CN109504782A - 一对特异性鉴别宽体金线蛭的引物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴定宽体金线蛭的特异性引物对，由引物KT‑5’和引物KT‑3’组成，所述引物KT‑5’和所述引物KT‑3’均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1和序列2。采用该特异性引物对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，如果能够实现有效扩增，则所述待测样品中含有或候选含有宽体金线蛭；如果不能实现有效扩增，则所述待测样品中不含有或候选不含有宽体金线蛭。本发明能有效得将宽体金线蛭与其他水蛭样品进行区分，快速、简便。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及鉴别宽体金线蛭的特异性引物对和方法、应用。
背景技术
水蛭(HIRUDO)别名马蛭、麻黄蜞、马蟥，属环节动物门蛭纲医蛭形亚目医蛭科。《神农本草经》记载：“水蛭主逐恶血、瘀血，月闭、破血瘕积聚……”，作为中药,迄今已有3000多年的历史。现代中医学认为水蛭属活血化瘀药下属分类的活血调经药，可以抑制血小板的释放、降低血脂、抑制成纤维细胞增殖；用于防治血栓疾病、控制癌症细胞转移与增值等。水蛭的功效与其抗凝血作用密切相关，其中最重要的、疗效最好的抗凝血活性物质是水蛭素(Hirudin)，它是迄今为止世界上最有效和最安全的天然凝血酶抑制剂，与胰岛素、青蒿素被称为拯救人类疾病的“世界三素”，具有极高的药用价值。
2015版《药典》规定用于药用的水蛭为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman(即宽体金线蛭)、水蛭Hirudo nippponica whitman(即日本医蛭)或柳叶蚂蟥Whitmaniaacranulata Whitman(即尖细金线蛭)。值得注意的是，世界上的水蛭有500多种，我国有97种，它们分属于不同的目、科和属，在形态结构、取食习性、生活环境以及体内所含生物活性物质的结构和功能方面都是十分不相同的。发明人对我国安徽亳州、河南禹州、四川成都荷花池和湖北蕲春几个主要中药材市场销售的水蛭以及近十种水蛭中成药的原料作了调查发现，中药水蛭的资源极度紧缺；同时，水蛭的生产和贸易缺乏行业规范，来源混乱，存在着严重的相似品种水蛭品种混淆用药问题。不同品种、疗效有差异的水蛭品种混用影响水蛭中药材质量，也给临床用药带来极大的安全隐患。为了临床用药安全、准确和有效，针对外形相近的不同中药材品种建立一种有效准确的鉴定方法成为已经成为迫在眉睫的需求。
随着分子生物学迅速发展，DNA水平上的多样性研究取得突破性进展，用于药用的动植物的分子鉴定技术也日渐完善。肖凌等(水蛭DNA鉴定、活性多肽分离及其作用机制的研究，湖北中医药大学，2015年)扩增得到宽体金线蛭、菲牛蛭、日本医蛭、尖细金线蛭、光润金线蛭、棒纹牛蛭、日本山蛭及八目石蛭等8个物种的ITS2、COⅠ、12Sr RNA、16Sr RNA等基因片断的序列，比较此4个基因片断候选序列种内种间差异；得到12Sr RNA为医用蛭类较为合适的DNA条形码序列。CN2014101625452以DNA条形码技术鉴定宽体金线蛭，通过对标准目的基因的DNA序列测定与比对分析，根据与理论序列的相似性进行判定的物种鉴定技术。但这种方法在检测过程中迟迟没有推广起来，该方法存在着判定标准不严格、实际应用性不强等限制。具体原因主要有以下三个方面：一是过程复杂，耗时费力。DNA条形码实验需要经过提取DNA、聚合酶链式反应(PCR)，PCR产物电泳验证、委托测序以及测序结果的手工校对、序列拼接、与公开序列进行比对等诸多步骤，不适用于快速、高通量的应用检测。二是，结果稳定性较差，序列测定步骤复杂，测序反应的结果收到样品前处理与反应条件的影响而质量不一，影响物种判定结论。三是，缺乏明确的判定标准，通常如果目标基因与所述理论基因序列SEQ ID NO.1的同源性在99％以上，即可判断待测样品的物种。但是，根据基因不同，待测物种不同，序列在物种间的变异程度是不相同的。因此，缺乏一个稳定、准确、清晰的同源性标准进行判定。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种鉴别宽体金线蛭特异性引物对，有效得将宽体金线蛭与其他水蛭样品进行区分，快速、简便。
本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：
本发明首先提供一种用于鉴别宽体金线蛭的特异性引物对，可由引物KT-5’和引物KT-3’组成，所述引物KT-5’和所述引物KT-3’均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1(TATGTATTGAAAGGGTATTCAATCG)和序列2(TTAAGAATGATCATCAGTATATAGTG)。
上述用于鉴定宽体金线蛭的特异性引物对中，所述引物KT-5’和所述引物KT-3’的摩尔比可为1:1。
上述用于鉴定宽体金线蛭的特异性引物对的应用，为如下a)-f)中任一种：
a)制备用于检测或辅助检测宽体金线蛭的试剂盒；
b)检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有宽体金线蛭；
c)制备用于鉴定或辅助鉴定宽体金线蛭的试剂盒；
d)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为宽体金线蛭；
e)制备用于鉴定或辅助鉴定市售宽体金线蛭的真伪性的试剂盒；
f)鉴定或辅助鉴定市售宽体金线蛭的真伪性。
本发明还提供了用于鉴定宽体金线蛭的试剂盒。本发明所提供的用于鉴定宽体金线蛭的试剂盒含有上述用于鉴定宽体金线蛭的引物对。其中，它还包括Taq DNA聚合酶、dNTP、反应缓冲液或水。
上述用于鉴定宽体金线蛭的试剂盒的应用也属于本发明的保护范围。上述用于鉴定宽体金线蛭的试剂盒的应用可为如下b1)或b2)或b3)：
b1)检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有宽体金线蛭；
b2)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为宽体金线蛭；
b3)鉴定或辅助鉴定市售宽体金线蛭的真伪性。
本发明还提供了一种检测待测样品是否含有或候选含有宽体金线蛭的方法，可包括如下步骤：提取待测样品的总DNA作为模板，采用上述用于鉴定宽体金线蛭的引物对(或试剂盒)进行PCR扩增，如果能够实现有效扩增，则所述待测样品中含有或候选含有宽体金线蛭；如果不能实现有效扩增，则所述待测样品中不含有或候选不含有宽体金线蛭。
本发明还提供了一种鉴定待测样品是否为或候选为宽体金线蛭的方法，可包括如下步骤：提取待测样品的基因组DNA作为模板，采用上述用于鉴定宽体金线蛭的引物对(或试剂盒)进行PCR扩增，如果能够实现有效扩增，则所述待测样品为或候选为宽体金线蛭；如果不能实现有效扩增，则所述待测样品不为或候选不为宽体金线蛭。
本发明还提供了一种鉴定市售宽体金线蛭的真伪性的方法，可包括如下步骤：提取市售宽体金线蛭的基因组DNA作为模板，采用上述用于鉴定宽体金线蛭的引物对(或试剂盒)进行PCR扩增，如果能够实现有效扩增，则所述市售宽体金线蛭为或候选为真品；如果不能实现有效扩增，则所述市售宽体金线蛭为或候选为伪品。
上述任一所述方法中，所述“能够实现有效扩增”为PCR扩增产物中含有400-500bp的DNA片段；所述“不能实现有效扩增”为PCR扩增产物中不含有400-500bp的DNA片段。其中，所述400-500bp的DNA片段可为496bp的DNA片段。
上述方法中，进行所述PCR扩增时，采用的退火温度具体可为55℃。
上述方法中，进行所述PCR扩增时，采用的扩增程序具体可为94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；35～38个循环；72℃延伸5min。
上述方法中，进行所述PCR扩增时，所述PCR扩增的体系可为：总体积为20μl时，SYBR Premix Ex Taq II 10μl，上游引物KT-5’0.4μl(0.4μM)，下游引物KT-3’0.4μl(0.4μM)，模板1μl(10-30ng)，灭菌蒸馏水补齐20μl。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
首先，本发明涉及引物对特异性良好，利用特异性引物进行PCR，不与目标以外的DNA片段产生非特异性反应，并且扩增得到的PCR产物可以明显区分，可以用于快速、准确的鉴别宽体金线蛭品种真伪，而不对其它水蛭品种产生非特异性反应，一次反应可以将目标水蛭品种鉴别出来。本发明所述的特异性引物对，特别是所述上游引物3’端的第二位引入了错配(第1个碱基g和第2碱基c)，该碱基的引入避免了假阳性检测结果的出现，增加了引物的特异性，同时提高了所述引物的检测准确度。
再者，本发明还涉及一种高分辨的DNA检测方法，结合微芯片电泳(岛津公司，MultiNA)进行直接检测，实现了对水蛭药材的快速检测。相比药典中规定的对PCR扩增产物进行检测的琼脂糖凝胶电泳方法，此方灵敏度好、分辨率高、分析成本低、操作简便，可快速实现中药材品种的鉴别。
另外，采用通用引物COI对宽体金线蛭进行鉴定时，往往容易引入寄主血液的污染，导致测序双峰或鉴定结果为非水蛭类等情况。采用本发明所述特异性引物鉴定宽体金线蛭，既避免了寄主DNA与宽体金线蛭DNA同时扩增造成的污染，同时又省去DNA条形码测序与序列分析等步骤，同时可降低检验人员的分子生物学知识水平要求，降低人力物力的消耗，缩短检验时限，以期节时、高效得鉴定宽体金线蛭，具有显著优势。
附图说明
图1为特异性引物考察凝胶图；左侧：DNA Marker，从上至下依次为：500bp、450bp、425bp、400bp、375bp、350bp、325bp、300bp、275bp、250bp、225bp、200bp、175bp、150bp、125bp、100bp、75bp、50bp、25bp；模板：1-水(空白对照)，2-宽体金线蛭，3-日本医蛭，4-菲牛蛭。
图2为图1中模板2-宽体金线蛭相对应的电泳图。
图3为不同批次水蛭多重PCR鉴别电泳图；左侧L：DNA Marker，从上至下依次为：500bp、450bp、425bp、400bp、375bp、350bp、325bp、300bp、275bp、250bp、225bp、200bp、175bp、150bp、125bp、100bp、75bp、50bp、25bp；模板：1-8为不同批次的水蛭样品，详见表1；引物：含宽体金线蛭特异性引物对的引物混合物，该引物混合物由KT-5’TATGTATTGAAAGGGTATTCAATCG，KT-3’TTAAGAATGATCATCAGTATATAGTG，FN-5’GTAATTAGAATCGTAATAGCTC，FN-3’CATAATTGAATATACATTTACAGCAGAA，RY-5’CCAGCTATATCATTAAGTCAAT，RY-3’CTTAATGGAGTATTTTGAATT组成。
图4为利用多种水蛭混合样品考察本发明所述宽体金线蛭特异性引物对的凝胶图；左侧L：DNA Marker，从上至下依次为：500bp、450bp、425bp、400bp、375bp、350bp、325bp、300bp、275bp、250bp、225bp、200bp、175bp、150bp、125bp、100bp、75bp、50bp、25bp；模板：1-水，空白对照；2-宽体金线蛭，3-菲牛蛭，4-日本医蛭，5-日本医蛭+菲牛蛭，6-日本医蛭+菲牛蛭+宽体金线蛭。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。
下述实施例中，所涉及主要仪器和试剂如下：微芯片电泳(岛津公司MultiNNAMCE-202)，PCR仪(岛津公司)，紫外-分光光度仪(岛津公司Biospec-nano)，高速离心机(Eppendort 5418)；DAN聚合酶(SYBR Premix Ex Taq II，宝生物RR820)，DNA染料(Gold Nucleic Acid Gel Stain，美国英杰生命技术有限公司S-11494)，微芯片电泳试剂盒(DNA-500Reagent Kit for MultiNA，岛津公司292-27910-91)，DNA分子量标准(25bp DNALadder，美国英杰生命技术有限公司10597-011)，基因组DNA提取试剂盒(DNeasy Blood&Tissue Kit，QIAGEN 69504)。
下述实施例中，所涉及药材样品包括日本医蛭、宽体金线蛭、菲牛蛭以及市面上八种不同批次的水蛭药材。
实施例1
一种用于鉴别宽体金线蛭的特异性引物对KT，由引物KT-5’和引物KT-3’组成，所述引物KT-5’和所述引物KT-3’均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1和序列2。
采用上述引物对鉴别水蛭样品的方法，步骤如下：
(1)基因组DNA提取：水蛭待测样品取30mg，用动物DNA提取试剂盒提取总DNA。按照DNA提取试剂盒说明书进行操作，-4℃保存；DNA提取物取1μL，采用紫外-分光光度仪验证DNA质量，OD260/280大于1.6且小于1.8，OD260/230大于2.0；
本步骤中待测样品分别为来源清晰并经过传统方法验证过品种的宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭标准品，已验证本发明所述引物对的特异性；
(2)PCR扩增体系的建立与反应：PCR反应体系总体积20μL，其中包括SYBR PremixEx Taq II 10μl，模板1μl(10ng)，引物对KT浓度均为0.4μM用量各0.4μl，无菌双蒸水补充体系至20μL；
PCR反应参数：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；35～38个循环；72℃延伸5min；4℃保存；
(3)结果检测：PCR扩增反应结束后，取PCR反应产物1μl，微芯片电泳检测，试剂盒选用微芯片电泳500bp试剂盒(DNA-500Reagent Kit for MultiNA)，系统自动生成凝胶图与电泳图。
由图1和图2可知：宽体金线蛭理论PCR产物为496bp，只有用宽体金线蛭的特异性引物扩增宽体金线蛭的DNA模板时，微芯片电泳在495bp处检测出有单一条带，与理论上宽体金线蛭特异性PCR的目标产物496bp，基本一致。而以日本医蛭、菲牛蛭和水为待测样品时，分别作为模板的扩增产物中400-500bp之间没有条带，证明该引物对可以特异性的鉴别宽体金线蛭。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于：分别设置退火温度为50、55、58℃，考察不同退火温度对PCR扩增反应的影响，筛选最适退火温度。
结果显示，温度的升高可提高反应的特异性，但当退火温度高达60℃时，特异性鉴别条带亮度较弱，因此选择55℃为扩增体系的退火温度。
实施例3
采用上述实施例1的的反应体系和反应参数，其中引物对为混合引物对，宽体金线蛭的引物对KT浓度为0.2μM，日本医蛭的引物对RY浓度为0.2μM，菲牛蛭的引物对FN浓度为0.4μM，再次用8种不同批次的水蛭药材对所建立的PCR鉴别体系进行方法适用性验证，样品信息见表1，其中预期结果为经过传统方法验证过的水蛭品种，具体电泳图见图3。
表1不同批次水蛭样品信息
由图3可知，水蛭的宽体金线蛭样本DNA扩增产物在400-500bp之间有一条带，而其他水蛭样本DNA扩增产物在400-500bp之间则没有条带，证明本发明所述引物对特异性好，适用性强，可对宽体品种进行直观、快速、准确的鉴别。
实施例4
上述鉴别宽体金线蛭的特异性引物对用于待测样品为多种水蛭混合物，鉴定其是否含有宽体金线蛭。
反应体系与检测方法参照实施例1，其中DNA模板为多种水蛭的混合DNA模板，PCR扩增产物以微芯片电泳仪MultiNA检测。结果由图4显示，每个混合样品中宽体金线蛭成分都被成功扩增并被微芯片电泳仪MultiNA检测，如果混合样品不含宽体金线蛭，扩增产物中400-500bp之间没有条带，阴性对照(水)也没有条带。证明该引物对可以特异性的鉴别混合物中的宽体金线蛭成分。
综上，本发明提供的方法，只通过一次PCR扩增即可准确、快速、可靠地从几种易混淆的水蛭品种中鉴别宽体金线蛭，而且本发明通过微芯片电泳检测，灵敏度好、分辨率高、分析成本低、操作简便，是中药材和食品品种鉴别有力的分析方法。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。
＜110＞中国食品药品检定研究院
＜120＞一对特异性鉴别宽体金线蛭的引物
＜160＞6
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>artificial sequence
<400>1
tatgtattga aagggtattc aatcg 25
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>artificial sequence
<400>2
ttaagaatga tcatcagtat atagtg 26
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>artificial sequence
<400>3
gtaattagaa tcgtaatagc tc 22
<210>4
<211>28
<212>DNA
<213>artificial sequence
<400>4
cataattgaa tatacattta cagcagaa 28
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>artificial sequence
<400>5
ccagctatat cattaagtca at 22
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>artificial sequence
<400>6
cttaatggag tattttgaat t 21
Claims (10)
1.用于鉴定宽体金线蛭的特异性引物对，其特征在于由引物KT-5’和引物KT-3’组成，所述引物KT-5’和所述引物KT-3’均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1(TATGTATTGAAAGGGTATTCAATCG)和序列2(TTAAGAATGATCATCAGTATATAGTG)。
2.权利要求1所述特异性引物对的应用，其特征在于为如下a)-f)中任一种：
a)制备用于检测或辅助检测宽体金线蛭的试剂盒；
b)检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有宽体金线蛭；
c)制备用于鉴定或辅助鉴定宽体金线蛭的试剂盒；
d)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为宽体金线蛭；
e)制备用于鉴定或辅助鉴定市售宽体金线蛭的真伪性的试剂盒；
f)鉴定或辅助鉴定市售宽体金线蛭的真伪性。
3.含有权利要求1所述特异性引物对的试剂盒，其特征在于所述试剂盒用于鉴定或者辅助鉴定宽体金线蛭。
4.权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括Taq DNA聚合酶、dNTP和反应缓冲液。
5.权利要求3所述的试剂盒的应用，其特征在于为如下b1)或b2)或b3)：
b1)检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有宽体金线蛭；
b2)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为宽体金线蛭；
b3)鉴定或辅助鉴定市售宽体金线蛭的真伪性。
6.一种检测待测样品是否含有或候选含有宽体金线蛭的方法，其特征在于包括如下步骤：提取待测样品的总DNA作为模板，采用权利要求1所述的特异性引物对进行PCR扩增，如果能够实现有效扩增，则所述待测样品中含有或候选含有宽体金线蛭；如果不能实现有效扩增，则所述待测样品中不含有或候选不含有宽体金线蛭。
7.一种鉴定待测样品是否为或候选为宽体金线蛭的方法，其特征在于包括如下步骤：提取待测样品的基因组DNA作为模板，采用权利要求1所述的特异性引物对进行PCR扩增，如果能够实现有效扩增，则所述待测样品为或候选为宽体金线蛭；如果不能实现有效扩增，则所述待测样品不为或候选不为宽体金线蛭。
8.一种鉴定市售宽体金线蛭的真伪性的方法，可包括如下步骤：提取市售宽体金线蛭的基因组DNA作为模板，采用权利要求1所述的特异性引物对进行PCR扩增，如果能够实现有效扩增，则所述市售宽体金线蛭为或候选为真品；如果不能实现有效扩增，则所述市售宽体金线蛭为或候选为伪品。
9.如权利要求6或7或8所述的方法，其特征在于所述“能够实现有效扩增”为PCR扩增产物中含有400-500bp的DNA片段；所述“不能实现有效扩增”为PCR扩增产物中不含有400-500bp的DNA片段。
10.如权利要求6或7或8所述的方法，其特征在于进行所述PCR扩增时，采用的扩增程序具体可为94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；35～38个循环；72℃延伸5min；所述PCR扩增的体系可为：总体积为20μl时，SYBR Premix Ex Taq II 10μl，KT-5’引物0.4μl，KT-3’引物0.4μl，模板1μl，灭菌蒸馏水补齐20μl。
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