CN104789690B - 一种用于凡纳滨对虾遗传性别鉴定的dna探针序列及获取方法 - Google Patents

一种用于凡纳滨对虾遗传性别鉴定的dna探针序列及获取方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种凡纳滨对虾雌雄性别差异的DNA序列及获取方法。通过高通量测序手段，分别对雌性个体和雄性个体的混池进行高通量测序，测序结果经过生物信息学分析筛选出在雌雄混池中有显著差异的序列片段，获得的差异片段在不同来源的个体中进行验证，最终获得一条可以用于凡纳滨对虾雌雄甄别的探针序列，利用该序列可以实现该种对虾遗传性别的准确鉴定。本发明方法具有高效、准确、可靠的特点，在对虾性别早期的鉴别和性别控制研究中具有广阔的应用前景。

Description

一种用于凡纳滨对虾遗传性别鉴定的DNA探针序列及获取 方法
技术领域
本发明涉及水产生物技术中的对虾性别鉴定和性别控制技术，具体地说，一种用于凡纳滨对虾遗传性别鉴定的DNA序列及获取方法。
背景技术
凡纳滨对虾是我国乃至世界养殖产量最大的虾类，目前世界的平均年产量达300多万吨。凡纳滨对虾与其他对虾种类一样，雌雄个体的大小存在明显的差异，雌性个体在生长的中后期生长速度远高于雄性个体，因此实现凡纳滨对虾的单性控制，培育单性群体，对于提高对虾养殖业的产量和效益具有重要的意义。
要培育凡纳滨对虾的单性群体，首先需要实现对虾遗传性别的鉴定。虽然在对虾生长到一定阶段时可以通过表型的外部性征实现雌雄虾的性别鉴定，但是在科学研究和实际生产中，如果能够在发育早期通过分子标记手段实现性别的早期鉴定，可以针对性的对某一性别的个体开展实验和养殖，可以加快科学研究和实际生产的效率。
在对虾的性别标记的研究中，已经有较多进行性别标记筛选的报道，Staelens etal(Staelens,J.,D.Rombaut,I.Vercauteren,B.Argue,J.Benzie and M.Vuylsteke.High-density linkage maps and sex-linked markers for the black tiger shrimp(Penaeus monodon).Genetics,2008,179(2):917-925.)构建了斑节对虾的高密度遗传连锁图谱，并从遗传图谱上发现了两个性别差异的标记，该标记在其他遗传来源的斑节对虾群体中也证实了其可以作为一种进行性别鉴定的标记，并且该团队也申请了相关专利一项(虾和对虾的性别特异性标记，中国发明专利，申请号：200780015173.9)，然而由于对虾不同物种的差异性，该标记不能用于凡纳滨对虾的性别鉴定。在凡纳滨对虾中，Zhang,et al.(Zhang,L.,C.Yang,Y.Zhang,L.Li,X.Zhang,Q.Zhang and J.Xiang.A genetic linkagemap of Pacific white shrimp(Litopenaeus vannamei):sex-linked microsatellitemarkers and high recombination rates.Genetica,2006,131(1):37-49)通过QTL定位方法筛选到了一个凡纳滨对虾性别特异性的微卫星位点，但是后来证实该微卫星位点是家系特异性的，在其他来源的个体中并不能用作鉴定的标记。同样地，Alcivar-Warren et al.(Alcivar-Warren,A.,D.Meehan-Meola,S.W.Park,Z.Xu,M.Delaney andG.Zuniga.ShrimpMap:A low-density,microsatellite-based linkage map of thepacific whiteleg shrimp,Litopenaeus vannamei:Identification of sex-linkedmarkers in linkage group 4.Journal of Shellfish Research,2007,26(4):1259-1277.)的研究也发现了凡纳滨对虾性别特异性的微卫星标记，但是也是仅限于研究的群体。而在中国明对虾的研究中，虽然构建了较多的连锁图谱，但是未筛选到相应的性别鉴定标记(Li,Z.X.,J.Li,Q.Y.Wang,Y.Y.He and P.Liu.AFLP-based genetic linkage map ofmarine shrimp Penaeus(Fenneropenaeus)chinensis.Aquaculture,2006,261(2):463-472；,Sun,Z.N.,P.Liu,J.Li,X.H.Meng and X.M.Zhang.Construction of a geneticlinkage map in Fenneropenaeus chinensis(Osbeck)using RAPD and SSRmarkers.Hydrobiologia,2008,596:133-141；Liu,B.,Q.Y.Wang,J.A.Li,P.Liu andY.Y.He.A genetic linkage map of marine shrimp Penaeus(Fenneropenaeus)chinensis based on AFLP,SSR,and RAPD markers.Chinese Journal of Oceanologyand Limnology,2010,28(4):815-825.)，Li,et al.(Li,S.,F.Li,Y.Xie,B.Wang,R.Wen,C.Zhang,K.Yu and J.Xiang.Screening of Genes Specifically Expressed in Malesof Fenneropenaeus chinensis and Their Potential as Sex Markers.Journal ofMarine Biology,2013,1-9.)通过基因差异表达分析的方法筛选到了一个中国对虾雌雄差异表达的基因，并将该标记开发成了一种可以用作雌雄性别鉴定的标记(中国发明专利，公开号：101709332A)，然而用于凡纳滨对虾性别鉴定的标记目前还没有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于凡纳滨对虾遗传性别鉴定的DNA序列及获取方法，该方法不受对虾发育时期、个体大小等因素的限制，即使在幼体时期，只要能提取到一定量的DNA，就可实现性别的准确鉴定。另外，该方法也适用于其他对虾性别差异序列的获得。为对虾性别控制、全雌苗种培育和性别决定基因筛选提供一种技术手段。
为实现以上目的，本发明采用的方案为：
首先提取1个母本和对应的50尾雌虾后代以及1个父本和对应的50尾雄虾后代的DNA，采用高通量测序方法对父母本和100个子代混池进行高通量测序，采用生物信息学方法分析雌虾和雄虾中显著差异的DNA序列，获得的差异片段在其他来源的群体中进行验证，最终获得一条凡纳滨对虾遗传性别鉴定的DNA序列。
所述的对虾基因组DNA提取方法采用天根植物基因组提取试剂盒中的说明书进行。
上述个体的DNA使用Nanodrop1000(美国)进行浓度测量，测量后个体每个个体稀释到100ng/μl。
所述的高通量测序方法使用Illumina Hiseq2500测序平台，文库构建和高通量测序方法按照标准流程进行。
运用生物信息学对测序获得父母本和子代的测序数据进行分析，使用母本和雌性子代的测序数据构建雌性混池，使用父本和雄性子代的测序数据构建雄性混池。分析在雌雄混池中测序深度差异显著的序列。
通过生物信息学分析共找到16个雌雄混池中差异显著的序列，使用Primer 3Plus在线设计软件(http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)设计引物扩增上述16个序列。
选择不同来源的凡纳滨对虾雌虾16尾，雄虾16尾，使用设计的PCR引物扩增上述16个序列，每个个体的扩增序列通过测序分析雌雄序列的差异，最终获得一条在所有的雌雄个体中有显著差异的DNA序列,在雌性个体中序列为SEQ LvSDF，雄性个体中序列为SEQLvSDM，两个序列的差异位点是120bp位置，雌性个体中为G/C杂合，雄性个体中为C纯和。扩增该段序列的引物为
LvSDPF:CCAGACAGAAATGATCTCCTTTGA,
LvSDPR:AGAAAAGAAAAGAGGAAAGCAGGA
使用上述引物在更多的不同来源雌雄个体中验证将该DNA序列是否为性别差异序列，包括市场上随机购买的凡纳滨对虾雌性各20尾，取自海南育种基地(海南广泰海洋育种有限公司)不同家系的凡纳滨对虾雌雄各20尾，2012年进口科纳湾亲虾雌雄各20尾，2014年进口SIS雌雄各20尾，总计80尾雌虾和80尾雄虾进行验证，通过Sanger测序法对扩增的序列进行测序，证实了该序列的确为雌雄差异序列，其中在雌性个体中该序列为：
(1)序列特征：
基因组序列：碱基对；类型：核苷酸；链型：双链；拓扑结构：线性
(2)分子类型：DNA
(3)假设：否
(4)反义：否
SEQ LvSDF：
CCAGACAGAAATGATCTCCTTTGACAGAACCGGTGACATATTGTACTTGAGATAAACCACATATAAATCAGTAAACCCCGAGGGCAAGTACAAATTTAGTTTAAGACAATGATTTTGAA[G/C]TGTGAAAATGCAAACGAAACCGCGGGATTCGTCTAATTCGCCAATTACGGCTCAGCTAACGAGGTAGCGCTAAAGCGCACTATAACAATCTACAGACCTTTCGACTCCAGCACTTTCAGATGTATTTCGAATCGTGTACACATTACCGGAAGGCGAATGGAAATGAGGTTATTATTTTTGTTACATCATTTTCAAGATGGCTGGCTTTGTTGAACATCGGCAAGAATATTGTGAGGTCTCCGACTCCACTCCCCCGGGGGCCCTCCTCCATCCTGCACCACGCCCCTTGCCTTCTCCCTCCCTTATTCTCCTCCTTACCCTTGTTTCTCTTAGGCTTCCCCCACGGTTTCTTTCGTTAACTCTTATCTATCCTGCTTTCCTCTTTTCTTTTCT
在雄性个体中该序列为：
(1)序列特征：
基因组序列：碱基对；类型：核苷酸；链型：双链；拓扑结构：线性
(2)分子类型：DNA
(3)假设：否
(4)反义：否
SEQ LvSDM：
CCAGACAGAAATGATCTCCTTTGACAGAACCGGTGACATATTGTACTTGAGATAAACCACATATAAATCAGTAAACCCCGAGGGCAAGTACAAATTTAGTTTAAGACAATGATTTTGAACTGTGAAAATGCAAACGAAACCGCGGGATTCGTCTAATTCGCCAATTACGGCTCAGCTAACGAGGTAGCGCTAAAGCGCACTATAACAATCTACAGACCTTTCGACTCCAGCACTTTCAGATGTATTTCGAATCGTGTACACATTACCGGAAGGCGAATGGAAATGAGGTTATTATTTTTGTTACATCATTTTCAAGATGGCTGGCTTTGTTGAACATCGGCAAGAATATTGTGAGGTCTCCGACTCCACTCCCCCGGGGGCCCTCCTCCATCCTGCACCACGCCCCTTGCCTTCTCCCTCCCTTATTCTCCTCCTTACCCTTGTTTCTCTTAGGCTTCCCCCACGGTTTCTTTCGTTAACTCTTATCTATCCTGCTTTCCTCTTTTCTTTTCT
根据测序获得序列信息可以鉴定对虾的遗传性别。
本发明的优点：
1.本方法筛选获得了凡纳滨对虾用于性别鉴定的DNA序列，可以实现凡纳滨对虾遗传性别的鉴定，该方法不受个体发育时期、环境的影响，是一种准确进行遗传性别鉴定的方法。
2.通过运用测序方法进行性别的鉴定，具有很高的准确性
3.本方法仅需要很少的组织即可实现性别的分子鉴定，即使对于冷冻处理、酒精浸泡的组织也可以实现。
4.该性别鉴定DNA序列的获取方法可以适用于其他对虾种类。
具体实施方式：
实施例1：一种凡纳滨对虾遗传性别鉴定的DNA序列获取方法
1.分别取一个的家系的父母本和雌雄子代各50尾的肌肉组织，液氮固定后置于-80度冰箱中保存。
2.使用天根植物基因组DNA提取试剂盒(天根，北京)提取上述样品的DNA，操作方法参考设计和说明书。提取的DNA使用Nanodrop1000(Thermo，美国)测定DNA浓度。
3.将提取的DNA稀释至100ng/μl，按照简化基因组文库构建的方法分别构建四个不同的文库，具体如下：父本和母本分别构建一个父本文库和母本文库，50个雌性个体DNA等量混合后构建一个雌性子代文库，50个雄性个体DNA等量混合后构建一个雄性子代文库。上述四个文库使用Illumina Hiseq2500测序仪进行高通量测序，获得父母本和子代混池测序原始数据。
4.运用生物信息学对测序获得父母本和子代的测序原始数据进行分析，具体如下：使用父本和母本的测序原始数据进行de novo组装，获得简化基因组参考序列，将四个文库的测序数据比对回参考序列，统计每个参考序列在母本、雌性子代混池、父本、雄性子代混池的比例，在母本和雌性子代混池中的测序深度显著高于父本和雄性子代混池的序列为雌性特异性候选序列，在父本和雄性子代混池中的测序深度显著高于母本和雌性子代混池的序列为雄性特异性候选序列。
5.通过上述生物信息学分析共找到16个雌雄混池中差异显著的序列，使用Primer3Plus在线设计软件(http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)设计引物扩增上述16个序列。
首先选择不同来源的凡纳滨对虾雌雄虾各16尾对筛选到的序列进行测序，分析序列是否在其他群体中有显著差异，使用设计的PCR引物扩增上述16个序列后，每个个体的扩增序列通过测序分析雌雄序列的差异，经过雌雄个体的序列比较，筛选获得一条在所有的雌雄个体中有显著差异的DNA序列。之后将获得的该段DNA序列在不同来源的雌雄各60尾个体中进行验证，证实了该序列的确为雌雄差异序列，扩增该序列的引物对为：
LvSDPF:CCAGACAGAAATGATCTCCTTTGA,
LvSDPR:AGAAAAGAAAAGAGGAAAGCAGGA
扩增出的雌雄差异序列，其中在雌性个体中该序列为SEQ LvSDF：
CCAGACAGAAATGATCTCCTTTGACAGAACCGGTGACATATTGTACTTGAGATAAACCACATATAAATCAGTAAACCCCGAGGGCAAGTACAAATTTAGTTTAAGACAATGATTTTGAA[G/C]TGTGAAAATGCAAACGAAACCGCGGGATTCGTCTAATTCGCCAATTACGGCTCAGCTAACGAGGTAGCGCTAAAGCGCACTATAACAATCTACAGACCTTTCGACTCCAGCACTTTCAGATGTATTTCGAATCGTGTACACATTACCGGAAGGCGAATGGAAATGAGGTTATTATTTTTGTTACATCATTTTCAAGATGGCTGGCTTTGTTGAACATCGGCAAGAATATTGTGAGGTCTCCGACTCCACTCCCCCGGGGGCCCTCCTCCATCCTGCACCACGCCCCTTGCCTTCTCCCTCCCTTATTCTCCTCCTTACCCTTGTTTCTCTTAGGCTTCCCCCACGGTTTCTTTCGTTAACTCTTATCTATCCTGCTTTCCTCTTTTCTTTTCT
在雄性个体中该序列为SEQ LvSDM：
CCAGACAGAAATGATCTCCTTTGACAGAACCGGTGACATATTGTACTTGAGATAAACCACATATAAATCAGTAAACCCCGAGGGCAAGTACAAATTTAGTTTAAGACAATGATTTTGAACTGTGAAAATGCAAACGAAACCGCGGGATTCGTCTAATTCGCCAATTACGGCTCAGCTAACGAGGTAGCGCTAAAGCGCACTATAACAATCTACAGACCTTTCGACTCCAGCACTTTCAGATGTATTTCGAATCGTGTACACATTACCGGAAGGCGAATGGAAATGAGGTTATTATTTTTGTTACATCATTTTCAAGATGGCTGGCTTTGTTGAACATCGGCAAGAATATTGTGAGGTCTCCGACTCCACTCCCCCGGGGGCCCTCCTCCATCCTGCACCACGCCCCTTGCCTTCTCCCTCCCTTATTCTCCTCCTTACCCTTGTTTCTCTTAGGCTTCCCCCACGGTTTCTTTCGTTAACTCTTATCTATCCTGCTTTCCTCTTTTCTTTTCT
实施例2：一种凡纳滨对虾遗传性别的分子鉴定方法
2013年9月，从青岛南山水产品市场随机挑选凡纳滨对虾60尾，运至中国科学院海洋研究所水族楼暂养，之后取出肌肉组织-80度冰箱冻存。
1.使用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取上述样品的DNA并标记，操作方法参考设计和说明书。提取的DNA使用Nanodrop1000(Thermo，美国)测定DNA浓度。
2.采用如下扩增引物扩增对提取的DNA进行PCR扩增，
LvSDPF:CCAGACAGAAATGATCTCCTTTGA,
LvSDPR:AGAAAAGAAAAGAGGAAAGCAGGA
扩增体系如下：
PCR反应程序为：94℃预变性3min,(94℃30s,53℃30s,72℃30s)共计35个循环,72℃延伸10min。
3.上述PCR产物经琼脂糖电泳后使用天根胶回收试剂盒进行产物回收，使用LvSDF引物对ABI PRISMTM 3700 Genetic Analyzer测序。
4.使用Bioedit软件读取测序结果的峰图文件，查找SEQ LvSDF和SEQ LvSDM序列120bp处的序列，如果该位置为G/C杂合，则判定对应的个体为雌性，如果该位置为C纯和，则判定对应的个体为雄性。
结果：在60尾凡纳滨对虾中，其中有34尾虾的测序结果显示在120bp处为G/C杂合，为雌性，剩余26尾虾的测序结果显示在120bp处为C纯和，为雄性。
本发明方法具有高效、准确、可靠的特点，在对虾性别早期的鉴别和性别控制研究中具有广阔的应用前景。

Claims (3)

1.凡纳滨对虾遗传性别鉴定方法，其特征在于：将待鉴定遗传性别的对虾个体提取DNA后，使用LvSDPF:CCAGACAGAAATGATCTCCTTTGA,LvSDPR:AGAAAAGAAAAGAGGAAAGCAGGA于提取DNA模板中进行序列扩增，，然后将获得的扩增序列进行Sanger测序，测序峰图文件使用Bioedit软件读取上述序列120bp位置的碱基序列，如果该位置为G/C杂合，则鉴定的个体为雌性，如果为C纯和，则鉴定的个体为雄性。
2.一种用于凡纳滨对虾遗传性别鉴定的DNA探针，其特征在于：其为权利要求1中的扩增序列SEQ LvSDF和SEQ LvSDM序列，雌性个体DNA扩增序列为SEQ LvSDF序列；雄性个体DNA扩增序列为SEQ LvSDM序列；
所述的雌性个体DNA扩增序列SEQ LvSDF：
SEQ LvSDF：
CCAGACAGAAATGATCTCCTTTGACAGAACCGGTGACATATTGTACTTGAGATAAACCACATATAAATCAGTAAACCCCGAGGGCAAGTACAAATTTAGTTTAAGACAATGATTTTGAA[G/C]TGTGAAAATGCAAACGAAACCGCGGGATTCGTCTAATTCGCCAATTACGGCTCAGCTAACGAGGTAGCGCTAAAGCGCACTATAACAATCTACAGACCTTTCGACTCCAGCACTTTCAGATGTATTTCGAATCGTGTACACATTACCGGAAGGCGAATGGAAATGAGGTTATTATTTTTGTTACATCATTTTCAAGATGGCTGGCTTTGTTGAACATCGGCAAGAATATTGTGAGGTCTCCGACTCCACTCCCCCGGGGGCCCTCCTCCATCCTGCACCACGCCCCTTGCCTTCTCCCTCCCTTATTCTCCTCCTTACCCTTGTTTCTCTTAGGCTTCCCCCACGGTTTCTTTCGTTAACTCTTATCTATCCTGCTTTCCTCTTTTCTTTTCT
所述的雄性个体DNA扩增序列SEQ LvSDM：
SEQ LvSDM：
CCAGACAGAAATGATCTCCTTTGACAGAACCGGTGACATATTGTACTTGAGATAAACCACATATAAATCAGTAAACCCCGAGGGCAAGTACAAATTTAGTTTAAGACAATGATTTTGAACTGTGAAAATGCAAACGAAACCGCGGGATTCGTCTAATTCGCCAATTACGGCTCAGCTAACGAGGTAGCGCTAAAGCGCACTATAACAATCTACAGACCTTTCGACTCCAGCACTTTCAGATGTATTTCGAATCGTGTACACATTACCGGAAGGCGAATGGAAATGAGGTTATTATTTTTGTTACATCATTTTCAAGATGGCTGGCTTTGTTGAACATCGGCAAGAATATTGTGAGGTCTCCGACTCCACTCCCCCGGGGGCCCTCCTCCATCCTGCACCACGCCCCTTGCCTTCTCCCTCCCTTATTCTCCTCCTTACCCTTGTTTCTCTTAGGCTTCCCCCACGGTTTCTTTCGTTAACTCTTATCTATCCTGCTTTCCTCTTTTCTTTTCT
雌性序列SEQ LvSDF和雄性序列SEQ LvSDM的性别差异位点为第120bp的碱基，该碱基在雌性个体中为GC杂合，在雄性个体中为C纯和。
3.一种权利要求2所述的对虾遗传性别鉴定的DNA探针获取方法：取一对性成熟的雌雄个体进行交配，培育子代个体至性成熟，随机选择50尾雌性子代和50尾雄性子代，提取父母本和雌雄子代的个体DNA，之后对上述个体进行简化基因组文库构建，并通过高通量测序方法对父母本和100个子代进行高通量测序，采用生物信息学方法分析父本和雄性子代组成的雄性混池与母本和雌性子代构成的雌性子代混池之间测序深度显著差异的序列，对获得的差异序列在其他来源的群体中进行验证，最终获得一条凡纳滨对虾遗传性别鉴定的DNA序列。
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