CN114369600A - 用于修复Klhl18lowf突变基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于修复Klhl18^lowf突变基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统及应用，该系统包括特异性靶向Klhl18^lowf的sgRNA、同源修复供体模板以及Cas9，并通过腺相关病毒载体递送，形成有效修复突变基因的编辑系统。本发明通过纯合Klhl18^lowf小鼠模型实验，评价其对听力功能的影响，结果发现该系统能对患病小鼠进行精准的体内同源介导修复，成功纠正点突变，且小鼠注射该系统后长达24周内，可观察到听觉功能恢复、纤毛形态变规则、IHC持续囊泡释放功能恢复等，直观地验证了本发明系统对Klhl18^lowf导致的感音神经性聋的治疗作用，能够用于制备治疗感音神经性聋的药物。

Description

用于修复Klhl18lowf突变基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统及 应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域、医药领域，具体涉及一种用于修复Klhl18^lowf基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统及应用。

背景技术

尽管研究发现超过100个基因和超过6000个基因位点与非综合征型或综合征型耳聋相关，但临床上对于遗传性耳聋的治疗除了佩戴助听器和植入人工耳蜗，尚无其它有效治疗的药物。腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)已被应用于多项临床实验，并已经获得批准应用于临床，对人体细胞生长、形态或分化无明显病理影响，具有安全性高、免疫原性弱、宿主范围广、物理性质稳定、表达时间长及稳定等优点。多项研究表明AAV是目前感音神经性耳聋基因治疗的首选载体。针对隐性遗传性耳聋的基因治疗，传统的方法是以AAV为载体导入外源基因，促进靶蛋白在特定细胞亚群中的正常表达，以辅助听觉功能的恢复。然而，AAV介导的过表达策略可能需要多次给药以维持治疗效果，诱发临床相关免疫反应，而且外源性基因异位过表达可能会引起潜在的风险。

在非综合征型遗传性耳聋中，80％是常染色体隐性遗传性耳聋，其最佳的治疗方法是对基因突变位点进行精准地纠正，进而长久地恢复听力。Kelch-like18(Klhl18)基因位于9号染色体，编码574个氨基酸的蛋白质，其突变后主要引起隐性遗传性耳聋。Klhl18^lowf小鼠是指Klhl18发生p.V55F错义点突变(Chr9:110455454C>A)，纯合子表现为第4周开始出现以低频为主的渐进性听力下降，随着年龄增长，听力下降逐渐累及其它频率，最后发展为全频型严重耳聋，而杂合子听力正常。Klhl18^lowf小鼠的渐进性听力表型为基因治疗提供了干预的窗口。

CRISPR/Cas9系统是近年来兴起的新型基因编辑工具，基于其操作简单、高效性的特点，其已经在疾病的治疗中显示出了巨大的应用潜力。CRISPR/Cas9系统主要由两部分组成，分别为sgRNA和Cas9，二者形成复合体，sgRNA与靶位点DNA通过碱基互补实现定位，同时识别旁边PAM序列，然后Cas9核酸酶切割DNA，导致DNA发生断裂。细胞内主要有两种DNA损伤修复机制：非同源末端连接(Non-homologous end-joining，NHEJ)和同源重组修复(Homologous recombination，HR)。NHEJ修复后，在断裂处会引入碱基的插入或缺失，因此常用于基因的敲除；当有外源性DNA同源模板存在时，利用HR可以实现序列的精确变换或者定点插入。CRISPR/Cas9介导的HR已被成功用于有效纠正C57BL/6NTac受精卵中的Cdh23ahl等位基因并挽救了相关的听觉表型。然而，尚无关于在出生后阶段(即体内)利用HR在体进行耳聋基因治疗的临床前研究。通过体内提高CRISPR/Cas9介导的精确基因编辑或HR介导的基因敲入的效率，以精准纠正致病突变基因实现听力保护，仍然是一个重大挑战。

发明内容

本发明针对现有技术无法有效精准地修复Klhl18^lowf基因的问题，提供了一种CRISPR/Cas9系统，用以特异性靶向并修复Klhl18^lowf基因，从而治疗由Klhl18^lowf基因导致的感音神经性聋，可制备治疗感音神经性聋的药物。

为解决上述问题，本发明首先提供了一种靶向Klhl18^lowf突变基因的sgRNA，所述sgRNA的靶DNA序列位于突变位点上游100bp以内和/或下游100bp以内。

优选地，所述sgRNA的靶DNA序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示序列中的任意一条。

优选地，所述sgRNA的靶DNA序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种用于修复Klhl18^lowf突变基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统，所述的基因编辑系统包含：同源修复供体模板，以及前面任一项所述的sgRNA。

本发明还提供了一种用于修复Klhl18^lowf突变基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统，所述的同源修复供体模板由下列步骤设计得到：

S1，以Klhl18^lowf基因序列为模板，sgRNA靶向位点为中心，取所述靶向位点上游不少于200bp和下游不少于200bp的序列，得到同源臂序列；所述同源臂序列包含Klhl18^lowf突变位点，和所述sgRNA的靶DNA序列及其识别的PAM序列；

S2，纠正所述同源臂序列上突变氨基酸序列对应的碱基为野生型氨基酸序列对应的碱基；

S3，检查所述sgRNA的靶DNA序列及其识别的PAM序列是否覆盖Klhl18^lowf突变位点，若未覆盖，则需在步骤S2得到的序列上引入同义突变，将其中的PAM序列改成同义突变序列后，进行步骤S4；否则，直接进行步骤S4；

S4，在步骤S2或S3得到的序列两端各加上所述sgRNA的靶DNA序列及其识别的PAM序列，形成最终的同源修复供体模板。

优选地，所述的Cas9为SaCas9-KKH。

优选地，所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统通过腺相关病毒载体递送；进一步地，所述的腺相关病毒为AAV9或AAV-PHP.eB。

本发明还提供了一种用于修复Klhl18^lowf突变基因的试剂盒，所述试剂盒包含：前面任一项所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统。

本发明还提供了前面任一项所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统在制备治疗感音神经性聋的药物中的应用，所述的感音神经性聋为Klhl18^lowf突变基因导致的疾病。

本发明还提供了一种治疗遗传性感音神经性聋的药物组合物，所述的药物组合物包括：前面任一项所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，以及药学上和生理学上可接受的载体。

相对于现有技术，本发明的有益效果是：

(1)本发明基于CRISPR/Cas9-HMEJ原理，提供了一种用于修复Klhl18^lowf基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统，且通过纯合Klhl18^lowf小鼠模型实验，评价其对小鼠听力损失的影响，结果发现该系统能对Klhl18^lowf小鼠内毛细胞进行精准的体内同源介导修复，成功纠正Klhl18^lowf基因C>A的点突变，且Klhl18^lowf小鼠注射治疗系统后长达24周的时间内，可观察到听觉功能恢复，同时还观察到ABR I波潜伏期变短、ABR I波振幅改善、纤毛形态变规则、IHC持续囊泡释放功能恢复等，直观地验证了本发明双AAV治疗系统对Klhl18^lowf突变基因导致的感音神经性聋的治疗作用，能够用于制备治疗感音神经性聋的药物。

(2)本发明首次成功开发了基于HMEJ策略在体内对Klhl18^lowf点突变进行精准有效修复的基因编辑系统，并成功治疗由突变基因导致的隐性遗传性听力损失，为进一步在人类隐性遗传性耳聋(如GJB2、SLC26A4、OTOF、VGLUT3等基因的致病突变所致耳聋)及其他器官系统隐性遗传性疾病中实现安全、持久的基因治疗提供了科学依据。

附图说明

图1为修复Klhl18^lowf突变等位基因的基因组编辑策略；其中：

A为sgRNA的设计；

B为Klhl18^lowf成纤维细胞中Cas9蛋白和sgRNA体外研究示意图；

C为Klhl18^lowf成纤维细胞中三种sgRNA的插入/缺失百分比；

D为Klhl18^lowf成纤维细胞中sgRNA2对内源基因座和整合基因座的基因编辑效果；

E为Cas9、sgRNA2和donor转染Klhl18^lowf成纤维细胞后引起的indel编辑和同源重组修复的频率；

F为Klhl18^lowf成纤维细胞中sgRNA2的脱靶分析。

图2为同源修复供体构建物的构建模式及其基因敲入图；

A为同源修复供体构建物的基因敲入图；其中，Target表示sgRNA的靶向序列；

B为Cas9蛋白、sgRNA2-donor表达载体的构建示意图。

图3为使用双AAV系统进行体内基因组编辑的研究及基因编辑结果；其中：

A为体内研究的实验流程图；

B为P14、10W时治疗组和未治疗组小鼠体内的修复效率检测结果；

C为P14、10W时修复效率最高的注射耳的深度测序结果。

图4为双AAV系统对纯合Klhl18^lowf小鼠内耳听力功能的影响；其中：

A为8周龄时各实验组小鼠耳蜗顶、中圈毛束形态的SEM图像；

B为4、8和12周龄时各实验组小鼠内耳的ABR阈值；

C为8周龄时各实验组小鼠在90dB刺激下引起的ABR I波潜伏期；

D为8周龄时各实验组小鼠在90dB刺激下引起的ABR I波振幅；

E为给予不同去极化时间时各实验组小鼠的ΔC_m对比；

其中，WT表示野生型小鼠，Homo-untreated表示纯合Klhl18^lowf小鼠未治疗组，Homo-treated表示纯合Klhl18^lowf小鼠治疗组。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

术语说明

如本发明所用，所述的“双AAV系统”“双AAV治疗系统”“双AAV病毒治疗系统”均可以互换使用，表示AAV-PHP.eB-sgRNA-donor和AAV9-SaCas9-KKH混合使用。

本发明所述的“二次切割”为：实际应用中发现，在完成修复之后sgRNA很大概率会再次定位结合到靶序列上，并再次进行双链切割，从而将原本已修复完成的序列进行再次更改。

本发明首先提供了一种靶向Klhl18^lowf突变基因的sgRNA，所述sgRNA的靶DNA序列位于突变位点上游100bp以内和/或下游100bp以内。

优选地，所述sgRNA的靶DNA序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示序列中的任意一条。

优选地，所述sgRNA的靶DNA序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明另一方面还提供了一种用于修复Klhl18^lowf突变基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统，所述的基因编辑系统包含：同源修复供体模板，以及前面任一项所述的sgRNA。

本发明另一方面还提供了一种用于修复Klhl18^lowf突变基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统，所述的同源修复供体模板由下列步骤设计得到：

S1，以Klhl18^lowf基因序列为模板，sgRNA靶向位点为中心，取所述靶向位点上游不少于200bp和下游不少于200bp的序列，得到同源臂序列；所述同源臂序列包含Klhl18^lowf突变位点，和所述sgRNA的靶DNA序列及其识别的PAM序列；

S2，纠正所述同源臂序列上突变氨基酸序列对应的碱基为野生型氨基酸序列对应的碱基；

S3，检查所述sgRNA的靶DNA序列及其识别的PAM序列是否覆盖Klhl18^lowf突变位点，若未覆盖，则需在步骤S2得到的序列上引入同义突变，将其中的PAM序列改成同义突变序列后，进行步骤S4；否则，直接进行步骤S4；

S4，在步骤S2或S3得到的序列两端各加上所述sgRNA的靶DNA序列及其识别的PAM序列，形成最终的同源修复供体模板。

优选地，所述的Cas9为SaCas9-KKH。

优选地，所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统通过腺相关病毒载体递送；进一步地，所述的腺相关病毒为AAV9或AAV-PHP.eB。

本发明另一方面还提供了一种用于修复Klhl18^lowf突变基因的试剂盒，所述试剂盒包含：前面任一项所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统。

本发明另一方面还提供了前面任一项所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统在制备治疗感音神经性聋的药物中的应用，所述的感音神经性聋为Klhl18^lowf突变基因导致的疾病；所述的药物特异性靶向并修复Klhl18^lowf突变基因为野生型基因，从而发挥正常功能。

本发明另一方面还提供了一种治疗遗传性感音神经性聋的药物组合物，所述的药物组合物包括：前面任一项所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，以及药学上和生理学上可接受的载体。

合适的药学上可接受的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceutical Sciences中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、磷酸盐缓冲液、ringer溶液、生理盐水、平衡盐溶液、甘油或山梨醇等。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。

下面对本发明的实验过程及实验结果进行详细说明，从而证明本发明提供的双AAV系统对Klhl18^lowf突变基因导致的感音神经性聋的治疗作用，能够用于制备治疗相关感音神经性聋的药物。

本发明实施例中无特别说明外，所用试剂及耗材均为市售商品。

本实验纯合Klhl18^lowf(Klhl18^WT作为对照)小鼠来源于Karen P.Steel教授(Wolfson Centre for Age-Related Diseases,King’s College London,Guys Campus,London,SE1 1UL,UK)，实验动物的研究得到复旦大学实验动物伦理委员会和上海市医学实验动物管理委员会的批准。所有动物均在复旦大学实验动物科学系饲养，所有实验程序均按照动物研究的政策和伦理进行。

(一)设计、筛选和构建双AAV系统及其体外基因组编辑实验

1、Cas9蛋白的选择

Klhl18^lowf小鼠有C到A的变化(Chr9:110455454C>A；V55F)。为了设计可能更多合适的sgRNA，因此本发明选择了识别PAM序列更简单的Cas9，即SaCas9-KKH；同时其大小可以被单个AAV包装，最终构建形成AAV9-SaCas9-KKH表达载体(图2的B)。

2、sgRNA的设计

在Genebank中找到Klhl18基因的序列，针对Klhl18基因的第二外显子(Exon2)设计了三种sgRNA，sgRNA设计图(图1的A)显示了三种sgRNA的靶向序列，分别为：

sgRNA1(g1)：GTGAGCACTGAACTTGTGGTC(SEQ ID NO：1)；

sgRNA2(g2)：GGACCACAAGTTCAGTGCTCA(SEQ ID NO：2)；

sgRNA3(g3)：GGATGGAGGCCGCTAAGAAGA(SEQ ID NO：3)。

图1中的B图表示Cas9蛋白和sgRNA的体外编辑研究过程：获取新生纯合Klhl18^lowf小鼠的皮肤成纤维细胞，将表达SaCas9-KKH和sgRNA的质粒转染至细胞中，培养5天后提取基因组DNA，进行二代测序，分析测序结果得到三种sgRNA对突变位点的编辑效率，以筛选出编辑效率高的sgRNA待后续体内治疗使用；后续进一步检测编辑效率最高的sgRNA的脱靶情况，以评估其安全性。结果表明，与sgRNA1和sgRNA3相比，sgRNA2在Klhl18^lowf小鼠皮肤成纤维细胞中的靶向插入或缺失率更高(图1的C)。

另外，本发明使用Cas-OFFinder软件预测了sgRNA2的潜在脱靶位点，检测了SaCas9-KKH和sgRNA2表达质粒共转染的纯合Klhl18^lowf成纤维细胞中候选的15个脱靶位点的插入或缺失频率，与仅转染SaCas9-KKH表达质粒组相比，没有观察到明显的插入缺失突变(图1的F)，表明该系统具有高特异性。

以上结果表明，与sgRNA1和sgRNA3相比，sgRNA2是更好的策略，并使用sgRNA2用于后续实验。需要说明的是，本发明对所述sgRNA的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的sgRNA的来源即可，例如委托基因合成公司合成。

3、针对sgRNA2设计同源修复供体模板

图2表示本发明同源修复供体构建物的构建模式及其基因敲入图。结合图1的A和图2的A可知，针对筛选出来的sgRNA2，其识别的PAM序列为CCGGAT，用于突变位点修复的供体DNA模板(donor)的设计流程为：首先，在Klhl18^lowf基因的序列上，以sgRNA2靶向位点为中心，上游、下游各取不少于200bp的DNA序列作为左、右同源臂(本实施例中左同源臂长800bp，右同源臂长800bp)，左右同源臂形成的DNA序列上包含突变位点和sgRNA2靶向序列及其识别的PAM序列，由此，首先将需要纠正的突变位点在同源臂上进行纠正，同时，因为sgRNA2的靶向序列及对应的PAM序列不覆盖突变位点(即Klhl18^lowf基因的突变位点不包含在sgRNA2的靶向序列及对应的PAM序列上)，为了防止潜在的sgRNA2诱导的donor切割和二次切割的发生，降低基因突变修复效率，本发明在donor上引入同义突变：将原本能被sgRNA2识别的PAM序列CCGGAT改为不能识别CCGTAT，引入同义突变不会改变其氨基酸类型，也就不会影响蛋白质的正确表达；最后在左右同源臂两侧各加上sgRNA2的靶向序列和识别的PAM序列CCGGAT，形成最终的同源修复供体DNA模板(donor)片段。本实施例中，针对sgRNA2设计的同源修复供体模板的序列如SEQ ID NO：4所示。

如图2的B所示：本实施例构建两个表达载体，其中一个表达Cas9蛋白，其递送载体为AAV9病毒载体，表示为AAV9-SaCas9-KKH；另一个同时表达sgRNA2和donor，其递送载体为AAV-PHP.eB病毒载体，表示为AAV-PHP.eB-sgRNA-donor。

在一些实施例中，也可将Cas9蛋白和sgRNA2构建在一个表达质粒中，donor构建在另一个表达质粒；或Cas9蛋白、sgRNA2和donor分别构建为三个表达质粒。

4、使用双AAV系统进行体外基因组编辑实验

将AAV9-SaCas9-KKH质粒和AAV-PHP.eB-sgRNA-donor质粒共转染至新生纯合Klhl18^lowf小鼠的皮肤成纤维细胞中，培养5天后检测其编辑情况。

结果表明，双AAV系统在体外对内源基因座产生了显著的插入或缺失编辑和同源重组修复(图1的E)，但对整合基因座没有产生基因编辑(图1的D)，证明了本发明sgRNA2不会对修复后的模板进行二次编辑。

(二)使用双AAV系统进行体内基因组编辑实验

1.实验过程

图3中的A图表示为使用双AAV系统进行体内基因组编辑的实验流程：包装AAV9-SaCas9-KKH和AAV-PHP.eB-sgRNA-donor病毒治疗系统。Klhl18^lowf新生小鼠出生1天(P1)后，冰麻实验动物，在显微镜辅助下开放鼓室外侧壁，调整合适角度，暴露术野；将微量注射仪连接注射玻璃针，玻璃针微细的尖端通过耳蜗侧壁刺入中阶，缓慢通过中阶注入适量双AAV病毒治疗系统；注射结束后，缝合皮下组织及皮肤并复温。

后续进行一系列的检测和观察。

2.检测

(1)听力脑干反应(Auditory brainstem response，ABR)：病毒注射后4周至24周，每隔4周选取合适测听频率(4、8、16和24kHz)测试ABR反应，比较治疗耳和非治疗耳的听力情况。

(2)电镜法检测内毛细胞纤毛形态：将部分内耳注射治疗双AAV系统的小鼠在8周龄施行安乐死，取耳蜗进行扫描电镜检测，通过电子显微镜成像，观察双AAV系统治疗后内毛细胞纤毛的恢复情况。

(3)电生理检检测：将部分治疗组小鼠在P15-17施行安乐死，快速取下耳蜗，进行电生理检测，比较野生型小鼠、纯合Klhl18^lowf治疗组小鼠与纯合Klhl18^lowf未治疗组小鼠的耳蜗内毛细胞钙电流和突触囊泡释放功能。

(4)体内基因编辑效率的检测：纯合Klhl18^lowf小鼠新生1天(P1)内耳显微注射双AAV病毒治疗系统，7天后(P7)取双侧基底膜进行体外培养；再培养7天后，相当于P14时将培养的Corti氏器提取基因组DNA，进行深度测序，分析测序结果得到编辑效率(包括修复效率和indel效率)，未注射耳作为对照。另一个取材时间点为注射后10周，直接将注射耳和未注射耳的耳蜗膜性组织提取基因组DNA，进行深度测序，分析测序结果得到编辑效率。

3.实验结果

(1)双AAV系统体内基因组修复的效率

在小鼠P14和10周龄时，进行双AAV系统体内基因编辑的检测。结果表明，通过P1时小鼠内耳注射双AAV治疗系统，本发明成功纠正Klhl18基因C>A点突变，从整个耳蜗组织提取基因组DNA进行深度测序，得到的数据显示其体内修复效率在P14时为0.10％，随着编辑时间的延长，10周龄的修复效率提高至0.32％，而在未注射耳中，没有观察到明显的插入缺失或修复编辑(图3的B、C)。另外想要说明的是，由于Corti氏器中的毛细胞(治疗系统的主要转染细胞)仅占用于测序的细胞总数的1.5％，所得到的编辑效率实际上被明显低估。

以上结果表明双AAV系统同样可以在体内特异性地编辑Klhl18^lowf基因。

(2)通过双AAV系统进行Klhl18^lowf基因修复后能改善小鼠毛束形态

内毛细胞上的静纤毛束负责声音检测，静纤毛的形态缺陷会导致耳聋。因此，在本发明中，采用电子显微镜扫8周龄的治疗组和未治疗组纯合Klhl18^lowf小鼠耳蜗，以评估毛束形态，同时扫描野生型小鼠耳蜗作对照。结果如图4的A图所示，与野生型小鼠相比，未治疗组小鼠的内毛细胞最高一排静纤毛表现为更长、更细且顶端成尖细的锥形，而治疗组小鼠的耳蜗有部分内毛细胞的静纤毛恢复正常的形态，表现为最高一排静纤毛大部分呈柱形且更短。在治疗组小鼠的耳蜗顶、中圈，观察到平均约16％的内毛细胞具有正常或接近正常的纤毛束形态。

由此说明，双AAV治疗系统可修复由Klhl18^lowf引起的纤毛束缺失和形变。

(3)通过双AAV系统进行Klhl18^lowf基因修复后能改善小鼠听力功能

为了研究双AAV系统对纯合Klhl18^lowf小鼠听力功能的影响，本实施例记录了ABR，评估治疗组小鼠4kHz至32kHz频率范围内的听力恢复情况。结果表明，在8周时，与未治疗组相比，经过双AAV系统治疗的小鼠耳蜗在8、16、24和32kHz的ABR阈值均显著降低(图4的B)，平均阈值下降14-19dB，且治疗效果持续至小鼠24周龄(实验观察期)。另外，8周时，相较于未治疗组小鼠，治疗组小鼠耳蜗中8kHz、16kHz和32kHz的90dB SPL声音刺激的I波潜伏期更短，ABR I波振幅也有明显改善(图4的C、E)。

以上结果表明，本发明双AAV治疗系统能改善听觉功能，且治疗效果持续至小鼠24周龄。

(4)通过双AAV系统进行Klhl18^lowf基因修复后能改善内毛细胞突触囊泡释放能力

为了评估双AAV系统进行Klhl18^lowf基因修复后对内毛细胞钙电流和突触囊泡释放能力的影响，本发明进行了相关电生理检测，结果发现：双AAV系统处理的纯合子Klhl18^lowf、未处理的纯合子Klhl18^lowf和Klhl18^WT小鼠的内毛细胞(IHC)Ca²⁺电流(I_Ca)没有显着差异，表明Klhl18^lowf突变不影响IHC的IC；进一步地，本发明给予内毛细胞一去极化刺激，改变去极化时间(10，30，100和200ms)并记录内毛细胞膜电容的改变(ΔC_m)，结果如图4中的E图所示，在较长时间(200ms)的去极化脉冲刺激条件下，未注射耳的内毛细胞膜电容(38.65±4.45fF)与野生型(51.75±3.46fF)相比明显下降，而双AAV治疗系统能将注射耳内毛细胞膜电容(58.29±4.17fF)恢复至野生型水平。

以上结果表明，本发明双AAV治疗系统能修复内毛细胞持续囊泡释放功能。

另外，本发明也对双AAV系统进行了体内脱靶率检测，结果并未发现明显的脱靶效应，说明该系统内耳注射的安全性。

综上所述，本发明提供了一种用于修复Klhl18^lowf基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统，且通过纯合Klhl18^lowf小鼠模型实验，评价其对小鼠听力损失的影响，结果发现该系统能对Klhl18^lowf小鼠内毛细胞进行精准的体内同源介导修复，成功纠正Klhl18^lowf基因C>A的点突变，且Klhl18^lowf小鼠注射治疗系统后长达24周的时间内，可观察到听觉功能恢复，同时还观察到ABR I波潜伏期变短、ABR I波振幅改善、纤毛形态变规则、IHC持续囊泡释放功能恢复等，直观地验证了本发明双AAV治疗系统对Klhl18^lowf突变基因导致的感音神经性聋的治疗作用，能够用于制备治疗感音神经性聋的药物。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

序列表

<110> 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院

<120> 用于修复Klhl18lowf突变基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgagcactg aacttgtggt c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggaccacaag ttcagtgctc a 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggatggaggc cgctaagaag a 21

<210> 4

<211> 1654

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaccacaag ttcagtgctc accggatgac agacctctct gagttcaagt tccaggccaa 60

ctagggctac atatttacct ctcacaaccc tgactcaaat aggactggaa aggcgactca 120

gtagctaaga gcatgttaga gaaatgacct ctgacccttt ggactatcaa agacatggcc 180

tctgaccctc tggcagccat tgtagcatag gccattcttg gaagattctg gcagggttat 240

tttctcctgt gacaccatgt gagctgcttg tcatcttcca cagcttgctg tgtcttcagt 300

cctttccccg ccaccctcac cgccctcctc aagtcaagcc ttattttcct ctcctttctt 360

gacactattt ctgtggtttt tggttttggg ggggggtttc ttgttttgtt ttgttttttt 420

acaaatattc ttttaagtgc tctaatttga gtacttttct gtcttttaat aaatctgcct 480

tttaataaac ttggagttcc gataaagtgc tgaagcagtg tgtgttttag agaatgggag 540

gaattgcact gtacataaga gctggtactt gtcactttca ggcttgcttc tgctaccatc 600

tttacacctc atctcttcca ccatcactga gtgtataggc tttatgtgcc cagggagggt 660

ctctgggatg agccttgccc gtctgtcatc cctgggatgt cttccttgtc actgccatga 720

gcaggggtaa gctgtggaaa tcaagatggg gcttttgtag cagtgtcgct caatatttgt 780

ctttgtattc tctttggccc acagattggg gaccacaagt tcagtgctca ccgtatcgtc 840

ttagcggcct ccatcccgta cttccatgct atgtttacga acgacatgat ggagtgcaag 900

caggatgaga ttgtaatgca gggaatggac ccaaggtact gaacctgaac ccctaccatt 960

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Claims (10)

1.一种靶向Klhl18^lowf突变基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的靶DNA序列位于突变位点上游100bp以内和/或下游100bp以内。

2.如权利要求1所述的靶向Klhl18^lowf突变基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的靶DNA序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示序列中的任意一条。

3.如权利要求2所述的靶向Klhl18^lowf突变基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的靶DNA序列如SEQ ID NO：2所示。

4.一种用于修复Klhl18^lowf突变基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述的基因编辑系统包含：同源修复供体模板，以及权利要求1-3中任一项所述的sgRNA。

5.如权利要求4所述的用于修复Klhl18^lowf突变基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述的同源修复供体模板由下列步骤设计得到：

S1，以Klhl18^lowf基因序列为模板，sgRNA靶向位点为中心，取所述靶向位点上游不少于200bp和下游不少于200bp的序列，得到同源臂序列；所述同源臂序列包含Klhl18^lowf突变位点，和所述sgRNA的靶DNA序列及其识别的PAM序列；

S2，纠正所述同源臂序列上突变氨基酸序列对应的碱基为野生型氨基酸序列对应的碱基；

S3，检查所述sgRNA的靶DNA序列及其识别的PAM序列是否覆盖Klhl18^lowf突变位点，若未覆盖，则需在步骤S2得到的序列上引入同义突变，将其中的PAM序列改成同义突变序列后，进行步骤S4；否则，直接进行步骤S4；

S4，在步骤S2或S3得到的序列两端各加上所述sgRNA的靶DNA序列及其识别的PAM序列，形成所述的同源修复供体模板。

6.如权利要求5所述的用于修复Klhl18^lowf突变基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述的Cas9为SaCas9-KKH。

7.如权利要求5所述的用于修复Klhl18^lowf突变基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统通过腺相关病毒载体递送。

8.一种用于修复Klhl18^lowf突变基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：权利要求4-7中任一项所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统。

9.权利要求4-7中任一项所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统在制备治疗感音神经性聋的药物中的应用，其特征在于，所述的感音神经性聋为Klhl18^lowf突变基因导致的疾病。

10.一种治疗遗传性感音神经性聋的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括：权利要求4-7中任一项所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，以及药学上和生理学上可接受的载体。

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