CN102888456A

CN102888456A - 三七快速鉴定方法

Info

Publication number: CN102888456A
Application number: CN2012103572785A
Authority: CN
Inventors: 廖保生; 韩建萍; 陈晓辰; 陈士林
Original assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Priority date: 2012-09-21
Filing date: 2012-09-21
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2032-09-21
Also published as: CN102888456B

Abstract

本发明公开了一种三七快速鉴定方法，其包括如下步骤：1）以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No.1所示序列的片段；2）对扩增产物进行测序，分析SEQ ID No.1所示的序列，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第140位为T或207位为T，则鉴定为三七，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第140位和第207位不是T，则待鉴定样品不是三七。本发明能够实现三七原植物及其近缘种、药材、生饮片、粉未和混淆品的快速、准确鉴定。

Description

三七快速鉴定方法

技术领域

本发明术语中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及用特异的SNP鉴定三七的方法。

背景技术

三七（Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen）是人参属多年生植物，是我国传统中药材，含有多种生物活性成分。三七是名贵中药材，具有散瘀止血，消肿定痛之功效。可治疗各种出血症，人参“补气第一”,三七“补血第一”,味同而功亦。三七与人参(Panax ginseng C.A.Mey)、西洋参（Panax quinquefolium L.）、竹节参（Panax japonicus C.A.Mey.）及其变种狭叶竹节参（Panax japonicus C.A.Mey.var.angustifius(Burk)Cheng et Chu）、珠子参（Panax japonicus C.A.Mey.var.major(Burk)C.Y.Wu et K.M.Feng）、姜状三七（Panaxzingiberensis C.Y.Wu et K.）、屏边三七（Panax stipuleanatus Tsai etFeng）和假人参（Panax pseudoginseng Wall.）均作为药物使用，它们来源于同科、同属，为亲缘关系相近的植物，这几种药物在药性和功效方面有很大区别，尤其是三七归为活血、止血类药物而非滋补性药物，在中医临床上也区别使用。三七药材价格昂贵，市场上常出现其混伪品。由于三七与其近缘种、混伪品外形类似，传统的性状鉴别对三七与其近缘种的鉴定有一定困难，尤其对于药材市场存在的三七切片、粉末、种子和种苗的鉴别具有更大障碍。这就需要寻找到一种稳定可靠的方法将三七药材、饮片、粉末加以鉴定区分。

发明内容

本发明第一个目的在于提供三七鉴定用SNP标记。

本发明第二个目的在于提供三七鉴定用SNP标记在三七鉴定中的应用。

本发明第三个目的在于提供三七快速鉴定方法

本发明提供的三七鉴定用SNP标记，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，其中，SEQ ID No.1所示序列的5’端起第140位三七为T，其他物种为A或缺失；第207位三七为T，其他物种为C或A。

本发明提供的SNP可用于鉴定三七，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第140位为T或第207位为T，则鉴定为三七，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第140位和第207位不为T，则待鉴定样品不是三七。

本发明提供的三七鉴定方法，其包括如下步骤：

1）以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No.1所示序列的片段；

2）对扩增产物进行测序，拼接后去除序列两端5.8S和26S基因区，获得完整ITS2基因间隔区，通过分析SEQ ID No.1所示的序列，确定自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第140位或第207位的碱基。

其中，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第140位为T或第207位为T，则鉴定为三七，否则不是三七。

本发明扩增时使用的引物序列为：

ITS2F 5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′

ITS3R 5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′

上述引物用于扩增三七的ITS2序列。

本发明还提供含有上述引物的试剂盒。

本发明提供了上述试剂盒在三七鉴定中的应用。

本发明方法适用性更广，能检测所有能提取出DNA的三七任何样品。因此，能够实现三七原植物与近缘种、药材、生饮片、粉末与混淆品的快速、准确鉴定。

附图说明

图1所示为ITS2序列的扩增结果，其中1-11分别代表SN01-SN11的扩增结果，CK为阴性对照。

图2所示为三七（P.notoginseng）的三个种内变异类型。

图3所示为三七（P.notoginseng）和其他物种ITS2序列的比对结果，其中图3a为ITS2基因间隔区，5’端起第140位，三七为T，其他物种为A或缺失；图3b为在第207位，三七为T，其他物种为C或A。

图4所示为三七与混伪品构建NJ树结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1三七药材原料的鉴定方法

1）从不同药材商店和道地产地（云南）收集的24份三七样品，分别取20mg药材，在MM400球磨仪（德国Retsch）上进行研磨，用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因组DNA试剂盒提取总DNA。

表1三七样品信息表

2）PCR扩增

引物序列为ITS2F：ATGCGATACTTGGTGTGAAT；ITS3R：GACGCTTCTCCAGACTACAAT，由生工生物工程公司有限公司（北京）合成。引物用无菌去离子溶解并稀释至2μmol/μL。

25μL反应体系：PCR Buffer(10×)2.5μL，Mg²⁺ 2μL(25mmol/L)，dNTPs混合物2μL（2.5mmol/L），引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA 1μL(-约30ng)，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL，进行PCR扩增。

PCR反应程序：在PCR仪上按照以下程序进行扩增反应：

分别取5μL的PCR扩增产物上样，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后在凝胶成像仪上检测结果。（图1）

3）测序

PCR产物直接送中国农业科学院重大工程实验室测序。测序引物同本发明的ITS2F和ITS3R的PCR引物。为确保DNA条形码序列的可靠性，需要进行正反向测序或重复测序，然后将正反向测序结果进行拼接获得DNA条形码序列。

4）序列拼接

本实施例采用应用软件CodonCode Aligner 3.7.1（CodonCode Co.,Germany）进行序列拼接及校对。首先，进行测序质量评估及预处理，即去除测序结果两端的低质量部分，并对剩余部分进行质量评估，如果满足质量要求，方可用于序列拼接，具体方法是：以20bp的窗口分别从序列5’端和3’端进行滑动，如果窗口内有多于2个碱基的Q值小于20，则删除一个碱基，窗口继续滑动，如果窗口内碱基Q值小于20的数目小于或等于2个，窗口停止滑动。测序结果的剩余部分需大于150bp，且平均Q值大于等于30。最后进行序列拼接，根据Hidden Markov Model(HMM)模型，去除序列两端5.8S和26S基因区，获得完整的三七ITS2基因间隔区序列。从GenBank中下载药典规定的五种人参属药用植物及三七混伪品的ITS/ITS2序列，同样根据Hidden Markov Model(HMM)模型，去除序列两端5.8S和26S基因区，获得完整的ITS2基因间隔区序列。

5）序列比对

用MEGA 5软件对测序并拼接后的各个样品以及GenBank中人参属植物的ITS2基因间隔区序列进行比对，共获得2个SNP位点，所有三七样品的ITS2基因间隔区序列（SEQ ID No.1）的第140位为T，第207位为T，而其他物种（姜状三七、羽叶三七、竹节参、狭叶竹节参、西洋参、假人参）的ITS2基因间隔基因区序列的第140位为A或缺失，第207位为C或A，表明这两个SNP位点可特异性地用于三七的鉴定。这两个SNP位点存在于所有实验数据及GenBank数据中，由于数据较多，图3a和图3b仅显示了部分序列比对结果。三七存在较小种内变异（包括所有实验数据及GenBank数据），图2列出了三七的三个种内变异类型，种内变异位点不影响三七两个特异的SNP位点的鉴定。

6）构建系统发育树（NJ树）

由于三七的伪品莪术和高良姜的ITS2序列与三七的相差较大，可直接构建NJ树将其区分。将完整的三七及莪术（Curcumaphaeocaulis）、高良姜（Alpinia officinarum）的ITS2序列导入MEGA5软件中进行比对，用比对结果构建以K2P为模型的NJ树，结果如图4所示。

实施例2三七饮片的鉴定

基本同实施例1，所不同的是以三七饮片为样品，提取DNA，进行鉴定，结果也能特异性地检测到上述的2个SNP位点。并且序列对比发现，三七饮片DNA的ITS2基因间隔区序列（SEQ ID No.1）的第140位为T，第207位为T。

实施例3三七粉末的鉴定

基本同实施例1，所不同的是以三七粉末为样品，提取DNA，进行鉴定，结果也能特异性地检测到上述的两个SNP位点，并且序列对比发现，三七粉末DNA的ITS2基因间隔区序列（SEQ ID No.1）的第140位为T，第207位为T。

本发明序列表中SEQ ID No.1为三七（P.notoginseng）的一致序列(consensus sequence)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种三七鉴定用SNP标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID No.1所示，其中，SEQ ID No.1所示序列的5’端起第140位为T或第207位为T。

2.权利要求1所述的SNP标记在鉴定三七中的应用，其特征在于，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第140位为T或第207位为T，则鉴定为三七。

3.一种三七快速鉴定方法，其包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第140位为T或第207位为T，则鉴定为三七，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第140位和第207位不为T，则待鉴定样品不是三七。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，用于扩增含有SEQ ID No.1所示序列的片段的引物为：

正向ITS2F 5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′

反向ITS3R 5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。

6.一种试剂盒，其特征在于，含有以下引物：

正向ITS2F 5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′

反向ITS3R 5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。

7.权利要求6所述的试剂盒在鉴定三七中的应用。