CN111455025A - 一种用于pcr扩增的大豆dna快速获得方法以及pcr扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于PCR扩增的大豆DNA快速获得方法以及PCR扩增方法,应用碱处理大豆叶柄直接作为PCR反应模板,能够快速、有效、简便地进行植物DNA提取获得大豆组织DNA模板;然后利用SSR标准引物,以所述DNA模板进行PCR扩增。本发明在进行种性检测及分子标记辅助育种时,具有时效性强、提取步骤简单、化学试剂较少、气味小以及环保的技术效果。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种用于PCR扩增的大豆DNA快速获得方法以及 PCR扩增方法。
背景技术
随着分子生物学技术的发展,基于PCR(聚合酶链式反应)的分子标记技术因为其相对简便 快捷的特点,目前已经被广泛用于基因组DNA的分析,从而大大促进了遗传育种、遗传进化、 种质资源分类和基因克隆、基因定位等方面的研究发展。随着多种基于PCR的分子标记技术应用, DNA模板的获取是这一切的基础。根据植物的研究对象、研究目的和研究成本等不同,提取基因 组DNA所应用的方法也不同。其中,随着作物分子辅助育种的广泛应用与推广,基因型鉴定是最 主要的工作,基因组DNA的提取则是最繁重、最耗时的工作之一。
针对大豆分子辅助育种方面,面对田间大量材料的基因型鉴定,DNA提取是影响鉴定工 作的重要之处。常规的提取方法主要包括:CTAB提取法、试剂盒提取法、SDS提取法以及 尿素提取法等。这些方法在提取过程中需要使用液氮、氯仿、试剂盒等试剂,同时要进行研 磨、离心等方法。提取步骤繁杂、配制化学试剂种类众多、提取过程刺激味大,操作步骤多 或者成本较高,均不利于进行高通量的分子辅助育种(见表1)。
表1几种DNA提取方法比较
发明内容
本发明针对上述现有技术所存在的问题,旨在提供一种用于PCR扩增的大豆DNA快速 获得方法以及PCR扩增方法,创造性地应用碱处理大豆叶柄组织直接作为PCR反应模板,能够快速、有效、简便地进行大豆DNA提取并扩增。
本发明用于PCR扩增的大豆DNA快速获得方法,包括如下步骤:
步骤1:材料处理
取某一大豆品种的叶柄1cm,剪碎备用;
步骤2:试剂准备
配制试剂A,所述试剂A为浓度4g/L的NaOH溶液;
配制试剂B,每500mL试剂B配方如下:1mol/L pH值8.0的Tris-HCl 5ml,0.5mol/L的EDTA 1ml,加入蒸馏水定容至500ml;
步骤3:大豆DNA的提取
将步骤1剪碎后的叶柄组织加入60ml试剂A中,放置PCR仪中,于95-100℃下煮3min, 再加入60ml试剂B,搅拌均匀,即可获得大豆组织的DNA模板。
利用上述获得的大豆组织的DNA模板进行PCR扩增的方法,是利用SSR标准引物,以步骤3获得的DNA模板进行PCR扩增。
PCR反应体系为:5×Buffer 2μL,2.5mmol/L Mg2+1μL,0.25mmol/L dNTPs 1μL,0.2μmol/L 引物1μL,1.0U Taq DNA聚合酶0.1μL,20ng-40ng步骤3获得的DNA模板2μL,ddH2O2.9μL,总体积10μL。
所述引物为NY/T 2595-2014标准规定的引物。
反应程序为:94℃5min,94℃45s、47℃45s、72℃45s下循环37次,72℃7min,得到扩增产物,12℃保存。
与现有技术相比,本发明的有益效果体现在:
1、本发明用碱处理待测大豆叶柄提取DNA作为PCR反应模板,相对于常规的DNA提取方法具有操作简单、无需研磨、无需液氮、氯仿等试剂耗材、成本低、环保等特点,且提 取效果与试剂盒提取扩增效果一致。
2、本发明用大豆叶柄提取DNA,在样品制备中PCR板装样效率高,相对于采用叶片具 有明显的快捷性,能够满足大量样品的制备工作。
3、本发明用碱处理待测大豆叶柄提取DNA作为PCR反应模板,进行品种真实性检测的 结果显示,碱处理法与试剂盒法检测结果完全一致,能够用于大豆品种高通量检测工作。
附图说明
图1为实施例1-3大豆叶柄碱煮法不同时间提取DNA后PCR反应扩增结果。
图2为试剂盒提取DNA进行品种真实性检测的PCR反应扩增结果。
图3为大豆叶柄碱煮法提取DNA进行品种真实性检测的PCR反应扩增结果。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明技术方案进行详细说明,但应当理解本发明的保 护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的方法,通常按照常规条 件操作,未注明的实验材料来源均为市售,由于不涉及发明点,故不对其步骤进行详细描述。
实施例1:大豆DNA的提取
1、材料处理
取某一大豆品种的叶柄1cm,将其剪碎,备用;
2、试剂准备
配制试剂A,所述试剂A为浓度4g/L的NaOH溶液;
配制试剂B,每500mL试剂B配方如下:1mol/L pH值8.0的Tris-HCl 5ml,0.5mol/L的EDTA 1ml,加入蒸馏水定容至500ml;
3、大豆DNA的提取
将步骤1剪碎后的叶柄组织加入60ml试剂A中,放置PCR仪中,于95-100℃下煮3min, 再加入60ml试剂B,搅拌均匀,即可获得大豆组织的DNA模板。
实施例2:
本实施例的提取过程同实施例1,区别在于步骤3中,95℃下煮6min。
实施例3:
本实施例的提取过程同实施例1,区别在于步骤3中,97℃下煮9min。
经检测,实施例1-3中,实施例1的DNA得出率最高,为100%,且时间最短,确定实施例1为最优方案。
实施例4:PCR扩增方法
选用实施例1提取的大豆DNA模板,利用SSR标准引物Satt197(NY/T 2595-2014,由上海生工合成),正向引物CACTGCTTTTTCCCCTCTCT,反向引物AAGATACCCCCAACATTATTTGTAA。
反应体系为:5×Buffer 2μL,2.5mmol/L Mg2+1μL,0.25mmol/L dNTPs 1μL,0.2μmol/L 引物1μL,1.0U Taq DNA聚合酶0.1μL,20ng-40ng DNA模板2μL,ddH2O 2.9μL,总体积10μL;
反应程序为,94℃5min,94℃45s、47℃45s、72℃45s下循环37次,72℃7min,得到扩增产物,12℃保存。
对比例1:试剂盒法提取大豆叶柄的DNA及PCR扩增
S1、取两个不同大豆品种叶柄组织各5g放在研钵中,加入液氮将样品研磨成粉末,称取 80mg-100mg磨碎的样品转入2.0ml的Eppendorf管中;
S2、视材料量的多少,加入600ul已预热的Buffer A,轻轻混匀后,65℃水浴保温10min;
S3、在Eppendorf管管中加入600ul酚/氯仿,上下颠倒充分混匀,抽提2min;
S4、12000×g离心5分钟,吸取上清液到一新的Eppendorf管中;
S5、加入与上清液等体积的Buffer B混匀,常温放置10min后,12000×g离心5min,去 上清,保留沉淀;
S6、在沉淀中加入60ulBuffer C,37℃(常温)放置2min后用枪头将其充分混匀后,于 37℃溶解沉淀,5分钟后加入300ul BufferD,上下颠倒充分混匀10次后,取出离心柱,将离心柱放置在一个2ml的套管上,将溶液加入到离心柱中,放置2min;
S7、将离心柱和2ml套管一起用8000×g离心,30秒后,弃去2m1套管中溶液,在离心柱中加入200u1 Wash Buffer I,8000×g离心,30秒后,弃去溶液;
S8、在离心柱中加入200u1 Wash Buffer I,8000×g离心,30秒后,弃去溶液;
S9、在离心柱中加200u1 Wash buffer II,8000×g离心,30秒后,弃去溶液;
S10、在离心柱中加入200u1 Wash buffer II,8000×g离心,30秒后,弃去溶液;11、12000×g 离心30秒,以除去离心柱中痕量残余溶液;室温放置10min;
S12、将离心柱放置在一个新的1.5m1离心管中,在离心柱底部中央小心加入130u1Elution Buffer,37℃放置10min后,12000×g离心1分钟;13.-20℃保存。
S13、PCR扩增
选用NY/T 2595-2014中的SSR引物(由上海生工合成),反应体系为:5×Buffer 2μL, 2.5mmol/L Mg2+1μL,0.25mmol/L dNTPs 1μL,0.2μmol/L引物1μL,1.0U Taq DNA聚合酶0.1μL,20ng-40ng DNA模板2μL,ddH2O 2.9μL,总体积10μL;反应程序为,94℃5min, 94℃45s、47℃45s、72℃45s下循环37次,72℃7min,得到扩增产物,12℃保存。
对比例2:叶柄碱煮法提取大豆DNA模板及PCR扩增
S1、材料处理
取2个不同大豆品种叶柄,剪成若干段,待用。
S2、试剂准备
试剂A:试剂A:浓度4g/L的NaOH溶液;
每500mL的试剂B配方如下:1mol/L Tris-HCl(PH8.0)5ml,0.5mol/L EDTA 1ml,加入蒸馏水定容至500ml;
S3、模板DNA的制备
按照实施例1中DNA提取步骤获取两个不同大豆品种的DNA,吸取2.0μl作为PCR反应模板直接用于PCR反应。
S4、PCR扩增
选用NY/T 2595-2014中的SSR引物(由上海生工合成)),反应体系为:5×Buffer 2μL, 2.5mmol/L Mg2+1μL,0.25mmol/L dNTPs 1μL,0.2μmol/L引物1μL,1.0U Taq DNA聚合酶0.1μL,20ng-40ng DNA模板2μL,ddH2O 2.9μL,总体积10μL;反应程序为,94℃5min, 94℃45s、47℃45s、72℃45s下循环37次,72℃7min,得到扩增产物,12℃保存。
利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
分别取10μL实施例4、对比例1和对比例2扩增得到的产物,加入等体积加样缓冲液, 充分混匀后在PCR仪上运行变性程序,95℃变性5min,4℃冷却10min以上,在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上恒压预电泳(100V恒压,10~30min),然后恒压电泳(200~250V恒压, 1~2h),凝胶浸入固定液中,置于摇床上摇动固定5min(固定液的量可根据胶板数量和大 小调整,以没过胶面为准),用ddH2O进行快速漂洗一次,在新配制的染色液中摇动染色10min,用ddH2O(含0.2%体积的0.1%硫代硫酸钠)快速漂洗,时间不超过10s,在新配制 的显影液中摇动直至显出清晰的条带,在固定液中定影5min,在胶片观察灯上直接记录结果 或用数码相机照相。
实验结果
1、大豆叶柄不同碱煮时间后PCR扩增结果比较
实施例1-3的扩增结果如图1所示,其中1-8为碱煮3min后PCR结果,9-16为碱煮6min 后PCR结果,9-16为碱煮9min后PCR结果,3个碱煮时间均可获取PCR扩增效果较好的DNA模板,能够满足检测需求,因此在相同效果情况下,优先选择时间短的处理方案,为实施例1。
2、大豆叶柄快速提取DNA与试剂盒提DNA的扩增结果比较
对比例1和对比例2的扩增结果如图2和图3所示,对两个大豆品种分别使用试剂盒提 取和实施例1方法提取DNA,采用标准NY/T 2595-2014中12对应物进行检测,并验证实施例1的效果。其中图2为试剂盒提取DNA进行PCR扩增的产物,图3为实施例1提取DNA 进行PCR扩增的产物。检测结果一致,对比两个图,图3中扩增条带清晰明亮,无拖尾,判 读效果更好。因此实施例1获取大豆DNA能够满足大豆分子检测需求。
以上的仅为本发明的一个实施例,但是本发明实施例并非仅限于此,任何本领域能思之 的变化都应落在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种用于PCR扩增的大豆DNA快速获得方法,其特征在于包括如下步骤:
步骤1:材料处理
取某一大豆品种的叶柄1cm,剪碎备用;
步骤2:试剂准备
配制试剂A,所述试剂A为浓度4g/L的NaOH溶液;
配制试剂B,每500mL试剂B配方如下:1mol/L pH值8.0的Tris-HCl 5ml,0.5mol/L的EDTA 1ml,加入蒸馏水定容至500ml;
步骤3:大豆DNA的提取
将步骤1剪碎后的叶柄组织加入60ml试剂A中,于95-100℃下煮3min,再加入60ml试剂B,搅拌均匀,即可获得大豆组织的DNA模板。
2.利用权利要求1获得的大豆组织的DNA模板进行PCR扩增的方法,其特征在于:
利用SSR标准引物,以权利要求1获得的DNA模板进行PCR扩增。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:
PCR反应体系为:5×Buffer 2μL,2.5mmol/L Mg2+1μL,0.25mmol/L dNTPs 1μL,0.2μmol/L引物1μL,1.0U Taq DNA聚合酶0.1μL,20ng-40ng DNA模板2μL,ddH2O 2.9μL,总体积10μL。
4.根据权利要求2或3所述的方法,其特征在于:
反应程序为:94℃5min,94℃45s、47℃45s、72℃45s下循环37次,72℃7min,得到扩增产物,12℃保存。
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汪秀峰等: "一种叶片直接用作PCR扩增的新方法及其应用", 《中国水稻科学》 * |
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