CN104480105A - 藏菖蒲快速鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种藏菖蒲快速鉴定方法，其包括如下步骤：1)以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No.1所示的序列；2)对扩增产物进行测序，分析SEQ ID No.1所示的序列，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第23位为C和/或第212位为G，则鉴定为藏菖蒲，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第23位为T、第212位为C或T，则待鉴定样品不是藏菖蒲。本发明能够实现藏菖蒲原植物及其近缘种、药材、生饮片和混淆品的快速、准确鉴定。
Description
技术领域
本发明属于中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及用特异的SNPs位点鉴定藏菖蒲的方法。
背景技术
藏菖蒲(Acorus calamus L.)是天南星科菖蒲属多年生草本植物，在亚洲、欧洲和北美洲均有分布。作为藏族习用药材，藏菖蒲具有驱虫、抗菌、减脂、抗癌、抗糖尿病、抗炎、免疫调节、祛痰、防辐射等多种药理作用，同时对消化系统和神经系统也有明显的作用。但是其毒性也不容小觑，作为活性成分的β-细辛醚和α-细辛醚有“三致”(致癌、致畸、致突变)毒性。正因为如此，美国FDA(Food and Drug Administration)明令禁止食用藏菖蒲及其提取物。藏菖蒲(Acorus calamus L.)与本身变种(Acorus americanus)、同属植物石菖蒲(Acorus tatarinowii Schott)、金钱蒲(Acorus gramineus Soland.)、香叶菖蒲(Acorus xiangyeus)、茴香菖蒲(Acorus macrospadiceus)、宽叶菖蒲(Acorus latifolius)亲缘关系很相近，属易混淆品。另外，藏菖蒲、水菖蒲、石菖蒲等在药材市场上叫法较乱，存在同物异名和同名异物的现象。鉴于传统的性状鉴别对藏菖蒲与其近缘种的鉴定比较困难，尤其对于药材市场存在的藏菖蒲切片等的鉴别具有更大障碍。这就需要寻找到一种稳定可靠的方法将藏菖蒲药材、饮片加以鉴定区分。
发明内容
本发明第一个目的在于提供藏菖蒲鉴定用SNPs标记。
本发明第二个目的在于提供藏菖蒲鉴定用SNPs标记在藏菖蒲鉴定中的应用。
本发明第三个目的在于提供藏菖蒲快速鉴定方法
本发明提供的藏菖蒲鉴定用SNPs标记，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其中，SEQ ID No.1所示序列的5’端起第23位藏菖蒲为C，其他物种为T；第212位藏菖蒲为G，其他物种为C或T。
本发明提供的SNPs可用于鉴定藏菖蒲，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第23位为C和/或第212位为G，则鉴定为藏菖蒲，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第23位为T、第212位为C或T，则待鉴定样品不是藏菖蒲。
本发明提供的藏菖蒲鉴定方法，其包括如下步骤：
1)以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No.1所示序列的片段；
2)对扩增产物进行测序，拼接后去除序列两端5.8S和28S基因区，获得完整ITS2内转录间隔区，通过分析SEQ ID No.1所示的序列，确定自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第23位和第212位的碱基。
其中，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第23位为C和/或第212位为G，则鉴定为藏菖蒲，否则不是藏菖蒲。
本发明扩增时使用的引物序列为：
ITS2F 5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′
ITS3R 5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′
上述引物用于扩增藏菖蒲的ITS2序列。
本发明还提供含有上述引物的藏菖蒲鉴定试剂盒。
本发明方法适用性更广，能检测所有能提取出DNA的藏菖蒲任何样品。因此，能够实现藏菖蒲原植物与近缘种、药材、生饮片与混淆品的快速、准确鉴定。
附图说明
图1所示为藏菖蒲ITS2序列的扩增结果(1-11分别代表样品YC0046MT04-YC0046MT14)。
图2所示为藏菖蒲SNPs位点整体缩略图。
图2.1所示为藏菖蒲SNPs位点图(1-46bp)
图2.2所示为藏菖蒲SNPs位点图(176-215bp)
图3所示为C1主导变异和次要变异的种内变异序列(C1为藏菖蒲种内占99.19％的主导变异，C2为次要变异)。
图4所示为多拷贝峰图(C1主导变异峰图，C2次要变异峰图，在变异位点处可见多拷贝峰图)。
图5所示为藏菖蒲及混伪品NJ树。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1藏菖蒲药材原料的鉴定方法
1)从不同产地、植物园等收集的21份藏菖蒲样品和25份石菖蒲样品，其中根茎取约40mg、叶片取约20mg样品，在MM400球磨仪(德国Retsch)上进行研磨，用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA试剂盒提取总DNA。
表1藏菖蒲样品信息表
2)PCR扩增
引物序列为ITS2F：ATGCGATACTTGGTGTGAAT；ITS3R：GACGCTTCTCCAGACTACAAT，由上海生工生物有限公司(北京)合成。引物用无菌去离子溶解并稀释至2.5μmol/μL。
25μL反应体系：PCR Buffer(10×)2.5μL，Mg2+2μL(25mmol/L)，dNTPs混合物2μL(2.5mmol/L)，引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA2μL(～30ng)，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL，进行PCR扩增。PCR反应程序为：94℃变性5min，反应40个cycles(94℃，30s；56℃，30s；72℃，45s)， 72℃延伸10min。
分别取5μL的PCR扩增产物上样，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后在凝胶成像仪上检测结果。(图1)
3)测序
PCR产物直接送上海美吉生物医药科技有限公司测序。测序引物同本发明的ITS2F和ITS3R的PCR引物。为确保DNA条形码序列的可靠性，需要进行正反向测序或重复测序，然后将正反向测序结果进行拼接获得DNA条形码序列。
4)序列拼接
本实施例采用应用软件CodonCode Aligner4.2.7(CodonCode Co.，Germany)进行序列拼接及校对。首先，进行测序质量评估及预处理，即去除测序结果两端的低质量部分，并对剩余部分进行质量评估，如果满足质量要求，方可用于序列拼接，具体方法是：以20bp的窗口分别从序列5’端和3’端进行滑动，如果窗口内有多于2个碱基的Q值小于20，则删除一个碱基，窗口继续滑动，如果窗口内碱基Q值小于20的数目小于或等于2个，窗口停止滑动。测序结果的剩余部分需大于150bp，且平均Q值大于等于30。最后进行序列拼接，根据Hidden Markov Model(HMM)模型，去除序列两端5.8S和28S基因区，获得完整的藏菖蒲ITS2基因间隔区序列。从GenBank下载菖蒲属所有ITS2序列(包括藏菖蒲17条，藏菖蒲变种6条，石菖蒲14条，金钱蒲10条，香叶菖蒲1条，茴香菖蒲1条，宽叶菖蒲1条)及其混伪品鸢尾科植物变色鸢尾(Iris versicolor Linnaeus)、岩白菜(Bergenia purpurascens Hook.f.et Thoms.)Engl.)的ITS2序列，根据Hidden Markov Model(HMM)模型，去除序列两端5.8S和28S基因区，获得完整的ITS2基因间隔区序列。
5)序列比对
用MEGA5软件对测序并拼接后的各个样品以及GenBank中菖蒲属植物的ITS2基因间隔区序列进行比对，共获得2个稳定SNPs位点，所有藏菖蒲样品的ITS2基因间隔区序列(SEQ ID No.1)的第23位为C，第212位为G，而其他物种的ITS2基因间隔基因区序列的第23为T，212位为C或T，表明这两个SNPs位点可特异性地用于藏菖蒲的鉴定。这两个SNPs位点存在于所有实验数据及GenBank数据中(图2)，藏菖蒲种内变异较小，仅有一处变异位点(图3)，对该位点的峰图文件进行分析，发现此变异由ITS2基因组内多拷贝所致(图4)。课题组对藏菖蒲ITS2基因组内多拷贝进行了高通量测序，结果表明主导变异C1占99.19％，其它均为次要变异。本研究大样本量的PCR产物测序结果也证实了21个实验样本中有20条是主导变异C1，仅有一条多拷贝引起的变异类型，GenBank上所有的17条藏菖蒲序列均为主导变异类型C1。因此，C1可以作为藏菖蒲鉴定用标准序列，凡与C1序列相同的物种均可准确鉴定为藏菖蒲。
6)构建系统发育树(NJ树)
由于其他物种的ITS2序列与藏菖蒲的相差较大，可直接构建NJ树将其区分。将藏菖蒲(A.calamus) 及石菖蒲(A.tatarinowii)、金钱蒲(A.gramineus)、香叶菖蒲(A.xiangyeus)、茴香菖蒲(A.macrospadiceus)、宽叶菖蒲(A.latifolius)、变色鸢尾(Iris versicolor)、岩白菜(Bergenia purpurascens)的ITS2序列导入MEGA 5软件中进行比对，用比对结果构建以K2P为模型的NJ树，结果如图5所示。
实施例2藏菖蒲饮片的鉴定
基本同实施例1，所不同的是以藏菖蒲饮片为样品，提取DNA，进行鉴定，结果也能特异性地检测到上述的2个SNPs位点。并且序列对比发现，藏菖蒲饮片DNA的ITS2基因间隔区序列(SEQ ID No.1)的第23位为C，第212位为G。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.藏菖蒲鉴定用SNPs标记，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其特征在于，SEQ ID No.1所示序列的5’端起第23位为C和/或第212位为G。
2.权利要求1所述的SNPs标记在鉴定藏菖蒲中的应用，其特征在于，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第23位为C和/或第212位为G，则鉴定为藏菖蒲。
3.藏菖蒲快速鉴定方法包括如下步骤：
1)以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No.1所示序列的片段；
2)对扩增产物进行测序，拼接后去除序列两端5.8S和28S基因区，获得完整的ITS2基因间隔区，通过分析SEQ ID No.1所示的序列，确定自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第23位和第212位的碱基。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第23位为C和/或第212位为G，则鉴定为藏菖蒲，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第23位为T、第212位为C或T，则待鉴定样品不是藏菖蒲。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，用于扩增含有SEQ ID No.1所示序列的片段的引物为：
正向ITS2F 5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′
反向ITS3R 5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。
6.含有权利要求5中所述引物的藏菖蒲鉴定试剂盒。
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