CN104946635B - 日本当归的检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了日本当归的核苷酸序列，还公开了检测前述序列的试剂在制备日本当归检测试剂中的用途，以及日本当归的检测试剂盒和检测方法。本发明检测试剂盒和检测方法可以准确、有效的鉴别日本当归，特异性强，耗时短，应用前景良好。

Description

日本当归的检测试剂盒和检测方法

技术领域

本发明涉及一种日本当归的检测试剂盒和检测方法。

背景技术

日本当归为东当归(Angelica acutiloba(Sieb.et Zucc.)Kitagawa)的干燥根茎，主产于日本，早在20世纪70年代，此种就在中国吉林省延吉市引种成功，朝鲜族常用，并称之为东当归。日本当归功效与我国原产正品当归类似，主治月经不调，经来腹痛，腰痛、崩漏，大便干燥，痢疾腹痛等症。但是二者在化学成分、有效含量均有较大的差异，并且日本当归含有有毒成分，存在用药安全问题。

因此，有效鉴别日本当归，对其进行适当处理并合理使用是非常必要的。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种新的、方便、快速、准确地检测日本当归的试剂盒和方法。

本发明提供了SEQ ID NO.1所示的种核苷酸序列。

本发明还提供了检测SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的试剂在制备日本当归检测试剂中的用途。

所述检测SEQ ID NO.1所述核苷酸序列的试剂包括扩增SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的试剂。

所述日本当归是伞形科植物日本当归Levisticum officinalis Koch所述扩增的试剂包括SEQ ID NO.2～3所示的引物对。

本发明检测日本当归的试剂盒，包括检测SEQ ID NO.1所述核苷酸序列的相关试剂。

所述试剂包括扩增SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的试剂。

所述扩增的试剂包括SEQ ID NO.2～3所示的引物对。

本发明一种日本当归的检测方法，包括如下步骤：

a，DNA提取：提取待检样本中的DNA；

b，检测：用前述的试剂盒检测待检样本，即可。

本发明SEQ ID NO.1所示核苷酸序列为日本当归特异性序列，通过检测这些序列可以准确区分日本当归与当归、欧当归，从而有效鉴定待检样本是否为日本当归，为药材的合理使用提供指导，本发明方法操作简便，具有良好的应用前景。

下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，都是本发明保护的内容。

附图说明

图1.欧当归的改良RAPD扩增。箭头为A1-34的RPAD片段，用于胶回收和克隆。

图2阳性克隆的菌落PCR鉴定。蓝色所指通道的阳性克隆用于Sanger测序。通道“M”显示有分子重量(bp)的DL2000DNA标记。泳道1-6分别代表不同阳性克隆的菌落。

图3不同物种及当归品种的鉴定。通道1-18号分别为甘肃岷县当归，日本当归，四川阿坝当归，甘肃平凉当归，湖北当归，四川九寨当归，欧当归，云南丽江当归，四川绵阳当归，银杏，荔枝，龙眼，青果，金银花，栀子花，灵芝，龙荔，赶黄草。蓝色所指的通道2为日本当归，通道7为欧当归。通道“M”显示有分子重量(bp)的DL2000DNA标记。

图4不同日本当归品种的鉴定。通道1、2和3是日本当归，分别来自重庆，四川峨眉，延吉吉林；通道4和5是欧当归，来自长春吉林和四川甘孜；6是正常岷县当归；通道“M”显示有分子重量(bp)的DL2000DNA标记。

具体实施方式

实施例1 RAPD技术扩增日本当归特异SCAR标记

一、CTAB法提取植物DNA

取日本当归0.2g置于1.5mL EP管中，加入液氮约半分钟后用研钵棒碾碎成细粉，立即加入500μl的CTAB提取缓冲液[CTAB2％，Tris-HCl(pH8.0)100mmol.L^_1，EDTA20mmolmmol.L^_1，NaCL 1.4mol.L^_1，0.4％的β-巯基乙醇]，60℃水浴保温1小时后，加入等体积的氯仿-异戊醇(24：1)抽提，轻颠倒混匀，10000转每分钟离心10分钟，吸取上清液，取上清加入2/3体积的预冷的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀；12000转每分钟离心10分钟，弃上清，小心倾去上清液，沉淀用70％乙醇和无水乙醇各轻洗一次，弃洗液，留沉淀，空气干燥。用100μl的1×TE溶液溶解备用。将样品用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量，用分光光度计测定浓度，稀释至浓度10ng/μl，-20℃保存备用。详见《精编医学分子生物学实验指导》(中国医药科技出版社，主编：傅俊江)。

二、RAPD技术PCR扩增

利用RAPD技术进行扩增(参照Fu J,Yang L,Khan MA,Mei Z(2013)Geneticcharacterization and authentication of Lonicera japonica Thunb.by usingimproved RAPD analysis.Mol Biol Rep,40(10):5993-9)：

以步骤一提取的核酸作为模板，用RAPD引物SBA-A1和SBS-A2进行扩增(序列见表1，北京赛百盛公司合成)，PCR扩增采用10μl反应体系包括：1μl的引物(2.5μmol/L),1.5μl(15ng)模板DNA，5μl的2×PCR Taq Mastermix(天根生物公司，北京)和2.5μl的灭菌双蒸水。充分混匀后，于离心机12000rpm离心15s，置于PCR仪(Applied Biosystems96-Well Thermal Cycler，Life Technology,USA)。PCR反应条件是：95℃1分30秒,94℃40秒，36度60秒，72℃1分30秒，40个循环，最后72℃5分钟，其中RAMP 为5％。然后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，曝光显色。

表1

琼脂糖凝胶电泳(参见《精编医学分子生物学实验指导》，中国医药科技出版社，主编：傅俊江)：

(1)制备1.5％的琼脂糖凝胶，将PCR产物按顺序全部点样到凝胶孔内，同时点样一个DNA分子大小标记(DL2000，TIANGEN公司，北京)。注意：不需要加载样缓冲液，PCR扩增用的2×mix就预加了相关成分。

(2)电泳(电泳仪由北京百晶生物有限公司生产，BG-subMID Icell)，常选择电压110V，电泳时间30min即可，

三、RAPD扩增条带的分离

1.片段回收

1.5％的琼脂糖凝胶电泳，在紫外线下剪切图正品日本当归品种的特异片段A1-0，用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生物公司)回收RAPD扩增的DNA片段。

2.克隆

接着利用pGEM-T载体(Promega Corporation)和回收RAPD扩增的DNA片段在T4-DNA连接酶作用下连接(16℃连接8小时)。连接后加入30μl活化的DH5α细菌，冰浴30分钟，接着42℃激活45秒，然后冰浴2分钟，再加入300μl无氨苄青霉素的LB培养基(配制方法：12.5克LB粉加500ml水高温灭菌)200转每分钟摇动45分钟，然后将液体均匀涂抹在含氨苄青霉素的固体LB培养基表面，37℃培养15小时[固体培养基配制方法：12.5克LB粉，7.5克琼脂粉和500毫升水高温灭菌后，在50℃时加入500μl的氨苄青霉素(100mg/ml)，使用前在固体培养基表面涂抹40μl的20mg/ml的X-GAL(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和20μl的24mg/ml的IPTG(异丙基硫代 半乳糖苷)]进行蓝白筛选，筛选白色菌落进行菌落PCR鉴定。

3.阳性克隆鉴定

每个皿挑选多个白色菌落，分别加入到300μl含氨苄青霉素的LB液体培养基中，220转每分钟摇2-4小时，取0.2～0.5μl培养基进行菌落PCR反应。10μl体积的反应体系是：2×PCR Taq Mastermix 5μl，DNA 0.5μl，通用引物(SP6+T7)1μl(2.5μmol/L)，水3.5μl。PCR反应条件是：95℃1分30秒，94℃40秒，58℃30秒，72℃40秒，30个循环，最后72℃5分钟。然后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，EB染色、曝光显色。

4.结果

改良RAPD扩增见图1。阳性克隆的菌落PCR扩增和电泳鉴定结果如图2。

五、测序分析

1.测序

挑选阳性克隆，进行Sanger测序。测序的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.1所示)：

CAGGCCCTTTATCGGCTACGGACTAATAAACAATGCCAACACAAGAAAATATCAACACCTCACTATAATAAAAGGGTCAATAGAAATTAGGGTTTTGATTTTAAAAAACCCCCAAATTAAAGCTTACCAATTTCAGTAGAGAAGGCCCTAGAAATAGTATAGGAGACCCTATTCGTGCAGAGAACACCCAAATTAAAGCTTACCAATTTGGACACGAGCAAAGGAGAGACGGGAGCAGAGGTGTTTGGTAATGGTGGTGAGTAGAGAAGGACGGAGGTGAGTAGAACAGAGGTGAGTGGTGGTGGTGGTG。

2.同源性搜寻与查新

将测序获得的如上序列，在NCBI网站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上进行比对，未见相同或者重复序列，说明如它为新的、日本当归特有的核苷酸序列，可建立日本当归特异的SCAR标记。

实施例2 用本发明方法特异扩增日本当归的基因

1、实验方法

(一)根据实施例1得到的日本当归特异的SCAR标记(SEQ ID NO.1所示的序列)，设计1对引物，合成。

(二)PCR扩增

1、模板制备

检测不同物种：取选取了18个不同物种或者品种基因组DNA作为模板，它们分别是：甘肃岷县当归，日本当归，四川阿坝当归，甘肃平凉当归，湖北当归，四川九寨当归，欧当归(第7个泳道)，云南丽江当归，四川绵阳当归，银杏，荔枝，龙眼，青果，金银花，栀子花，灵芝，龙荔，赶黄草。分别稀释成10ng/μl备用。

鉴别日本当归、欧当归和当归：1、2和3是日本当归，分别来自重庆，四川峨眉，延吉吉林；4和5是欧当归，来自长春吉林和四川甘孜；6是正常岷县当归。

基因提取方法同实施例1。

2、PCR扩增：

(1)PCR体系(10μl)

充分混匀后，于离心机12000rpm离心15s，置于PCR仪(Applied BiosystemsThermal Cycler，Life Technology，USA)。

(2)PCR扩增条件

3、琼脂糖凝胶电泳(胶浓度根据其目的片段的大小而定)。

详见《精编医学分子生物学实验指导》(中国医药科技出版社，主编：傅 俊江)

(1)脂糖凝胶的配置：用电子天平称取0.8g琼脂粉，加入1×TAE 40ml，放入微波炉中充分溶解(中火至沸腾，中低火至沸腾2次)，置于实验桌上，加入EB 2μl，混匀，待冷却至50℃备用；

(2)用0.75mm 16孔宽齿梳，配制胶板，将制胶板放入制胶槽中，将溶解的琼脂糖(约50℃)，倒入其中，直至厚度为6mm(如有气泡要把气泡赶出)，待其在室温下充分凝固后备用；

(3)点样：

(4)100V电泳45min；

4、图像摄取：(BIO-RAD，Universal HoodⅡ)

二、实验结果

如图3所示，本发明设计的引物可以从日本当归中扩增出特异性片段，而当归和日本当归没有扩增出特异性条带，其他品种植物基因组也没有扩增出任何条带。

如图4所示，本发明设计的引物可以从3个分别来自重庆、四川峨眉和吉林延吉的日本当归扩增出特异性片段，而一个正品当归和2个分别来自吉林长春和四川甘孜的欧当归中没有扩增出特异性条带。

实验结果说明，本发明SEQ ID NO.2～3所示引物的特异性良好，可以特异、有效扩增日本当归的基因，能够有效鉴别日本当归。

实施例3 本发明日本当归检测试剂盒和使用方法

一、试剂盒组成

本试剂盒含有：

CTAB提取缓冲液(200ml)；

2×Taq Master Mix，其中，引物可以选用SEQ ID NO.5～6、SEQ ID NO.7～8、SEQID NO 9～10所示引物中的一对引物或者多对引物(500μl)；

阴性对照模板DNA(欧当归或当归的DNA)一管(50μl)；

阳性对照模板DNA(日本当归DNA)一管(50μl)；

灭菌ddH₂O(1500μl)。

(一)CTAB提取缓冲液

CTAB提取缓冲液(100ml)

2.0g CTAB(Hexadecyl trimethyl-ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)

10.0ml 1M Tris(pH 8.0)

4.0ml 0.5M EDTA(pH 8.0)

28.0ml 5M NaCl

40.0ml H₂O

1g PVP 40(polyvinyl pyrrolidone，聚乙烯基吡咯烷酮，Mw 40,000)用HCL调至pH 5.0，加H₂O至100ml.

(二)PCR体系2×Taq Master Mix的配方

二、检测方法

(一)PCR扩增

1、CTAB提取缓冲液提取待检样本DNA。

2、进行PCR扩增：

具体如下：

不同品种DNA 1μl(50ng/μl)

2×Taq Master Mix 5μl

ddH₂O 4μl

充分混匀后，12000rpm离心30s；

注：2×Taq Master Mix，同时取不同DNA模板设定阳性和阴性对照

3、放入PCR仪上(Mastercycler 5331PCR仪器，德国Eppendorf，或者其它PCR仪器如Applied BiosystemsThermal Cycler)，采用如下程序。

(二)琼脂糖凝胶电泳：

1、脂糖凝胶的配置：用电子天平称取0.8g琼脂粉，加入0.5×TAE 40ml，放入微波炉中充分溶解(中火至沸腾，中低火至沸腾2次)，置于实验桌上，加入EB 2ul，混匀，待冷却至50℃备用；

2、用0.75mm 16孔宽齿梳，配制胶板，将制胶板放入制胶槽中，将溶解的琼脂糖(约50℃)，倒入其中，直至厚度为6mm(如有气泡要把气泡赶出)，待其在室温下充分凝固后备用；

3、点样：注意加样顺序，并加上DNA的分子Marker

4、100V电泳45min；

(三)结果检测与分析

在凝胶成像仪下观察结果，结果照相保存，并分析结果。

综上，本发明提供的检测试剂盒和检测方法可以有效鉴定日本当归，特异性强，耗时短，检测快速，具有良好的临床应用前景。

Claims (7)

1.一种日本当归特异的SCAR标记，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.检测SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的试剂在制备日本当归检测试剂中的用途， 所述检测试剂包括扩增SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的试剂。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述扩增的试剂包括SEQ ID NO.2～3所示的引物对。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述日本当归是伞形科植物日本当归Levisticum officinalis Koch。

5.一种检测日本当归的试剂盒，其特征在于：包括检测SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的相关试剂；所述试剂包括扩增SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述扩增的试剂包括 SEQ ID NO.2～3所示的引物对。

7.一种检测日本当归的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

a，DNA提取：提取待检样本中的DNA；

b，检测：用权利要求5或6任意一项所述的试剂盒检测待检样本，即可。