CN112725465B - 一种长丰鲢精准鉴定引物、鉴定方法及其应用 - Google Patents

一种长丰鲢精准鉴定引物、鉴定方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于水产生物品种鉴定技术领域，尤其涉及一种长丰鲢精准鉴定引物、鉴定方法及其应用。本发明提供的用于鉴定长丰鲢的引物分别为B25V31F2和B25V31R2，序列分别为B25V31F2：TCCTCTTGCTCAACATCTGGT；B25V31R2：CTGTTCCCTCTACTACTACCTTTT。本发明提供的方法简单易行，操作方便，鉴定成功率高，可以快速、高效、准确、批量对长丰鲢进行鉴定。

Description

一种长丰鲢精准鉴定引物、鉴定方法及其应用
技术领域
本发明属于水产生物品种鉴定技术领域，尤其涉及一种长丰鲢精准鉴定引物、鉴定方法及其应用。
背景技术
鲢(Hypophthalmichthys molitrix)是我国重要的“四大家鱼”之一，广泛分布于我国的长江、珠江和黑龙江流域。鲢具有食物链短、易饲养、成本低和能调节水质等优点，已成为我国重要的淡水养殖种类之一，养殖产量持续位居淡水鱼类养殖产量的第二位，是我国重要的大宗淡水鱼类，在我国淡水渔业中具有举足轻重的地位。长丰鲢是中国水产科学研究院长江水产研究所自主选育的我国第一个鲢新品种(新品种证书：GS-01-001-2010)，采用人工雌核发育、分子标记辅助和群体选育相结合的综合育种技术培育而成。长丰鲢具有生长速度快，产量高、体型较高且整齐、适应性强、成活率高、纯合度高、遗传性状稳定等优良性状，适宜在全国范围的可控淡水中养殖，截止目前已经推广到了全国27个省市(自治区)。
长丰鲢外形特征跟普通鲢较为相似，普通苗种生产基地、养殖户仅通过外形难以准确鉴定长丰鲢和普通鲢个体。因此发明一种可以用于鉴定长丰鲢和普通鲢的方法尤其必要。长丰鲢新品种特异性分子标记的开发不仅有利于建立长丰鲢种质标准，保证种质的纯正，而且有利于苗种生产和养殖的健康发展，也有利于长丰鲢新品种的优良性状的维护和有效管理。同时对于保障长丰鲢种业的健康发展，维护种业地位具有重要作用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种长丰鲢精准鉴定引物、鉴定方法及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。该方法简单易行，操作方便，鉴定成功率高。
本发明是这样实现的，一种长丰鲢精准鉴定引物，所述引物为B25V31F2和B25V31R2，B25V31F2和B25V31R2的序列分别为B25V31F2：TCCTCTTGCTCAACATCTGGT；B25V31R2：CTGTTCCCTCTACTACTACCTTTT
一种长丰鲢精准鉴定方法，包括以下步骤：以引物B25V31F2和B25V31R2对样品DNA进行扩增，出现437bp大小条带即为长丰鲢样品；B25V31F2和B25V31R2的序列分别为B25V31F2：TCCTCTTGCTCAACATCTGGT；B25V31R2：CTGTTCCCTCTACTACTACCTTTT。
进一步地，对样品DNA进行扩增的PCR反应体系包括：2.5μL的10×PCR buffermix，上下游引物各0.5μL，1μL的模板，0.5μL的5U/μl Taq DNApolymerase，20μL的ddH2O。
进一步地，对样品DNA进行扩增的PCR反应程序为95℃预变性5min，35个循环(95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s)，72℃延伸10min，4℃保存。
进一步地，扩增结束后，取2μL PCR扩增产物和2μL溴酚蓝混匀后进行电泳检测。
本发明还披露了上述的一种长丰鲢精准鉴定方法在长丰鲢品种鉴定中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
1、目前尚未见到长丰鲢特异性标记用于长丰鲢新品种的鉴定，具有原创性。
2、可以快速、高效、准确、批量对长丰鲢进行鉴定。
附图说明
图1是长丰鲢分子鉴定电泳结果；
图2是本发明设计的多对引物的扩增电泳图；
图3是CF1F/CF1R分别在48个长丰鲢和普通鲢群体进行鉴定的结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
本发明披露了一种长丰鲢精准鉴定引物、鉴定方法及其应用。本发明中长丰鲢的选育采用了鲤灭活精子作为激活源，在长丰鲢中有鲤基因的渗入，因此有效寻找出长丰鲢中的鲤的渗入片段，并采用该片段进行分子标记的开发，可以实现长丰鲢的精准鉴定，进而区分长丰鲢和普通鲢。技术方案包括：
1、选取长丰鲢和普通鲢各50尾提取DNA进行二代全基因组重测序，过滤测序引物和低质量序列后，数据量均不低于10G，覆盖鲢基因组至少10倍。用BWA的mem模块将长丰鲢各个样本的Reads分别比对到鲢基因组，未比对上的Reads被当作长丰鲢特异性Reads。
2、用BWA的mem模块将各长丰鲢样本的特异性Reads比对到鲤参考基因组(GenBankassembly accession:GCA_004011555.1)，选择比对质量高(MAPQ≥30)，位置唯一且双末端距离符合测序文库大小预期的Reads，提取其在鲤基因组上比对的位置。这些鲤基因组片段可能存在于长丰鲢基因组中。
3、将长丰鲢特异性Reads在鲤基因组中的比对位置分别向上、下游延伸1000bp作为侯选差异区域。用BWA的mem模块分别将50尾普通鲢的Reads比对到这些候选差异区域上。如果某个候选区域也有至少1个普通鲢个体的Reads，那么认为这个区域也存在于普通鲢基因组中。进一步，我们去除这些存在于长丰鲢和普通鲢的区域。
对于保留的候选差异区域，我们进一步筛选获得高可靠性位点，要求满足(1)所有普通鲢Reads均未比对上该位点；(2)至少有30个长丰鲢样本Reads比对该位点。
对筛选获得的高可靠性位点，利用samtools faidx模块提取DNA序列信息以用于设计引物和扩增。
4、使用Primer 5根据提取的DNA序列设计特异性扩增引物，依据引物长度、GC含量、碱基分布和是否能形成引物二聚体筛选引物。获得的引物用于长丰鲢基因组DNA的PCR扩增，随后在1.5-2.0％的琼脂糖凝胶上电泳检测扩增产物，电泳条带切胶回收纯化后测序检测。
5、基于测序结果重新设计引物，并在长丰鲢和鲢基因组DNA上进行PCR扩增。
6、扩增产物在1.5-2.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。仅能在长丰鲢基因组DNA上扩增出条带，而在鲢基因组DNA上无扩增条带的引物作为长丰鲢特异性标记。
7、分别提取长丰鲢和鲢基因组DNA，并利用引物进行PCR扩增和电泳检测，依据预期条带有无鉴定长丰鲢。
本发明在实验过程中设计引物200多对，能在鲤、长丰鲢或鲢上稳定获得扩增片段的有103对(图2)，利用这103对引物分别在8个长丰鲢和普通鲢个体中进行初步筛选，筛选标准为鲤和长丰鲢中有，而鲢无目的片段，进而获得B25V31F2/B25V31R2引物在长丰鲢中能扩增出稳定的特异性条带，而在普通鲢中无条带。
筛选获得的特异性标记引物对为B25V31F2/B25V31R2，序列如下：
B25V31F2：TCCTCTTGCTCAACATCTGGT
B25V31R2：CTGTTCCCTCTACTACTACCTTTT
利用B25V31F2/B25V31R2引物，分别在48个长丰鲢和普通鲢群体进行批量验证，在437bp左右有明显一条特异性条带的为长丰鲢个体，未扩增出特异性条带的为普通鲢个体。鉴定结果如图所示，鉴定准确率为100％(图3)。下表为本申请实验过程中设计的部分引物序列。
Figure BDA0002929658390000041
Figure BDA0002929658390000051
Figure BDA0002929658390000061
Figure BDA0002929658390000071
Figure BDA0002929658390000081
实施例
1、鉴定样本的收集
分别采集长丰鲢和鲢个体的鳍条样本，并保存在无水乙醇中，长丰鲢记为Changfeng，普通鲢记为Silver carp，带回实验室。
2、基因组DNA提取
(1)取0.5g左右鳍条组织，用超纯水反复冲洗组织表面的无水乙醇，经充分剪碎后放入1.5mL的离心管中。
(2)向离心管中加入10～15μL的蛋白酶K和500μL的HOM buffer，55℃消化4～6h。
(3)加入500μL 4.5M NaCL溶液和300μL的氯仿，充分混匀20min以后，在13000rpm下离心10min。
(4)将上清液转移到另一个灭菌的新管中，加入600μL无水异丙醇，充分摇匀20min，再13000rpm离心10min。
(5)弃上清液，加入500μL75％乙醇，置于55℃下消化5min，然后13000rpm离心5min。
(6)弃去上清液，将试管倒立在吸水纸上，室温下自然干燥。
(7)加100μL灭菌双蒸水溶解DNA，4℃过夜。
(8)用1％的琼脂糖凝胶进行DNA检测后，在-20℃下保存备用。
3、长丰鲢特异性片段的扩增
(1)引物信息
B25V31F2：TCCTCTTGCTCAACATCTGGT
B25V31R2：CTGTTCCCTCTACTACTACCTTTT
(2)PCR反应体系
Figure BDA0002929658390000091
(3)PCR反应过程
95℃预变性5min，35个循环(95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s)，72℃延伸10min，4℃保存。
4、长丰鲢特异性片段的电泳
扩增结束后，取2μL PCR扩增产物和2μL溴酚蓝混匀后，在1.5-2.0％的琼脂糖凝胶上上样，在最左边上样DL2000 marker，120V电压，电泳30min关掉电源，然后用凝胶成像系统进行电泳结果的观察。
5、长丰鲢和鲢的鉴定
在250bp和500bp之间有明显一条特异性条带(437bp)的为长丰鲢个体，未扩增出特异性条带的个体为普通鲢(图1)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国水产科学研究院长江水产研究所
中国水产科学研究院
<120> 一种长丰鲢精准鉴定引物、鉴定方法及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> B25V31F2
<400> 1
tcctcttgct caacatctgg t 21
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> B25V31R2
<400> 2
ctgttccctc tactactacc tttt 24
<210> 3
<211> 437
<212> DNA
<213> Sequence
<400> 3
tcctcttgct caacatctgg tgaatacagg tctgtgtatt tcctgttggt aaattatcat 60
ttccatgtta aaacatctta caaacaaaaa tgtcctcccc atgtaatcag ttaaatgaat 120
ttaaattatg tcagtcacta tgattttttt tttattattt acctgtagca agaatttttt 180
tctggatatt tttcaggtgg atccagatcc tcagcatcag atattactat ctgaaaaaaa 240
aaagattaaa atgtctgaaa caacaacact gaaagcaaga aatgtcttgg tgccagtctg 300
ccttattatc tgtcctggct gaattgttaa tgaatgtcct ggtgcatctc tgtaacatga 360
taaaacataa aaattattag ctccatgata aaggctataa tgtagttttg agtaaaaggt 420
agtagtagag ggaacag 437

Claims (7)

1.一种区分长丰鲢和普通鲢的引物，其特征在于：所述引物为B25V31F2和 B25V31R2，B25V31F2和B25V31R2的序列分别为B25V31F2：TCCTCTTGCTCAACATCTGGT；B25V31R2：CTGTTCCCTCTACTACTACCTTTT。
2.一种区分长丰鲢和普通鲢的方法，其特征在于，包括以下步骤：以权利要求1中所述的引物对样品DNA进行扩增，出现437bp大小条带即为长丰鲢。
3.根据权利要求2所述的一种区分长丰鲢和普通鲢的方法，其特征在于，对样品DNA进行扩增的PCR反应体系包括：2.5 μL 的10×PCR buffer mix，上下游引物各0.5μL，1 μL的模板，0.5 μL的5U/μl Taq DNA polymerase，20 μL的ddH2O。
4.根据权利要求2所述的一种区分长丰鲢和普通鲢的方法，其特征在于，对样品DNA进行扩增的PCR反应程序为95℃预变性5 min；35个循环，包括95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s；72℃延伸10 min，4℃保存。
5.根据权利要求2所述的一种区分长丰鲢和普通鲢的方法，其特征在于：扩增结束后，取2 μL PCR扩增产物和2 μL溴酚蓝混匀后进行电泳检测。
6.如权利要求1所述的一种区分长丰鲢和普通鲢的引物在长丰鲢品种鉴定中的应用。
7.如权利要求2-5任一所述的一种区分长丰鲢和普通鲢的方法在长丰鲢品种鉴定中的应用。
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