CN108949763A - 能有效抑制猪瘟病毒感染的精确突变LamR基因及应用 - Google Patents

能有效抑制猪瘟病毒感染的精确突变LamR基因及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108949763A
CN108949763A CN201810926331.6A CN201810926331A CN108949763A CN 108949763 A CN108949763 A CN 108949763A CN 201810926331 A CN201810926331 A CN 201810926331A CN 108949763 A CN108949763 A CN 108949763A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lamr
gene
sgrna
pig
swine fever
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810926331.6A
Other languages
English (en)
Inventor
欧阳红生
谢子聪
逄大欣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jilin University
Original Assignee
Jilin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jilin University filed Critical Jilin University
Priority to CN201810926331.6A priority Critical patent/CN108949763A/zh
Publication of CN108949763A publication Critical patent/CN108949763A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供两种能有效抑制猪瘟病毒感染的精确突变LamR基因，在猪LamR基因中一个能有效抑制猪瘟猪瘟病毒吸附的位点，且该位点的突变能用于抑制猪瘟病毒对宿主细胞的吸附作用。利用CRISPR/Cas9介导的精确点突变技术，成功的对猪LamR基因进行了精确的点突变修饰，突变后的LamR基因增强了猪体抵抗猪瘟的能力；本发明在引入该点突变过程中没有引入任何的外源的启动子基因及正负筛选标记基因，大大的增加的转基因猪的安全性，对去除转基因猪农产品的生物、食品安全隐患具有重要意义。

Description

能有效抑制猪瘟病毒感染的精确突变LamR基因及应用
技术领域
本发明公开了能有效的抑制猪瘟病毒感染的精确突变的LamR基因的突变位点及氨基酸序列，同时还公开了猪LamR基因272位氨基酸的精确突变在抗猪瘟病毒研究中的应用，属于生物工程技术领域。
技术背景
层粘连蛋白受体（Laminin receptor, LamR）由295个氨基酸分子组成，编码为885bp。依据其分子量大小，LamR可分为37kDa（37-kDa LamR）和67kDa（67-kDa LamR）两种形式。目前认为，37-kDa LamR是67-kDa LamR的前体，大量分布于细胞质中，是一种多功能蛋。67-kDa LamR实际上是由同一基因表达的具有多功能的蛋白质，既可以介导细胞与细胞外基质的粘附作用，又可以作为核糖体的一种组成成分，参与了核糖体的组装、成熟过程，同时又与肿瘤的多药耐药性有关。而且在生物进化过程中具有严格的保守性，提示该蛋白可能具有更为重要的生物学功能。67-kDa LamR 还与多种病原体的侵入相关，包括辛德比斯病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、De V、腺联病毒等。近期有研究人员确定，LamR是猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）的吸附受体，LamR与已知CSFV受体HS相互协同，通过与猪瘟病毒的Erns蛋白结合来入侵宿主细胞以此来介导CSFV感染。
基因组定点编辑技术是实现动物品种改良和构建人类疾病动物模型的重要研究工具，与传统的转基因技术相比，基因编辑技术不依赖于胚胎干细胞，能够应用于更多物种，并且具有效率高、定向修饰精确、所需时间短以及得到的突变可以稳定遗传等优点。最近，在基因组定点修饰方面有了突破性的进展，科学家发现了一种新的基因组定点编辑技术——CRISPR/Cas9系统。CRISPR/Cas9 系统是利用 RNA 引导核酸酶对基因组 DNA 进行定点修饰，现已广泛地应用于小鼠、斑马鱼、猪、羊等多个物种，暗示 CRISPR/ Cas9 基因组编辑技术能够摆脱动物无干细胞系的限制，并且可在任何动物中实现定向、精准的基因修饰。
由于是通过CRISPR/Cas9为基础的点突变技术制备而来，进一步降低了转基因食品安全问题，提供了市场支撑。同时，本发明有利于对CSFV感染机制及感染周期的理解，在减少CSF危害的同时也可为病毒性疾病的治疗及药物靶点研究提供参考。
发明内容
本发明提供两种能有效抑制猪瘟病毒感染的精确突变LamR基因，在猪LamR基因中一个能有效抑制猪瘟猪瘟病毒吸附的位点，且该位点的突变能用于抑制猪瘟病毒对宿主细胞的吸附作用。
本发明所提供了一种能有效编辑猪LamR基因的sgRNA的RNA序列，其特征在于：该sgRNA的RNA序列如：SEQ ID 1所示，互补链的RNA序列如：SEQ ID 2所示。
本发明还提供了一种能有效编辑猪LamR基因的sgRNA的DNA序列，其特征在于：该sgRNA的DNA序列如SEQ ID 3所示，互补链的DNA序列如：SEQ ID 4所示。
本发明上述的能有效的抑制猪瘟病毒的感染精确突变的猪LamR基因的制备方法，包括以下步骤：
1）在基因库中调出猪LamR基因的序列，根据PAM序列（NGG）选择用于基因编辑的sgRNA靶向的区域；
2）根据靶位点的序列，设计并合成对应的引物序列，该引物的DNA序列如SEQ ID 3所示，互补链的DNA序列如：SEQ ID 4所示；
3）引物退火形成寡聚核苷二聚体（oligoduplex）；
4）将寡核苷酸二聚体连接到相应的质粒载体中，即可获得sgRNA的表达载体；
5）筛选出具有较高切割效率的sgRNA；
6）根据筛选的sgRNA的切割位点设计单链的核苷酸载体（Donor），猪LamR基因第272位苏氨酸突变为丙氨酸的单链核苷酸载体的DNA序列如SEQ ID 5所示，猪LamR基因第272位苏氨酸突变为丙氨酸的单链核苷酸载体的DNA序列如SEQ ID 6所示；
7）将sgRNA和单链核苷酸Donor同时通过转染的方法引入到细胞中，后续再结合细胞筛选及鉴定技术即可获得两种猪LamR基因精确定点突变的细胞克隆。
本发明所述的猪LamR基因272位氨基酸的精确突变在抗猪瘟病毒中的应用，其特征在于：猪LamR基因272位氨基酸突变能有效抑制猪瘟病毒的吸附作用在制备抑制猪瘟病毒的感染药物中的应用，以及在构建抗猪瘟病毒细胞系和制备精确点突变抗猪瘟病毒基因编辑猪中的应用。
本发明将LamR蛋白的272位苏氨酸突变为丙氨酸，即将272位氨基酸-苏氨酸对应的密码子TGG中的胸腺嘧啶（T）精确突变为C（胞嘧啶），或者将将272位氨基酸-苏氨酸对应的密码子TGG中的胸腺嘧啶（T）精确突变为A（腺嘌呤）能有效阻止猪瘟病毒对宿主细胞的吸附作用，从而增强猪体抵抗猪瘟病毒的能力。
本发明通过CRISPR/Cas9为基础的精确点突变技术成功的筛选获得了LamR点突变的细胞系，接着对这些突变的细胞克隆进行病毒接种实验，结果证实这些点突变的细胞系能有效的抵抗CSFV的侵入。
本发明的积极效果在于：
利用CRISPR/Cas9 介导的精确点突变技术，成功的对猪LamR基因进行了精确的点突变修饰，突变后的LamR基因增强了猪体抵抗猪瘟的能力；本发明在引入该点突变过程中没有引入任何的外源的启动子基因及正负筛选标记基因，大大的增加的转基因猪的安全性，对去除转基因猪农产品的生物、食品安全隐患具有重要意义。
附图说明：
图1：猪LamR基因精确点突变的序列信息及突变示意图；
图2：高效切割的sgRNA的筛选；
图3：细胞克隆的筛选及测序鉴定；
图4：通过酶切及电泳来鉴定精确点突变的细胞克隆；
图5：IFA法评估各点突变猪胎儿成纤维细胞克隆抗猪瘟病毒的能力；
图6：IFA法评估各点突变PK-15细胞克隆抗猪瘟病毒的能力；
图7：免疫荧光检测分析突变细胞克隆中的LamR基因表达情况。
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1
1-1、 猪LamR基因精确点突变的序列信息及突变示意图
对猪、人、小鼠、牛、羊等多个物种LamR的氨基酸序列进行同源性比对，发现LamR在不同物种间存在高度的保守性。利用NCBI获得猪LamR基因的完整序列,查找出LamR基因的转录本，编码框，编码蛋白等信息并通过Esemble (http://ensembl.org.index.html)网站对该基因的生物学信息进行核实。确定了突变的位点及sgRNA的编辑区域；参见图1：AA为LamR的氨基酸序列；绿色下划线对应的序列为sgRNA的把向序列；T为翻译链对应的DNA序列，NT为非翻译链对应的序列；T>A为苏氨酸突变为丙氨酸；T>S为苏氨酸突变为丝氨酸；蓝色字母为野生型的碱基，红色字母表示突变的碱基（注：除苏氨酸（Thr）为目的突变外，其它红色标注的碱基突变均为同义突变。
、sgRNA序列的设计及PX330表达载体的构建及筛选
设计并合成了2条针对猪ROSA26位点的sgRNA序列。上述设计完成的shRNA序列合成；4条单链的sgRNA的DNA序列分别经过退火后形成2条靶向猪LamR基因的sgRNA的寡核苷酸链；然后将该寡聚核苷酸连连入PX330质粒载体。
这2条sgRNA的序列及其作用位点的序列分别为：
sgRNA-LamR1序列：5-GCAGACCAATCTTCAGTGGT-3；
sgRNA- LamR1作用位点的序列：5-ACCACTGAAGATTGGTCTGC-3；
sgRNA-LamR2序列：5- GAGCTGCAGACCAATCTTCAG-3；
sgRNA-LamR2作用位点的序列：5- CTGAAGATTGGTCTGCAGCTC-3；
其中，本发明所涉及的
sgRNA的RNA序列为：5- GAGCUGCAGACCAAUCUUCAG -3 ；
sgRNA的RNA序列的互补序列为：5- ACCACUGAAGAUUGGUCUGC -3 ；
其中，本发明所涉及的
sgRNA的DNA序列为：5- GCAGACCAATCTTCAGTGGT -3 （SEQ ID NO.3）；
sgRNA的DNA序列的互补序列为：5- ACCACTGAAGATTGGTCTGC -3 （SEQ ID NO.4）；
对这2种sgRNA的表达载体进一步的测序后，进行质粒的大提和质粒的乙醇沉淀，将纯化后一定浓度的2种sgRNA的PX330的表达载体，通过电穿孔转染的方式引入到猪的胎儿成纤维细胞中，转染后的72小时，提取各组细胞的基因组，然后用特异性的检测突变效率的引物进行pcr反应，将所获得的PCR产物一方面送去测序通过对测序峰图的分析初步评估个sgRNA的切割效率，同时将剩下的PCR产物用于连T载体或同过T7E1分析来精确的评估各sgRNA对靶基因的切割效率。参见图2，通过PCR产物测序反应中套峰出现情况对筛选高效切割的sgRNA。
、PX330质粒与单链核苷酸模板的共转染
复苏原代猪的胎儿成纤维细胞，传至F4代时，消化F4代的猪的胎儿成纤维细胞，用DPBS洗2-3遍后，弃上清，加入电转染缓冲液，然后将PX330质粒与单链核苷酸模板按比例加入到细胞和电转缓冲液中，用移液器轻轻混匀后，轻轻的将混合液移入电极杯中，将电极杯放到电穿孔仪器上进行电击操作。电击完成后，将电极杯在4℃静置10分钟后，将电极杯中的混合液转入细胞培养皿中。最后将该细胞培养皿置于39℃二氧化碳培养箱中培养。培养12小时后，换液。
、点突变细胞克隆的筛选及鉴定
根据筛选出的高效sgRNA设计并构建与该sgRNA对应的单链核苷酸模板，该单链核苷酸模板长90bp，包括：突变区域序列、上游同源序列以及下游同源序列。该单链核苷酸模板与筛选出的sgRNA共同作用可以对猪基因组的LamR基因进行精确的定点突变，为了防止CRISPR/Cas9的再切割问题，我们在sgRNA的识别区引入了同义突变。然后再结合PCR、酶切及测序的方法可以方便地分析细胞克隆中LamR基因的定点突变情况。参见图3为点突变细胞克隆的测序结果；WT为野生型细胞的测序峰图；红色灯泡所示为突变的目的碱基，其中T>C为苏氨酸突变为丙氨酸的测序峰图，T>A为苏氨酸突变为丝氨酸的测序峰图；红色方框中的序列为同义突变时引入的BtgⅠ的酶切位点序列。
在引入同义突变的同时本发明成功的将BtgⅠ酶切位点也引入到了LamR基因中，该酶切位点的引入进一步增加了后续点突变细胞克隆鉴定的便捷性和可靠性。参见图4 LamR基因突变区域的PCR产物的BtgⅠ酶切及电泳结果。
综上所述，通过以上步骤，我们成功的获得了含有精确点突变的LamR基因细胞克隆。
试验例1
点突变细胞克隆的抗猪瘟病毒能力评估
将筛选出的点突变细胞克隆进行扩大培养，之后将扩大培养后的克隆进行。参见图5，通过IFA分析各点突变猪胎儿成纤维细胞克隆抗猪瘟病毒的能力；LamR T/T为野生型；LamRT/A 为丙氨酸杂合子；LamR A/A为丙氨酸纯合子； LamR T/S 为丝氨酸杂合子；LamR S/S为丝氨酸纯合子；蓝色为Hoechest33342染核结果。
为了更进一步的证实猪LamR基因272位氨基酸的精确突变所产生的抗猪瘟病毒的性能，我们接着对PK-15细胞系进行了CRISPR/Cas9为基础的精确点突变修饰。接着对筛选出的阳性点突变的PK-15细胞系接种猪瘟病毒实验，结果证实这些精确点突变的PK-15细胞克隆同样具有较好的抗猪瘟病毒的能力。参见图6，通过IFA分析各点突变PK-15细胞克隆抗猪瘟病毒的能力；LamR T/T为野生型；LamR A/A为丙氨酸纯合子；LamR S/S为丝氨酸纯合子。
试验例2
通过LamR特异性的抗体为基础的免疫荧光实验，参见图7如免疫荧光检测分析突变细胞克隆中的LamR基因表达情况。
综上所述，含有精确点突变的LamR基因的细胞系减弱了猪瘟病毒对宿主细胞的吸附作用，LamR基因272位苏氨酸的精确突变使得猪源细胞获得了更强的抵抗猪瘟猪瘟病毒感染的性能。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 能有效抑制猪瘟病毒感染的精确突变LamR基因及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> 能有效编辑猪LamR基因的sgRNA(Classical swine fever virus)
<400> 1
gcagaccaau cuucaguggu 20
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> 能有效编辑猪LamR基因的sgRNA(Classical swine fever virus)
<400> 2
accacugaag auuggucugc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 能有效编辑猪LamR基因的sgRNA(Classical swine fever virus)
<400> 4
gcagaccaat cttcagtggt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 能有效编辑猪LamR基因的sgRNA(Classical swine fever virus)
<400> 4
accactgaag attggtctgc 20

Claims (6)

1.一种能有效编辑猪LamR基因的sgRNA的RNA序列，其特征在于：该sgRNA的RNA序列如：SEQ ID 1所示，互补链的RNA序列如：SEQ ID 2所示。
2. 一种能有效编辑猪LamR基因的sgRNA的DNA序列，其特征在于：该sgRNA的DNA序列如SEQ ID 3所示，互补链的DNA序列如：SEQ ID 4所示。
3.如权利要求1或2所述的一种能有效编辑猪LamR基因的sgRNA的RNA序列的制备方法，包括以下步骤：
1）在基因库中调出猪LamR基因的序列，根据PAM序列（NGG）选择用于基因编辑的sgRNA靶向的区域；
2）根据靶位点的序列，设计并合成对应的引物序列；
3）引物退火形成寡聚核苷二聚体（oligoduplex）；
4）将寡核苷酸二聚体连接到相应的质粒载体中，即可获得sgRNA的表达载体；
5）筛选出具有较高切割效率的sgRNA;
6）根据筛选的sgRNA的切割位点设计单链的核苷酸载体（Donor）；
7）将sgRNA和单链核苷酸Donor同时通过转染的方法引入到细胞中，后续再结合细胞筛选及鉴定技术即可获得定点突变的细胞克隆。
4.如权利要求1、2所述的一种能有效编辑猪LamR基因的sgRNA的DNA序列在抑制猪瘟病毒的吸附作用中的用途。
5.如权利要求1、2所述的一种能有效编辑猪LamR基因的sgRNA的DNA序列在构建抗猪瘟病毒细胞系的应用。
6.如权利要求1、2所述的一种能有效编辑猪LamR基因的sgRNA的DNA序列在制备精确点突变抗猪瘟病毒基因编辑猪中的应用。
CN201810926331.6A 2018-08-15 2018-08-15 能有效抑制猪瘟病毒感染的精确突变LamR基因及应用 Pending CN108949763A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810926331.6A CN108949763A (zh) 2018-08-15 2018-08-15 能有效抑制猪瘟病毒感染的精确突变LamR基因及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810926331.6A CN108949763A (zh) 2018-08-15 2018-08-15 能有效抑制猪瘟病毒感染的精确突变LamR基因及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108949763A true CN108949763A (zh) 2018-12-07

Family

ID=64469942

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810926331.6A Pending CN108949763A (zh) 2018-08-15 2018-08-15 能有效抑制猪瘟病毒感染的精确突变LamR基因及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108949763A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114369600A (zh) * 2022-01-28 2022-04-19 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院 用于修复Klhl18lowf突变基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统及应用
CN114574526A (zh) * 2021-01-28 2022-06-03 江苏集萃药康生物科技股份有限公司 一种rpsa基因猪源化小鼠模型的构建方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170016027A1 (en) * 2015-07-13 2017-01-19 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
CN106916820A (zh) * 2017-05-16 2017-07-04 吉林大学 能有效编辑猪ROSA26基因的sgRNA及其应用
CN108315306A (zh) * 2018-01-05 2018-07-24 浙江大学 一株高繁殖能力猪瘟病毒及其构建方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170016027A1 (en) * 2015-07-13 2017-01-19 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
WO2017011519A1 (en) * 2015-07-13 2017-01-19 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
CN106916820A (zh) * 2017-05-16 2017-07-04 吉林大学 能有效编辑猪ROSA26基因的sgRNA及其应用
CN108315306A (zh) * 2018-01-05 2018-07-24 浙江大学 一株高繁殖能力猪瘟病毒及其构建方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIANING CHEN等: "The Laminin Receptor Is a Cellular Attachment Receptor for Classical Swine Fever Virus", 《JOURNAL OF VIROLOGY》 *
KNORR,C.等: "Sus scrofa ribosomal protein SA (RPSA), mRNA", 《NCBI》 *
杨晓峰等: "CRISPR/Cas9 基因编辑技术在猪上的应用", 《黑龙江畜牧兽医》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114574526A (zh) * 2021-01-28 2022-06-03 江苏集萃药康生物科技股份有限公司 一种rpsa基因猪源化小鼠模型的构建方法
CN114574526B (zh) * 2021-01-28 2024-03-12 江苏集萃药康生物科技股份有限公司 一种rpsa基因猪源化小鼠模型的构建方法
CN114369600A (zh) * 2022-01-28 2022-04-19 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院 用于修复Klhl18lowf突变基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统及应用
CN114369600B (zh) * 2022-01-28 2024-02-13 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院 用于修复Klhl18lowf突变基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105647969B (zh) 一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法
US11470826B2 (en) Method of conveniently producing genetically modified non-human mammal with high efficiency
CN104745626B (zh) 一种条件性基因敲除动物模型的快速构建方法及应用
CN109385451B (zh) 一种牡蛎CRISPR/Cas9基因编辑方法
CN107475412B (zh) 一种与鸡产蛋性状相关的分子标记及其在鸡育种中的应用
CN108103108A (zh) Cebpa基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用
CN105969882B (zh) 一种与斑点叉尾鮰快速生长相关的单倍型snp分子标记及其检测方法和应用
CN111154758A (zh) 敲除斑马鱼slc26a4基因的方法
CN107338265B (zh) 一种基因编辑系统及应用其对植物基因组进行编辑的方法
CN110747281B (zh) 一种三疣梭子蟹耐低盐的分子标记c62及其应用
CN110205388A (zh) 鸡mmp-11基因5′调控区两个突变位点分子标记方法及其在鸡性早熟性状选育中的应用
CN108949763A (zh) 能有效抑制猪瘟病毒感染的精确突变LamR基因及应用
CN106754949B (zh) 猪肌抑素基因编辑位点864-883及其应用
CN111254203A (zh) 一种三疣梭子蟹耐盐碱的分子标记c325及其应用
WO2019014917A1 (zh) 一种基因编辑系统及应用其对植物基因组进行编辑的方法
CN110066805A (zh) 基因敲除选育adgrf3b基因缺失型斑马鱼的方法
CN106367502A (zh) Spp1基因作为绵羊生长性状的分子标记及其应用
CN113604596A (zh) 检测黄瓜小西葫芦黄化花叶病毒病抗病基因zym的KASP引物及其应用
CN111286545B (zh) 一种三疣梭子蟹耐盐碱的分子标记c0及其应用
CN106480174B (zh) 一种用于猪抗病育种的遗传分子标记方法和应用
CN109706154B (zh) CsPR3基因及其在黄瓜抗枯萎病中的应用
CN108251456B (zh) 一种nod遗传背景的动脉粥样硬化小鼠模型的制备方法
Lohar Textbook of Biotechnology
CN108409844A (zh) 蛋白质TaNRT2.5在调控植物产量中的应用
CN108864265A (zh) 蛋白质TabZIP60在调控植物根系发育中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20181207

RJ01 Rejection of invention patent application after publication