CN106084032B - 一种猪天然免疫蛋白lgp2的突变体及制备与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，公开了一种猪天然免疫分子LGP2的突变体蛋白LGP2S169A及其制备和应用。LGP2S169A突变体蛋白序列为SEQ ID No.4中氨基酸所示。所述构建含有SEQ ID No.4中氨基酸序列的LGP2S169A的质粒所表达的蛋白具有良好的抗口蹄疫病毒的作用,为制备抗口蹄疫病毒药物或佐剂提供了新的靶点和理论支持。

Description

一种猪天然免疫蛋白LGP2的突变体及制备与用途
技术领域
本发明涉及一种蛋白突变体及其制备方法和用途，确切讲本发明涉及一种猪LGP2突变体，以及这种突变体的制备方法和用途。
背景技术
口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，FMDV）属于微RNA病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒属（Aphthovirus），核酸类型为单链正股RNA，包含七个血清型，各型之间无交叉保护反应。口蹄疫是由FMDV感染偶蹄类动物（猪、牛、羊、骆驼等）引起的急性、热性和接触性的一类传染病。该病的发病率高、传染迅速、危害严重，是世界动物卫生组织（OIE）规定的A类烈性动物传染病,我国列为一类动物传染病。扑杀是口蹄疫疫情控制的主要手段，因此该病的爆发和流行对全球养殖业造成了巨大的危害，我国作为一个养殖业大国，也深受口蹄疫的危害。如何有效地控制、预防和治疗口蹄疫是当前科研工作者的一个重要使命和责任。由于口蹄疫血清较多，型间无交叉保护，这给以疫苗免疫为主的控制措施带来了巨大的挑战。而制备用于治疗口蹄疫的药物、制备用于预防或治疗口蹄疫的疫苗是本领域关注的一个重点方向。
模式识别受体（Pattern Recognition Receptors，PRRs）是机体抵抗病原微生物感染的第一道防线，是启动机体先天性免疫反应的重要组成部分。病原微生物感染细胞后，PRRs通过识别病原的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs），促进下游干扰素和细胞因子的分泌，激活一些抗菌或抗病毒蛋白的表达，启动先天性免疫应答。PAMPs为病原微生物所特有，是病原微生物（及其产物）共有的一些非特异性和高度保守的分子结构，可被非特异性免疫细胞所识别。因此，对模式识别受体介导抗病毒作用的研究，对了解机体发挥先天性免疫抵抗各类病原微生物具有重要意义。
迄今为止，已经发现的模式识别受体有四类：TLRs(Toll-like receptors)，RLRs（Retinoic acid-inducible geneⅠ(RIG-Ⅰ)-like helicases receptors, RIG-I-likereceptors），NLRs(NOD-like receptors)和CLRs(C-type lectin receptors)。这些分子分工明确，相互协调，调控机体免疫反应，发挥抗感染作用。RIG-I样受体为模式识别受体中的一类分子，该家族成员至今发现有RIG-Ⅰ、MDA5和LGP2三种分子。RIG-I样受体通过RLR级联信号诱导I型干扰素和炎症因子的产生，在抗病毒天然免疫中起着非常重要的作用。
为了更好地控制口蹄疫的流行和传播，除了深入探索FMDV遗传变异与血清型分布的规律外，同时还需要研究宿主细胞蛋白与FMDV的关系。因为FMDV在感染过程中为了便于自身的复制，经常会修饰或者改变一些宿主蛋白的结构与功能，使得这些宿主蛋白能够有利于病毒自身的复制。病毒篡夺细胞功能为其服务是病毒在进化过程中形成的保持自身繁衍的一种重要手段和机制，因此研究清楚哪些宿主细胞在病毒复制过程中被其利用，以及其利用的具体机制有哪些，这将有利于开发一些抑制病毒复制的佐剂或药物。通过阻断病毒与宿主蛋白结合的靶向位点，使其不能够利用这些蛋白，从而抑制病毒的复制。
LGP2被报道在体外具有负调节RIG-I和MDA5的作用（Takeshi Saito et al.2006, PNAS）。但Takashi Satoh报道LGP2基因敲除型小鼠极易被EMCV等病毒感染，而野生型小鼠的感染率明显偏低，但这一点在针对口蹄疫病毒方面的表现却并不清楚。
发明内容
本发明目的在于提供一种猪LGP2突变体蛋白，以及这种蛋白的制备及在制备抗口蹄疫病毒感染的药物或疫苗中的应用。
本发明的猪天然免疫蛋白LGP2的突变体其氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
本发明的氨基酸序列为SEQ ID NO.4的猪天然免疫蛋白LGP2的突变体的制备方法是：首先以猪的cDNA为模板，用引物首先构建表达猪LGP2的真核表达质粒，再以猪LGP2的真核表达质粒为模板，用引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6进行突变PCR，得到目标产物。
本发明的猪天然免疫蛋白LGP2的突变体可在用于制备抗口蹄疫病毒感染的药物或疫苗中应用。
本发明的相关实验表明，经突变本发明的突变体与猪天然免疫蛋白LGP2相比能更显著的抑制口蹄疫病毒复制，表现出其在制备抗口蹄疫病毒感染的药物或疫苗中的应用的可能。
附图说明
图1 为LGP2全基因的PCR图。附图标记说明：泳道M：DNA Marker 5000；泳道1PCR扩增核酸片段。
图2 为构建LGP2真核表达质粒酶切鉴定结果。泳道M：DNA Marker 5000；泳道1酶切后核酸片段。
图3为构建LGP2S169A突变PCR结果电泳图。附图标记说明：泳道M：DNA Marker5000；泳道1PCR扩增的突变质粒核酸片段。
图4 为构建LGP2S169A真核表达质粒酶切鉴定结果。泳道M：DNA Marker 5000；泳道1酶切后核酸片段。
图5 为口蹄疫病毒感染PK-15细胞不同时间点口蹄疫病毒的mRNA表达水平结果。口蹄疫病毒感染PK-15细胞后0、2、4、8、12和24小时口蹄疫病毒mRNA的相对表达水平。
图6为口蹄疫病毒感染PK-15细胞不同时间点细胞中LGP2基因mRNA表达水平qPCR检测结果。口蹄疫病毒感染PK-15细胞后0、2、4、8、12和24小时细胞LGP2基因mRNA的相对表达水平。结果表明口蹄疫病毒感染可以上调细胞中LGP2 mRNA的表达水平。
图7为 口蹄疫病毒感染对LGP2蛋白表达水平的降解Western blot检测结果。未感染组为转染Myc-LGP2质粒未感染口蹄疫病毒的PK-15细胞中Myc-LGP2蛋白水平，感染组为转染Myc-LGP2质粒后感染口蹄疫病毒的PK-15细胞中Myc-LGP2的蛋白水平；结果表明口蹄疫病毒感染可以减少LGP2的蛋白表达水平。
图8为口蹄疫病毒感染与不感染的PK-15细胞中Myc-LGP2的mRNA表达水平qPCR的结果图。未感染组指转染2μg Myc-LGP2质粒不感染口蹄疫病毒细胞中Myc-LGP2的蛋白表达量，感染组为转染2μg Myc-LGP2质粒感染口蹄疫病毒细胞中Myc-LGP2的蛋白表达量。结果表明口蹄疫病毒感染不降解LGP2 的mRNA。
图9为过表达LGP2蛋白对口蹄疫病毒复制影响的qPCR检测结果。柱状图为PK-15细胞转染Myc-LGP2质粒0、1、2和3μg质粒后接种口蹄疫病毒12小时口蹄疫病毒mRNA的表达水平。结果表明随着Myc-LGP2表达量的增加，口蹄疫病毒的mRNA水平显著下降，病毒复制被显著抑制。
图10为过表达LGP2蛋白对口蹄疫病毒复制影响的病毒滴度检测结果。结果表明随着Myc-LGP2表达量的增加，口蹄疫病毒的滴度显著下降，病毒复制被显著抑制。
图11为过表达LGP2蛋白对口蹄疫病毒复制影响的western blot检测结果。4个泳道分别为转染Myc-LGP2质粒0、1、2和3μg质粒后接种口蹄疫病毒12小时LGP2及口蹄疫病毒蛋白的表达水平，β-Actin为内参。结果表明随着Myc-LGP2表达量的增加，口蹄疫病毒的蛋白表达水平显著下降，病毒复制被显著抑制。
图12 为口蹄疫病毒各个病毒蛋白对LGP2蛋白表达的影响Western blot检测结果。各泳道代表空载体及口蹄疫病毒各个蛋白的表达质粒与Myc-LGP2质粒共表达后LGP2的蛋白表达量水平，结果表明口蹄疫病毒2B蛋白可以减少LGP2蛋白的表达。
图13 为口蹄疫病毒2B蛋白对LGP2各区段及不同突变体的降解情况分析Westernblot检测结果。各个泳道分别指不转染2B和转染2B质粒情况下LGP2及其突变体蛋白的表达情况。结果表明LGP2-K654E、LGP2-T167A/S169A及LGP2-Δ-483-681突变体不能够被2B降解。
图14 为过表达LGP2各个突变体对口蹄疫病毒复制的影响qPCR检测结果。将空载体或各个LGP2突变体转染PK-15细胞后，接种口蹄疫病毒，感染12小时后检测病毒mRNA水平，结果表明LGP2S169A过表达可以抑制口蹄疫病毒mRNA的表达水平，抑制病毒复制。
图15为过表达LGP2S169A2对口蹄疫病毒复制的影响Western blot检测结果。Mock为未感染口蹄疫病毒的PK-15细胞，后四个泳道分别指过表达0μg、0.5μg、1μg和2μgLGP2S169A质粒的PK-15细胞。结果为转染质粒24小时后感染口蹄疫病毒12小时病毒蛋白的western blot检测结果。结果显示LGP2S169A2对口蹄疫病毒的复制具有剂量依赖性。
具体实施方式
本发明以下结合所提供具体实施方式进行详细解说。
实施例1 抗病毒质粒的构建
（1）猪源细胞总RNA的提取
取猪肾上皮细胞(PK-15)培养于35mm细胞培养皿中，待细胞长满后，弃去上清，用PBS清洗细胞3遍。
加入1mL TRIzol进行裂解（吹打悬浮细胞），室温静置5分钟。
加入250 μL氯仿，剧烈震荡，4℃放置10min，萃取抽提RNA。
4℃ 12000 rpm离心15分钟；吸取450 μL上清，移入新的离心管中，并加入等体积异丙醇。-20℃沉淀20分钟。
4℃ 12000 rpm离心10分钟；弃去上清，加入1mL 75%乙醇，轻轻颠倒摇晃3次。洗去盐粒子等杂质。
4℃ 10000 rpm离心5分钟；弃去上清，室温晾干（20分钟），挥发掉乙醇。加入25μLDEPC水，溶解RNA。-80℃保存备用。
（2）反转录获得猪LGP2总cDNA
采用invitrogen公司的反转录试剂盒，按照试剂盒的说明操作进行cDNA合成。具体步骤如下：
配制反应体系(总20 μL体系)：
5×First Buffer 4 μL
0.1M dTT 2 μL
10 mM each dNTPs 1 μL
6nt Random Primers 1 μL
oligo-dT Primers 0.5 μL
M-MLV transcriptase 1 μL
RRI 0.5 μL
H2O 6 μL
RNA 4 μL
反应程序：25℃ 10分钟；37℃ 60分钟；75℃ 10分钟。
（3）猪LGP2 CDS编码核苷酸序列片段的扩增
参照GenBank提供的猪LGP2序列，设计表达引物扩增CDS表达区。以上步骤得到的cDNA为模板，用引物进行扩增，所用的上游引物为SEQ ID NO.7（引入XhoI酶切位点：“TATCTCGAGTTATGGAGCTGCGAC” ），下游引物为SEQ ID NO.8，（引入HindIII酶切位点：“ACAAAGCTTGTCCAGGGAGAGGTC” ）。扩增获得CDS表达区段如图1所示。以合成的cDNA为模板，按照如下体系进行扩增获得CDS片段(总50 μL体系)：
10× PCR Buffer 5 μL
2.5 mM each dNTPs 5 μL
上游引物SEQ ID NO.7 1 μL
下游引物SEQ ID NO.8 1 μL
LA Taq酶 1 μL
H2O 33 μL
cDNA模板 4 μL
反应程序：95℃预变性5分钟；95℃变性40秒，57℃退火30秒，72℃延伸2分30秒，32个循环；72℃延伸10分钟，4℃保存。
进行核酸电泳，利用promega公司的DNA纯化回收试剂盒纯化回收LGP2扩增片段。
（4）LGP2真核表达质粒的构建
将上步回收的片段以及pCDNA3.1分别利用XhoI和HindIII核酸内切酶进行双酶切反应；双酶切体系如下：
10× M Buffer 2 μL
XhoI 0.5 μL
HindIII 0.5 μL
DNA 0.5 μg
H2O 补至总体积20 μL
反应程序：37℃ 2小时。
进行核酸电泳，利用promega公司的DNA纯化回收试剂盒纯化回收酶切产物。将纯化回收产物进行连接反应，反应体系及程序如下：
10× Ligase Buffer 1 μL
T4 DNA Ligase 1 μL
酶切纯化质粒片段 2 μL
酶切纯化LGP2片段 6 μL
16℃ 过夜连接。
将连接产物转化DH-5α大肠杆菌感受态细胞，进行重组质粒的克隆扩增。具体步骤如下：
将感受态细胞与连接产物混合，冰上放置20分钟，42℃水浴热激90秒，冰浴3分钟，加入无抗性LB培养液，37℃，220 rpm摇菌40分钟，利用涂菌棒将转化的大肠杆菌涂布在具有氨苄抗生素抗性的LB平板上，37℃温箱培养12h，观察生长状况。
挑取单克隆菌落，利用含有氨苄抗生素抗性的LB液体培养基摇菌12h，利用promega质粒提取试剂盒提取重组质粒，进行双酶切电泳鉴定。经双酶切鉴定为阳性后。送样北京金唯智生物技术有限公司测序鉴定，分析测序结果表明其核苷酸序列为SEQ IDNO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.2，系猪天然免疫蛋白LGP2。
（5）LGP2突变体真核表达质粒的构建
以测序正确的LGP2真核表达质粒为模板，利用Stratagene公司的PfuUltra II HSDNA Polymerase和突变引物进行突变质粒的扩增，具体反应体系和程序如下：
10×PfuUltra II reaction Buffer 5 μL
10 mM each dNTPs 2.5 μL
上游引物SEQ ID NO.5（10μM） 1 μL
下游引物SEQ ID NO.6（10μM） 1 μL
PfuUltra II HS DNA Polymerase 1 μL
DNA template 100 ng
H2O 补至总体积50 μL
反应程序：95℃，5分钟；95℃ 20秒，58℃ 30秒，72℃ 2分30秒，25个循环；72℃ 10分钟；4℃保存。
1%琼脂糖凝胶电泳检测，选取阳性产物，加入1 μL的DpnⅠ内切酶，37℃酶切消化1h转化大肠杆菌DH5α，涂板抗性筛选，37℃过夜培养，挑取单克隆扩大摇菌后，送样北京金唯智生物技术有限公司测序鉴定，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3，氨基酸序列为SEQ ID NO.4，以本发明的上游引物和下游引物中突出表示的G和C为人工引入的核苷酸突变位点，该位点的突变使得LGP2的169位氨基酸由丝氨酸变为丙氨酸，命名为LGP2S169A。
为比较起见，本发明实验中同时还构建了其它不同位点突变的突变体，分别命名为：LGP2K654E、LGP2N464I、LGP2T167A/S169A、LGP2-Δ-1-175、LGP2-Δ-1-176-482、LGP2-Δ-483-681和LGP2T167A，这些突变体命名中的：654、464、169/167、176-482、483-681和167分别为其突变位点位置。
实施例2 抗病毒蛋白的筛选和应用
（1）口蹄疫病毒的扩增
将BHK细胞（仓鼠肾细胞）铺到T25细胞中，待形成单层细胞后，弃去细胞培养液，PBS洗涤3遍，然后接种1MOI口蹄疫病毒，吸附1个小时，中途每隔20分钟摇晃一次以保证病毒吸附均匀。吸附结束后，弃去病毒上清，PBS洗涤一遍吸取未吸附病毒，加入2.5 mL细胞培养维持液（含0.5%血清的MEM培养液）。观察病变，待细胞完全脱落收集细胞及上清，反复冻融三次，离心过滤收集病毒液，冻存-80℃备用。通过上述扩增方法对O/BY/CHA/2010与Asia1/HN/2006毒株分别进行了扩增。
（2）LGP2抑制口蹄疫病毒复制的研究
将6×105个PK-15细胞铺制于6孔板的单个孔内，共铺4个皿。待细胞长至70%-80%融合度的时候，利用脂质体试剂分别转染Myc-LGP2质粒0、1、2和3μg质粒，转染24小时后，接种1MOI口蹄疫病毒，接种1小时后换为维持液培养。感染12小时后收集细胞，提取RNA进行口蹄疫病毒mRNA水平检测，比较不同组间病毒mRNA水平差异。按照上述方法同样制备4皿样品，提取蛋白利用western blot进行病毒蛋白表达检测。同时收集细胞上清，通过TCID50测定，进行病毒滴度分析。
（3）病毒RNA含量的检测
取制备好的细胞总RNA（内含口蹄疫病毒RNA,本研究分别使用O/BY/CHA/2010与Asia1/HN/2006毒株进行了实验），进行反转录后，利用Takara公司的 SYBR Premix Ex Taq TM试剂盒，按照如下体系和程序进行实时定量PCR检测：
2× SYBR Premix Ex Taq 10 μL
上游引物SEQIDNO.9（5’-CACTGGTGACAGGCTAAGG-3’）（10μM） 0.4 μL
下游引物 SEQIDNO.10（5’-CCCTTCTCAGATTCCGAGT-3’）（10μM） 0.4 μL
H2O 8.2 μL
cDNA模板 1 μl
反应程序：95℃，3分钟；95℃ 10秒，60℃ 34秒，40个循环；Melt Curve；25℃保存。
(4)病毒蛋白含量的检测
感染病毒的PK-15细胞蛋白样品的制备：将感染FMDV细胞的培养上清液轻轻弃去，用预冷PBS漂洗两次待收取的细胞样品，取适量预冷的PBS 覆盖细胞，利用细胞铲刮下细胞，移入离心管中，4000 rpm离心5分钟，弃上清，保留细胞沉淀，即为收获的细胞样品（均在冰上操作）。此时可直接进行样品裂解，或将细胞样品放置在-70℃低温保存。根据收集细胞沉淀的多少加入适量的细胞裂解液，并快速反复吹打重悬细胞样品，冰上裂解5分钟，超声波瞬时破碎（冰上操作，超声2～3次），4℃ 13000rpm离心10min，弃去底部沉淀，取上清于另一预冷离心管中保存。另取2μL收取的上清蛋白用BCA法测定蛋白浓度。剩余样品蛋白上清加入5×SDS PAGE buffer，沸水煮沸变性分钟，4℃ 13000rpm离心5min，取适量上清进行蛋白质电泳，参见：图7和图11，图12、图13、和图15。图7为 口蹄疫病毒感染对LGP2蛋白表达水平的降解Western blot检测结果。未感染组为转染Myc-LGP2质粒未感染口蹄疫病毒的PK-15细胞中Myc-LGP2蛋白水平，感染组为转染Myc-LGP2质粒后感染口蹄疫病毒的PK-15细胞中Myc-LGP2的蛋白水平。图11为过表达LGP2蛋白对口蹄疫病毒复制影响的western blot检测结果。4个泳道分别为转染Myc-LGP2质粒0、1、2和3μg质粒后接种口蹄疫病毒12小时LGP2及口蹄疫病毒蛋白的表达水平，β-Actin为内参。图12 为口蹄疫病毒各个病毒蛋白对LGP2蛋白表达的影响Western blot检测结果。各泳道代表空载体及口蹄疫病毒各个蛋白的表达质粒与Myc-LGP2质粒共表达后LGP2的蛋白表达量水平。图13 为口蹄疫病毒2B蛋白对LGP2各区段及不同突变体的降解情况分析Western blot检测结果。各个泳道分别指不转染2B和转染2B质粒情况下LGP2及其突变体蛋白的表达情况。
SDS-PAGE 凝胶电泳及其电泳图蛋白转印： SDS-PAGE 凝胶及电泳缓冲液均按照分子克隆实验指南配制。每个蛋白样品上样量为40μg，同时单独选孔加入预染蛋白marker作为指示。蛋白样品在浓缩胶时，调用80V电压；待蛋白样品进入分离胶后，调取电压至120V，直至电泳结束。转印前，根据SDS-PAGE凝胶的大小剪取合适的硝酸纤维素膜（NC膜），并在转印缓冲液中浸泡10分钟左右，同时剪取6层滤纸浸泡在转印液中数分钟。按照“膜正胶负” 顺序放置蛋白胶：负极-海绵-3层滤纸-凝胶-NC膜-3层滤纸-海绵-正极，安装好“转印夹心三明治”后，将其放置到全湿转印槽内，加入足够转印缓冲液，接通电源（恒流240mA或恒压65V转印2～3 h），转印槽外部用冰袋辅助降温。待转印结束后，5%的TBST- 脱脂乳封闭NC膜，室温作用2～3h，弃去封闭液，TBST(pH7.6)缓冲液漂洗3次，洗去残留脱脂乳封闭液，随后进行抗体孵育。抗体反应：加入TBST稀释一抗，4℃轻摇振荡过夜(或室温4～6h)，一抗回收利用。TBST轻轻漂洗3 次后，再用TBST 洗2～3 次，每次漂洗10min 。漂洗完毕后，加入HRP标记的二抗，室温作用2 h，作用完毕用TBST轻轻漂洗3次，再用TBST漂洗3次，每次10min。漂洗结束后，进行显色反应。暗室中利用ECL显色试剂盒进行显色。取试剂盒中A液与B液等量混合，然后轻轻均匀地淋湿NC膜，作用1～2min后，将作用的膜放置在x光曝光夹内，在上方放置x光胶片进行曝光。曝光完成的胶片首先放入显影液中进行显影，待所需蛋白条带显示后，用自来水轻轻漂洗胶片，然后将胶片放入定影液中进行定影2～3min。定影结束后，将胶片放入自来水漂洗、进一步晾干、待晾干后标记蛋白Marker，扫描胶片保存结果。
（5）病毒滴度测定
病毒感染：将铺好的单层细胞，用PBS洗3遍细胞，接种1MOI FMDV，37℃吸附1 h，每20min轻轻摇晃一次，保证病毒吸附均匀。吸附1 h后，吸去上清，用PBS 轻轻洗板 1 次。加入含有1% FBS的正常培养液培养。在不同时间点收取样品，进行RNA提取或制备western样品。
病毒效价的测定：提前18～24小时将BHK-21细胞接种96孔板。在细胞形成单层细胞后，用PBS洗3遍BHK-21细胞，接种病毒（10-1～10-10），另设两列阴性对照孔。感染孔，每孔加入100ul病毒滤液或倍比稀释病毒稀释液，37℃吸附1 h，每20min轻轻摇晃一次，保证病毒吸附均匀。吸附1 h后，吸去上清，用PBS 轻轻洗板 1 次。加入病毒维持液。待48h后，每12h观察一次细胞病变情况，72h后记录病变孔数，计算TCID50，平行测定三次，取平均值为最终病毒滴度。
（6）LGP2抗病毒突变体的筛选
图13实验通过口蹄疫病毒2B蛋白对各个LGP2突变体的降解作用进行研究，发现口蹄疫病毒2B蛋白不能够降解LGP2T167A/S169A突变体。因此进一步决定筛选可以抑制FMDV复制的LGP2突变体蛋白。铺制PK-15细胞，待细胞长至约70%后，分别单独转染空载体、LGP2（野生型标记为LGP2-WT）及LGP2各个突变体，转染24h后，接种FMDV（1MOI）。感染12h后，提取总RNA，测定每组样本中病毒RNA的含量。结果表明，LGP2T167A/S169A可以显著由于LGP2，能够更好的抑制FMDV的复制，通过进一步构建LGP2T167A和LGP2S169A突变体，研究发现LGP2S169A是能够抑制FMDV最高效的LGP2突变体蛋白。见图14，结果表明LGP2-WT、LGP2T167A/S169A、LGP2-△176-482、LGP2T167A和LGP2S169A均可以抑制FMDV复制，但LGP2S169A可以发挥最优抗病毒效果。
这些结果表明，LGP2S169A突变体能够显著的抑制FMDV的复制，具有显著的抗FMDV的作用。进一步进行剂量依赖实验（图15），将6×105个PK-15细胞铺制于6孔板的单个孔内，共铺4个皿。待细胞长至70%-80%融合度的时候，利用脂质体试剂分别转染LGP2S169A质粒0、1、2和3μg质粒，转染24小时后，接种1MOI口蹄疫病毒，接种1小时后换为维持液培养。感染12小时后收集细胞，提取蛋白进行口蹄疫病毒蛋白表达水平检测，结果表明LGP2S169A突变体能够显著的抑制口蹄疫病毒的复制。
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种猪天然免疫蛋白LGP2的突变体及制备与用途
<160> 10
<210> 1
<211> 2046
<212> DNA
<213> 猪
<400>
atggagctgc gaccctacca gtgggaggtg atcatgcccg ccctggaggg caggaatatc 60
atcatatggc tgcccacggg cgctggcaag accagggcgg ctgcttatgt ggccaagagg 120
catctggaga ctgtggatgg agccaaggtg gttgtgctgg tcaacagggt acacctggtg 180
acccagcatt gtgaggagtt cagccgcatg ctggacagac actgggccat taccaccctg 240
agcggggaca tggggccacg agccggcttt ggccacctgg cccggagcca tgatctgctc 300
atctgcacag ctgagctgct acagaaggcg ctgaccagcg aggaggagga ggagcacgtg 360
gagctcaacg tcttctccct gctggtggtg gatgagtgtc accacacaca caaagacacc 420
gtctacaaca tcatcctgag ccagtacctg aagcataaat tccagaggac gaagccactg 480
ccgcaggtgc ttgggctcac agcctcccca ggcacaggca gggcctcgac actcgatggc 540
gccattgacc acatcctgca gctctgtgcc aacctggata cgtggcgcat catgtcaccc 600
cagaactccc gctcccagct gcaggagcac agccggcagc cctgcaaaca gtacgacctc 660
tgccaccagc gtgcccagga cccgtttggg gccaagctga agaagctcat ggacaaaatc 720
caccgccatc tggagatgcc ggagttgaga cgggactttg ggactcagac atacgagcag 780
caagtggtgg agctgagcca agctgcggct gaggcggggc tccaggagcg gagggtgtat 840
gcgcttcacc tgcgtcgcta caatgatgcg ctgctcatcc acgacacagt ccgcgcggtg 900
gacgccctgg ccacgctgcg ggatttctac accagggagc gcgccaccaa gacccagatc 960
ctacaggctg agcgctggct gctggcgctg tttgatgatc acaagaatga gctggcccgc 1020
ctggcagctg atggcccaga gaacccgaaa ctggaggtgc tgaaagaaat cctgcagaag 1080
cagttcaagg gtcccaagag cccccggggc atcatcttca cccgaacccg ccagagcgct 1140
cactccctcc tgctgtggct ccagcagcag ccgagcctgc agactgtgga catcagggcc 1200
cagctgttga ttggggctgg gaacagcagc cagagcaccc cgatgaccca gatgacccag 1260
agggaccagc aagaagtgat ccagaagttc cggactggtg ccttgaacct cctggtggcc 1320
acgagcgtgg cagaggaggg gctggacatc ccccagtgca acgtggtggt gcgctatggg 1380
ctcctgacca atgagatctc catggtccag gcaaggggcc gggcccgggc cagtcaaagc 1440
gtatactcgt ttgtggcagc ccaaggcagc cgggagctgc ggcgggagca gaccaatgag 1500
gcgctggaga gtctgatgga acaggcggtg gctgctgtgc aggcgatgga ccaggccgag 1560
taccaggcca agatccagga gctgcagcgg gcagccttgg ttaagcgggc agcccgggca 1620
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aactgcatgg tggccatggg ctacgggagt gacctgcgga aggtggagag tgcccaccat 1740
gtcaacgtga accccaactt caagatctac tacaacgtct cccaggagcc tgtggtcatt 1800
gacagagtct tcaaggactg gaggcccggg ggtgtcattc gctgcaggaa ctgtggggag 1860
agctggggca tgcagataat ctacaagtcc gtgaagctgc cagtgctcaa agtccgcagt 1920
gtgcttctgg agacgcccaa cgggcggatc caggtcaaga aatggtcctg cgtgcccttc 1980
ccggtgcctg acttcgatta cacgcagtat tgcaccgaga gcctgaccga cctctccctg 2040
gactag 2046
<210> 2
<211> 681
<212> PRT
<213> 猪（sus scrofa）
<400>
Met Glu Leu Arg Pro Tyr Gln Trp Glu Val Ile Met Pro Ala Leu Glu
1 5 10 15
Gly Arg Asn Ile Ile Ile Trp Leu Pro Thr Gly Ala Gly Lys Thr Arg
20 25 30
Ala Ala Ala Tyr Val Ala Lys Arg His Leu Glu Thr Val Asp Gly Ala
35 40 45
Lys Val Val Val Leu Val Asn Arg Val His Leu Val Thr Gln His Cys
50 55 60
Glu Glu Phe Ser Arg Met Leu Asp Arg His Trp Ala Ile Thr Thr Leu
65 70 75 80
Ser Gly Asp Met Gly Pro Arg Ala Gly Phe Gly His Leu Ala Arg Ser
85 90 95
His Asp Leu Leu Ile Cys Thr Ala Glu Leu Leu Gln Lys Ala Leu Thr
100 105 110
Ser Glu Glu Glu Glu Glu His Val Glu Leu Asn Val Phe Ser Leu Leu
115 120 125
Val Val Asp Glu Cys His His Thr His Lys Asp Thr Val Tyr Asn Ile
130 135 140
Ile Leu Ser Gln Tyr Leu Lys His Lys Phe Gln Arg Thr Lys Pro Leu
145 150 155 160
Pro Gln Val Leu Gly Leu Thr Ala Ser Pro Gly Thr Gly Arg Ala Ser
165 170 175
Thr Leu Asp Gly Ala Ile Asp His Ile Leu Gln Leu Cys Ala Asn Leu
180 185 190
Asp Thr Trp Arg Ile Met Ser Pro Gln Asn Ser Arg Ser Gln Leu Gln
195 200 205
Glu His Ser Arg Gln Pro Cys Lys Gln Tyr Asp Leu Cys His Gln Arg
210 215 220
Ala Gln Asp Pro Phe Gly Ala Lys Leu Lys Lys Leu Met Asp Lys Ile
225 230 235 240
His Arg His Leu Glu Met Pro Glu Leu Arg Arg Asp Phe Gly Thr Gln
245 250 255
Thr Tyr Glu Gln Gln Val Val Glu Leu Ser Gln Ala Ala Ala Glu Ala
260 265 270
Gly Leu Gln Glu Arg Arg Val Tyr Ala Leu His Leu Arg Arg Tyr Asn
275 280 285
Asp Ala Leu Leu Ile His Asp Thr Val Arg Ala Val Asp Ala Leu Ala
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Thr Leu Arg Asp Phe Tyr Thr Arg Glu Arg Ala Thr Lys Thr Gln Ile
305 310 315 320
Leu Gln Ala Glu Arg Trp Leu Leu Ala Leu Phe Asp Asp His Lys Asn
325 330 335
Glu Leu Ala Arg Leu Ala Ala Asp Gly Pro Glu Asn Pro Lys Leu Glu
340 345 350
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370 375 380
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Gln Leu Leu Ile Gly Ala Gly Asn Ser Ser Gln Ser Thr Pro Met Thr
405 410 415
Gln Met Thr Gln Arg Asp Gln Gln Glu Val Ile Gln Lys Phe Arg Thr
420 425 430
Gly Ala Leu Asn Leu Leu Val Ala Thr Ser Val Ala Glu Glu Gly Leu
435 440 445
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450 455 460
Glu Ile Ser Met Val Gln Ala Arg Gly Arg Ala Arg Ala Ser Gln Ser
465 470 475 480
Val Tyr Ser Phe Val Ala Ala Gln Gly Ser Arg Glu Leu Arg Arg Glu
485 490 495
Gln Thr Asn Glu Ala Leu Glu Ser Leu Met Glu Gln Ala Val Ala Ala
500 505 510
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515 520 525
Gln Arg Ala Ala Leu Val Lys Arg Ala Ala Arg Ala Ala Gln Gln Lys
530 535 540
Ser Arg Gln Gln Lys Phe Leu Ala Glu Gln Val Gln Leu Leu Cys Ile
545 550 555 560
Asn Cys Met Val Ala Met Gly Tyr Gly Ser Asp Leu Arg Lys Val Glu
565 570 575
Ser Ala His His Val Asn Val Asn Pro Asn Phe Lys Ile Tyr Tyr Asn
580 585 590
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595 600 605
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Glu Ser Leu Thr Asp Leu Ser Leu Asp
675 680 681
<210> 3
<211> 2046
<212> DNA
<213> 猪（sus scrofa）
<400>
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gactag 2046
<210> 4
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<212> PRT
<213> 猪（sus scrofa）
<400>
Met Glu Leu Arg Pro Tyr Gln Trp Glu Val Ile Met Pro Ala Leu Glu
1 5 10 15
Gly Arg Asn Ile Ile Ile Trp Leu Pro Thr Gly Ala Gly Lys Thr Arg
20 25 30
Ala Ala Ala Tyr Val Ala Lys Arg His Leu Glu Thr Val Asp Gly Ala
35 40 45
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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675 680 681
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（扩增LGP突变体真核表达质粒的上游引物）
<400>
cgcaggtgct tgggctcaca gccgccccag gcacaggcag gg 42
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（扩增LGP突变体真核表达质粒的下游引物）
<400>
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<211> 24
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<213> 人工序列（扩增CDS表达区的上游引物）
<400>
tatctcgagt tatggagctg cgac 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（扩增CDS表达区的下游引物）
<400>
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<210> 9
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<213> 人工序列（扩增上游引物）
<400>
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<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（扩增下游引物）
<400>
cccttctcag attccgagt 19

Claims (3)

1.一种猪天然免疫蛋白LGP2的突变体，其特征在于突变体的氨基酸序列为SEQ IDNO.4。
2.权利要求1所述的猪天然免疫蛋白LGP2的突变体的制备方法，其特征在于：首先以猪的cDNA为模板，用引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8扩增构建表达猪天然免疫蛋白LGP2的真核表达质粒，再以该真核表达质粒为模板，用引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6进行突变PCR，得到用于目标产物制备的真核表达质粒，通过转染获得权利要求1所述的目标产物。
3.权利要求1所述的猪天然免疫蛋白LGP2的突变体在用于制备抗口蹄疫病毒感染的药物或疫苗中的应用。
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