCTCCACAGCCGGACCAGCCATGACTAAGGGGCAAACACCAGCTAACAAGCCAACTGCCCAAGCCCAGGGGAGCTGCAGGCGCTGGAGGGTCCACGAGTACCTCATGAGGGAGCATGTGGCCATCCACCGGGACATGCAGCAGACCCTGGTCTAGAAGGTCTGGGATAACACTCAATGGCAGACCCAAATGTGAACCGAGCTGGTGCAGCAGGGCCACAACATGTGTGCCACTGTAGGGGAGCCTGAACTACCCTGCCTTGACAATAAATGATAAATAATAAGGAAACTGAGGTACACCACCTTATTAATTTAATGATTAAACACTGGGATATTTCACCCTC SEQ ID NO：1。

下面结合遗传性别的鉴定实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

本发明的遗传性别的鉴定方法包括：

采用RAD技术对中华鳖雌雄个体进行测序，筛选雌雄特异性片段。

根据雌雄特异性片段进行雌性基因组Walking，获得6532bp的特异性片段SEQ IDNO：1。

基于特异性片段设计引物，进行引物筛选和验证获得特异性引物。

采集中华鳖裙边组织，保存在无水乙醇中。

提取中华鳖基因组DNA，保存在超纯水中。

利用基于特异性片段SEQ ID NO：1的引物组Female1F/Female1R在中华鳖个体中进行扩增。

扩增结果进行电泳检测。

进行遗传性别的鉴定。

引物1电泳结果显示，在1300bp左右有明显一条特异性条带的为雌性中华鳖个体，未扩增出特异性条带的个体为雄性中华鳖。

实施例2

本发明的遗传性别的鉴定方法包括：

采用RAD技术对中华鳖雌雄个体进行测序，筛选雌雄特异性片段。

根据雌雄特异性片段进行雌性基因组Walking，获得6532bp的特异性片段SEQ IDNO：1。

基于特异性片段设计引物，进行引物筛选和验证获得特异性引物。

采集中华鳖裙边组织，保存在无水乙醇中。

提取中华鳖基因组DNA，保存在超纯水中。

利用基于特异性片段SEQ ID NO：1的引物组Female2F/Female2R在中华鳖个体中进行扩增。

扩增结果进行电泳检测。

进行遗传性别的鉴定。

引物2电泳结果显示，在860bp左右有明显一条特异性条带的为雌性中华鳖个体，未扩增出特异性条带的个体为雄性中华鳖。

实施例3

本发明的遗传性别的鉴定方法包括：

采用RAD技术对中华鳖雌雄个体进行测序，筛选雌雄特异性片段。

根据雌雄特异性片段进行雌性基因组Walking，获得6532bp的特异性片段SEQ IDNO：1。

基于特异性片段设计引物，进行引物筛选和验证获得特异性引物。

采集中华鳖裙边组织，保存在无水乙醇中。

提取中华鳖基因组DNA，保存在超纯水中。

利用基于特异性片段SEQ ID NO：1的引物组Female1F/Female1R和Female2F/Female2R在中华鳖个体中进行扩增。

扩增结果进行电泳检测。

进行遗传性别的鉴定。

两个引物组进行联合判定：两个引物组分别进行电泳，根据电泳结果进行联合判定。引物1在1300bp左右有明显一条特异性条带，且引物2在860bp左右有明显一条特异性条带的为雌性中华鳖个体，未扩增出特异性条带的个体为雄性中华鳖。如图2所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国水产科学研究院长江水产研究所

<120> 一种用于中华鳖遗传性别鉴定的分子标记及方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6532

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gttttcagtc atgtgttttg gtgggcaaag gaggcagaag ggggaaaggg atcagatttg 60

tgcttttgct gacaattgac gctagggatc tcattttaaa actcctgaac taggagtgga 120

ggagagctgg catctccctc tttgcacatc tcaaatgtga ggcagcagaa ttgatttaat 180

ttcagctcct gaaatgaatg aaaagtaata gttgctggtt ctcagcagaa aataatcttt 240

gactatttgg taaccttgta gatataggca ggcatatggc tggaatgtct ataattctag 300

acttgcgaca agaccctata cacatgagac tgaactctgt gtagcagcta ctgcagctta 360

aaggaacatt atttgatacc ttttaataga aatgttgaag cattcgcatc tgtaagagtc 420

tgaagtcaca gcacagaagc attagagtgt taaagcaaat gtttataatg gtccagcaga 480

ggataccacc cacaccttta atcaaagcat acgtgtagcc agacacctac accatcgggg 540

aggtagccta ggagttttca tggaacctgt tgccaaggca cagggaaggc gggccacttg 600

gtacagactc gatcctcaag tcccttacgg tacgtctaca ctacatgcct ctgtcggcag 660

aggcatgtag atttgtttat tcagcaaagg taaatgaatc cgcgatttaa atgatcgcgg 720

cttcatttac atttacatgg ctgccacgct gagccgacaa acagctgatc agccgacaaa 780

catggcccat ggtttgtcct ctcccctcct ctttctgact atatcttaga gaatctctat 840

caatggattc tcctctgaga gaagtctccc tccgatttat gtgcatctcc gcaccaatcg 900

gctttccccc atctcttagt ttaaaaactg ctctacggcc tttttaatgt ttagtgccag 960

cagtctggtt ccaccctggt ttaggtggag cccatccttc ctgtataggc tccccctctc 1020

ccaaaagtgt ccccagttcc taataaatcc aaacccctct tccctacacc atcgtctcat 1080

ccacacattg agactctgaa gctctgcctg cctacctggc cctgcgcgtg gaactggaag 1140

catttccgag aatgccacca tagaggtcct ggatttcagt ctctttccta gcagcctaaa 1200

tgtggcctcc aggacatctc tcctaccctt ccctacgtca ttggtaccta catgtaccac 1260

gaccaccggc tcctccccag cactacacat aagtctatct agatgtcttg agagatccgc 1320

aaccttcgca ccaggcaggc aagtgaccat acggttctcc cggtcataac aaacccaact 1380

atctatgttt ctaacgatcg aatcacccac tactaacacc tgcctcttcc taactggcat 1440

tccctcccca tcagaggtat cctcagtgcg agaggatacc gcaacatcct ctgggaggag 1500

ggtcccaact atgggatggt ttcccataag cagataaaaa tcaaaccccc agctcattgg 1560

ggacgaaaat ccctctagtt atttaagctt tcttcatttt cctccctctt tttaatttca 1620

tccaggtgag gctctgggag ttcctttttc tctctgcagc agggtaaagc aagcagagga 1680

tttccagctc tctggagaca tgcctatagt ctaccacagc gtggatataa acctgcaata 1740

aaagaccacc caagggactg ggcacaagtg gtcccacaga aagaaaggca gaaagaggca 1800

ttttgtttga aaaggctgag gcacaattat ccaaagcaga aaaacaacag cacgaaattt 1860

cctgctctgc ttttccctgg gagagctgat aaccaagaga gctcacccga tgctgggcat 1920

tcattgtttc caggttgaac aaactgccct gggtgtctcg gcggggggtt gtgaacatgt 1980

gtgcatgtgt gtcattgtct attagccttt ttaagggctg aggagctcac aaacacttta 2040

cactgttttc cccccacaat aactctaaat aattacttgt tactgcccta gagcaaatga 2100

cctcaaagag cagccctttg aagacactgg gttgttgcgg ctttcaacaa caaacttaca 2160

taaccctttg ccccacatct accctcagca acaaaaatga gaacaatgtt ctcatgcagc 2220

tgtatctgct gcatgtagtg atgggtatat agaacagctg gggccccagc acttagcttg 2280

cgggactgtg acagggtgta ccaacctaga gagtcccgcc cccacagccc tgctgggcat 2340

gctccaggtg gaggacagat agaaaggcca ctggagcagc tcagtctggg ctgactggca 2400

ctggagaagg aggtgcagcc agagttctgg aggagcagca ggcagaatga actgtggagg 2460

ccagtcagtg aggaacagtg ggagaagccc ccattcagga ggaaagtggt gaagaacgct 2520

gctggggtga gtctggtagg aagtagcaca gggtggggag tcagatccct gagagctcag 2580

tgtgttttgg tcagattccc tgctgcgcta gaggtgggcc accccaccac tgacagggcc 2640

ctgggctggg acccggtgga gagggtgggc ccaggtctcc ctaccccatc cccattaatt 2700

cccaaaaggg gtgctaccac tgttgatatt gactctggca gcgggacctc actgcccttc 2760

aagaaggggg tgtttttact tactgtggct gttaggctgg actgcctcat tgggacaggg 2820

tgtagctgtt ggccctgagc tatagggacc aatatgcaca cggggtgaag cactcattga 2880

gaggccttcg aggcctaaca ccctgcctct gagggggccc aggcataccc accccatgac 2940

agggacattg aggaatttgt atttccacag atgacacatc tacagttaaa tacactgaat 3000

tctgccctcc ctgactgagg gggtgagagc agcaggaggc aaaggaggtg agacaaagta 3060

gggcctgtga atggagcttg ctggtcaagg cccccaatac aaatccaaga acaccctgga 3120

aaacaaaaat aaaaagtggg aaaggagcca catattaact tccttacttt ttcatttctg 3180

acactgtttt cccctcattt caatctaaga acttcaagct aatgtctgaa gggcagaaat 3240

atctatttgc caatatgcct gctgcagctt tttcaccaat cgactgccct tcttggtata 3300

atcagtggga cattgattga tataatctca atttgctaga gcatcatcaa aaaagctatc 3360

agtacaaaca gcatctttga aaaaatacca gcaatctaag acgagctact ttactcctcc 3420

tttaatacta gcagtgcaca gcgaggccca gccctggggt aacagcccct gagagacaga 3480

aagcttatgc ccagggcaac cagcccacac ctgggatatg cagccctctg aagggccagg 3540

ctctcccaca gggttatgag cccagagggg cttgatgaag aggatgcata agggcacact 3600

attagcatat tgctgacatt gggcccattg tgttgccctc aattgattta ccatagatac 3660

cacatagggg cagggctgtc cacctgtagg gctgtggttg atgcagagag gcctcgcccg 3720

ggctttgaga tgtaggtgag agcagcaagg tgtcattgca ctgtcagggt atatctacac 3780

agcagggcta ttttgggata ccagaagtat cctgaaatag tgggcacgtt caaaagacgt 3840

ggggtagcta tttcgagata atgtactatt tcgagaccta tttcgaaatt tggcgctgtg 3900

tagatgcgcc aaattttgaa atatgctatt tcaaaaatca attgaaataa gatacgcaat 3960

ttgcactatg caaattgcgt atcttatttc aagtttaggg tgctgtatag atgcaccctc 4020

aggatgtgca ggtcacaggc tctcaactca agaaaacaac attaaggagc tcaaacaact 4080

ccccctttcc tcccaagaac agaacccaaa gacagcaatg caactattat gtggggtggt 4140

tgcccaatga ataactgtgc tgcatggaca atggccctta aatgttgcca attgacacct 4200

gaggagcaca caatggcccc ttgcctaaaa aagacatacc tgggtacccc aaggctcctt 4260

gcctaaaagg gacatggtga tcatgtgatc agctccagtt tggaaggtac cataattcag 4320

gagaacaatg gatttccact ccacatgggc aaggttataa aaggatcctg ggggtggttc 4380

ctccatctat gtcttcgctc ctgctctcca ctccagaagc aactttgcaa aggacagagg 4440

gcccggaagg attcatggat ccatcctacc ataggatgca caccagagac ttttaagctg 4500

gcagtttata tatctccatc accaagttct tgttgcaggt tcttagcaga gatgtaataa 4560

tgtggtttct ttaacaatcc tattctcaac cttttctttc ttttattaat aaacctttag 4620

gctacgtcta cattgcactc tcttgcgcaa taacatatgc aaatgaggca tggcaatgaa 4680

tatcgctgcg tcttatttgc atacttaatg agccgccact tttgcacaag gggcttttgt 4740

gcaagaaggc gcaaaacata acataacagc cgttattcca gaaaaaacaa tactttcatc 4800

tacactgcaa ttgcattctt tcaacaaaaa gttaaaagaa ctgagggggt tttccgatgg 4860

cagtaacctc tttctatgag gaagaatgcc ttttctgaaa aagctttttc ggaaaaaggc 4920

gtgtgtggat gtggaagagg gagttatttc ctggaggcct cttttttcga aagaacacaa 4980

ggtgccctgc tggccatgcc gtccaaactc atcacaactc tatagttcct gtctcccggc 5040

agctcttaaa gccgcaggca gccgggacaa ggcttgcagc aggaagccgg ccctgggagc 5100

ttcacctcac tgcgtggctg ccactgccat actccttggc acccatggcc cagcctcaag 5160

ccacctgaga gcccactggc cctcacaggg agcatggcca gggctcccag gaccctgcca 5220

gggggacaaa aattcatgcg ctgtcgtggt ctggggcgga gatcctggtc ctcctggagg 5280

tatggggtga ggaggagaac ctccaggatc tccactccag acggcacaac acagacatct 5340

atggtcagat ggccaaggcc ctggctgcaa ggggccacca ccccaggagt cttgagtagg 5400

tgcgcagaaa ggccaagaag ctgcggcagg gctacaccac ggccaggggg cacaattctc 5460

actccagggc agaaagacac tcctgcctct acttcaacga gctgcaccgc atcctggggg 5520

ctggggcagc cccttcccca ctcctggttg tggacttggg gctggagacg cccgtcgtcg 5580

cctgcccggg ggtcccagct gacgaggaga aggaggatgc tgagctggag gaggagggag 5640

acacagccag caccatcacc ctaaccccag ggcctggatg tctcccaggc cacacacacg 5700

tctgacccca gggcgggggg acgccctcct gggggacgcc ctcccaccac cagccaccgc 5760

tggaagcagg ctggggacag ggacacatgc atgcacacag attgaggagt accacacacg 5820

tcacataggc atgcctgccc actcgaggca ccactccatc ccggggacag cattgccagg 5880

tgcaggtgtg tgtgtggccc ccatggaagg ccaggctgct ccaggcccct ctcccaccca 5940

taggatccca gtgtgactgg acacttccct tgcctacttg tccgtgggat gggggcaggg 6000

gtgggaagca tggtcccctc agcaccgctg ggcccctgtg aggcagggcc tgctgtccag 6060

accacacatg gccttgctcc caggacatca ctgtcctgtg ccccaaggac tgttgctcgc 6120

agctcacaga ggagggcaag ggatcaggga cagtgtctgc atggatgact gactgcctct 6180

ccctctttag tctccacagc cggaccagcc atgactaagg ggcaaacacc agctaacaag 6240

ccaactgccc aagcccaggg gagctgcagg cgctggaggg tccacgagta cctcatgagg 6300

gagcatgtgg ccatccaccg ggacatgcag cagaccctgg tctagaaggt ctgggataac 6360

actcaatggc agacccaaat gtgaaccgag ctggtgcagc agggccacaa catgtgtgcc 6420

actgtagggg agcctgaact accctgcctt gacaataaat gataaataat aaggaaactg 6480

aggtacacca ccttattaat ttaatgatta aacactggga tatttcaccc tc 6532

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgactggcac tggagaagga 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcatcaacca cagccctac 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tccagggcag aaagacactc 20

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgtcccggt ggatggc 17

Claims (7)

1.一种用于中华鳖遗传性别鉴定方法，其特征在于，所述用于中华鳖遗传性别鉴定方法包括：

采用RAD技术对中华鳖雌雄个体进行测序，筛选雌雄特异性片段；

根据雌性特异性片段进行雌性基因组Walking，获得6532bp的特异性片段SEQ ID NO：1；

基于特异性片段设计引物，进行引物筛选和验证获得特异性引物组Female1F/Female1R和Female2F/Female2R；

采集中华鳖裙边组织，保存在无水乙醇中；

提取中华鳖基因组DNA，保存在超纯水中；

利用引物组Female1F/Female1R和Female2F/Female2R在中华鳖个体中进行扩增；

扩增结果进行电泳检测；

进行遗传性别的鉴定；检测到特异性条带的为雌性中华鳖个体，未扩增出特异性条带的个体为雄性中华鳖；

基于特异性片段设计引物中，引物包括：

引物组1：

Female1F：TGACTGGCACTGGAGAAGGA；

Female1R：GCATCAACCACAGCCCTACA；

引物组2：

Female2F：TCCAGGGCAGAAAGACACTC；

Female2R：ATGTCCCGGTGGATGGC。

2.如权利要求1所述的用于中华鳖遗传性别鉴定方法，其特征在于，

采用RAD技术对中华鳖雌性和雄性个体进行测序前需进行鉴定样本的收集；

采用打孔器在中华鳖的裙边进行打孔，采集雌雄性个体的组织样本，并保存在无水乙醇中，雌性记为Female，雄性记为Male。

3.如权利要求1所述的用于中华鳖遗传性别鉴定方法，其特征在于，提取中华鳖基因组DNA包括：

（1）取0.5g左右裙边组织，用超纯水反复冲洗组织表面的无水乙醇，经充分剪碎后放入1.5mL的离心管中；

（2）向离心管中加入10~15μL的蛋白酶K和500μL的HOM buffer，55℃消化4~6h；

（3）加入500μL 4.5M NaCL溶液和300μL的氯仿，充分混匀20min以后，在13000rpm下离心10min；

（4）将上清液转移到另一个灭菌的新管中，加入600μL无水异丙醇，充分摇匀20min，再13000rpm离心10min；

（5）弃上清液，加入500μL75%乙醇，置于55℃下消化5min，然后13000rpm离心5min；

（6）弃去上清液，将试管倒立在吸水纸上，室温下自然干燥；

（7）加100μL超纯水溶解DNA，4℃过夜；

（8）用1%的琼脂糖凝胶进行DNA检测后，在-20℃下保存备用。

4.如权利要求1所述的用于中华鳖遗传性别鉴定方法，其特征在于，步骤利用引物组Female1F/Female1R和Female2F/Female2R在中华鳖个体中进行扩增包括：

25 µL PCR 反应体系：10× PCR buffer mix 2.5 μL， 10 μM 上下游引物0.5 μL， 5U/μL Taq DNA polymerase 0.5 μL， 50 ng/μL DNA模板 1 μL， and 20 μL 超纯水；

采用引物组1的PCR 反应过程： 94℃预变性5min，22-24个循环，72℃延伸10min，4℃保存；94℃变性40sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min；

采用引物组2的PCR 反应过程：94℃预变性5min，25-40个循环，72℃延伸10min，4℃保存；94℃变性40sec，62℃退火 30sec，72℃延伸1min。

5.如权利要求1所述的用于中华鳖遗传性别鉴定方法，其特征在于，扩增结果进行电泳检测包括：

扩增结束后，取2 μL PCR扩增产物和2 μL 溴酚蓝混匀后，在1.5-2.0%的琼脂糖凝胶上上样，在最左边上样DL2000 marker，120V电压，电泳30 min关掉电源，然后用凝胶成像系统进行电泳结果的分析。

6.如权利要求1所述的用于中华鳖遗传性别鉴定方法，其特征在于，进行遗传性别的鉴定包括：

单个引物组进行单独判定：引物组1或引物组2进行电泳；

两个引物组进行联合判定：两个引物组分别进行电泳，根据电泳结果进行联合判定。

7.一种用于中华鳖遗传性别鉴定的分子标记，其特征在于，所述分子标记核心序列为SEQ ID NO：1。

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