CN111206072A - 一种适用于pcr扩增的真菌基因组dna的提取方法 - Google Patents

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王志贤
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Abstract

本发明创造提供了一种适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，主要包括(1)破壁；(2)裂解+结合；(3)清洗；(4)洗脱等步骤。本发明创造所述的提取方法结合化学破壁法，更适用于真菌DNA提取，更加高效、快速、简便、易操作且更适用于后续PCR扩增过程。

Description

一种适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法
技术领域
本发明创造属于分子生物学技术领域，尤其是涉及一种适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法。
背景技术
近年来，由于造血干细胞移植、实体器官移植、高强度免疫抑制剂和大剂量化疗药物的广泛开展及使用，以及各种导管和尿管的置留等原因，临床上各种侵袭性真菌病感染的发病率及死亡率明显上升。引起侵袭性真菌病的主要真菌有念珠菌属、曲霉属、隐球菌属和毛霉菌属。据统计，自2000年以来，每年增加10％-20％的临床病例，这已成为医院感染的主要危险。但是，侵袭性真菌感染的诊断面临很多困难，被认为金标准的诊断手段还具有局限性，缺乏典型的临床症状；培养阳性率低，检测时间长；虽然血清学检测是临床侵袭性真菌感染的重要检测方法，但存在一定程度的假阳性及假阴性结果，并且由于其检测技术原理的限制，只能进行真菌属的鉴别，无法进行真菌种间鉴别。与以上传统方法相比，分子生物学技术不仅能实现对侵袭性真菌感染的快速诊断，并能进行菌种鉴定，同时有高特异性、高敏感性等优势，是侵袭性真菌感染诊断的新方向，具有重要的现实意义。
通俗来讲，临床分子诊断是应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的表达水平而做出诊断的技术。临床分子诊断的材料包括DNA和RNA，这也是后续进行分子诊断的前提，所以重点在于对真菌DNA的提取。真菌细胞都有较厚的细胞壁，真菌细胞壁由几丁质、葡聚糖、半乳聚糖及纤维素等构成，组成复杂，结构致密，具有良好的硬度和强度，难以用简单的方法使其充分裂解，因此，达到理想的破壁效果是真菌研究中的关键步骤之一。目前有许多常见的方法，比如：CTAB法、一步结合加热法、改进的氯化苄法、液氮研磨法、微波法、打击器振荡法等实验室方法，以及Biospin试剂盒、酵母基因组核酸提取试剂盒(天根)等常规试剂盒方法。但是以上方法都存在一定的缺陷：有毒有害成分、耗时长、不便运输保存、试剂盒成本较高，并且最主要问题在于对真菌的提取效果较差，提取效率低，无法用于后续的临床分子诊断过程。
发明内容
有鉴于此，本发明创造旨在提出一种适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，以解决上述问题。
为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：
一种适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：
S1、培养真菌，离心收集，得到菌体；
S2、向菌体中加入山梨醇buffer及破壁酶，充分混匀后孵育，离心收集得到菌体沉淀；
S3、向菌体沉淀中加入蛋白酶K及裂解液混匀，加入异丙醇及磁珠悬浮液后，再次振荡混匀；
S4、将离心管放入金属浴进行孵育，期间交替进行振荡混匀和静置；
S5、将孵育后离心管放置于磁力架静置，磁珠吸附后，吸除液体；
S6、取下离心管，加入清洗液，振荡混匀，然后将离心管放置于磁力架静置，磁珠完全吸附后，吸除液体；
S7、取下离心管，加水，振荡混匀，放入金属浴孵育，期间颠倒混匀；
S8、将离心管放置于磁力架静置，磁珠完全吸附后，将DNA溶液转移到新离心管中，即得。
进一步的，所述步骤S3中裂解液的组成为：5mM乙二胺四乙酸(EDTA)、450mM三羧甲基氨基甲烷(Tris-HCl)、450mM氯化钾(KCl)、300mM氢氧化钠(NaOH)、8mM二硫苏糖醇(DTT)、1％曲通(Triton X-100)、0.03％N-月桂酰肌氨酸钠。
进一步的，所述步骤S6中清洗液的组份为：0.3M(PH4.0)氯化钾溶液。
进一步的，所述步骤S3中蛋白酶K的加入量为20μL，裂解液的加入量为300μL。
进一步的，所述步骤S1具体包括如下步骤：1a、使用液体培养基培养真菌，用时36-72小时；1b、取菌体于离心管中，然后以12000r/min的转速离心10min，收集菌体。
进一步的，所述步骤S2具体包括如下步骤：向菌体中加入600μL山梨醇buffer，然后加入5μL浓度为10U/μL破壁酶Lyticase，破壁酶的活性为50U,充分混匀，30℃孵育30min，以1800r/min的转速离心10min，弃上清，收集沉淀。
进一步的，所述步骤S3中异丙醇的加入量为350μL，磁珠悬浮液的加入量为20μL。
进一步的，所述步骤S4具体包括如下步骤：将离心管置于金属浴中65℃孵育15min，期间颠倒混匀3回，每回4-6次；室温放置5min；振荡混匀1min，共静置9min，每3min振荡混匀1min。
进一步的，所述步骤S5中清洗液的加入量为700μL。
进一步的，所述步骤S7具体包括如下步骤：取下离心管，加入100μL水，振荡混匀；放入56℃金属浴孵育10min，期间颠倒混匀3回，每回4-6次。
优选地，在步骤S1和S2之间还包括操作如下步骤：
(2)将菌体置于离心管中，用冷去离子水清洗3遍；然后将菌体移于50mL离心管中使其悬浮于浓度为0.2mol/L、pH值为8.0的25mL磷酸缓冲液中；
(3)离心收集到离心管中，加入500μL磷酸缓冲液，再加8g氧化锆珠(直径3mm)及0.3g氧化锆珠(直径0.2mm)，配平后放入组织破壁仪，设置研磨条件为：1800r/min，研磨时间99s，间隔时间10s，6个循环，一键自动研磨；然后将菌液及氧化锆珠等分开，留菌液。
本发明提供了一种磁珠法提取真菌DNA的方法，并且结合化学破壁法，更适用于真菌DNA提取，更加高效、快速、简便、易操作且更适用于后续PCR扩增过程。利用磁珠法提取核酸的原理与硅胶膜离心柱相同，该磁珠为商业化成品磁珠，运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行过改良和表面修饰，而制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。加入的裂解液，是一种蛋白变性剂，使蛋白质变性，破坏真菌细胞结构，从而将DNA与蛋白质等杂质分离开来，磁珠可以特异的吸附DNA，通过清洗，去除DNA以外的蛋白质、RNA等杂质，再进行洗脱解离吸附在磁珠上的DNA,从而从真菌细胞中分离得到纯度及浓度较高的DNA。
相对于现有技术，本发明创造所述的适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法具有以下优势：
(1)本发明选择化学方法进行破壁，反复试验出最优的破壁酶Lyticase及蛋白酶K的组合；若为更难破壁的曲霉菌属，在此之外，增加物理方法进行破壁，反复试验出最优组织破壁仪及氧化锆珠组合，能完全将曲霉属真菌破壁。
(2)本发明将裂解与结合合并为一步，即步骤3；同时使用自行配制经过反复优化的裂解液，能更好的与破壁过程衔接，减少步骤，达到最优的破壁效果，提高得率。
(3)本发明在裂解与结合过程中使用磁珠，避免使用离心机，缩短时间，减少污染，提高效率，充分利用磁珠，磁珠对于核酸有更好的吸附作用；在破壁得到更多核酸的前提下，磁珠结合更多的核酸，更充分的提高核酸提取的浓度。
(4)常规清洗过程需要两种清洗液清洗三次，本发明采用自行配制且经过反复优化的清洗液，仅需清洗一次，减少清洗步骤，从而大大减少核酸的清洗损失率，与前面步骤结合，更充分的提高核酸提取浓度，大大提高核酸提取得率。
(5)市面上常见的成品核酸提取试剂盒、增加物理破壁及化学破壁的改良版核酸提取方法等均得不到较好的核酸提取效果，本发明在核酸提取效率及得率方面均明显优于其他，能较好的满足后续的PCR扩增，本发明大大提高了真菌DNA的提取效率，缩短了真菌DNA提取的时间，降低了真菌DNA提取的成本，对于提高真菌的菌种鉴定有重要意义。
附图说明
图1为本发明方法提取的三种不同浓度烟曲霉DNA的PCR扩增曲线对比图；
图2为本发明方法提取的三种不同浓度黄曲霉DNA的PCR扩增曲线对比图；
图3为本发明方法提取的三种不同浓度土曲霉DNA的PCR扩增曲线对比图；
图4为本发明方法提取的三种不同浓度黑曲霉DNA的PCR扩增曲线对比图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明创造。
实施例1：
1.真菌培养：
提前将试验所用的烟曲霉从超低温-80℃取出解冻，然后在无菌条件下接种到提前配置好的液体培养基中，30℃培养36-72h左右(视菌体生长情况而定)，液体培养基中菌体生长大小一致，组织形态均匀，几乎充满整个液体培养基。
2.真菌DNA模板的提取
(1)取适当菌体于离心管中，准备相同的两份，然后12000r/min，离心10min，收集菌体；
(2)破壁：将菌体置于离心管中，分别向两管菌体中加入600μL山梨醇buffer，然后加入5μL破壁酶Lyticase(10U/μL),充分混匀，30℃孵育30min，1800r/min离心10min，弃上清，收集沉淀；
(3)裂解+结合：离心收集到离心管中，分别加入20μL蛋白酶K(Proteinase K)溶液及300μL裂解液，振荡混匀；然后加入350μL异丙醇及20μL磁珠悬浮液，充分振荡混匀；
(4)将离心管置于金属浴中65℃孵育15min，期间颠倒混匀3回，每回4-6次；室温放置5min；振荡混匀1min，共静置9min，每3min振荡混匀1min；
(5)清洗：将离心管放置于磁力架静置，磁珠完全吸附后，小心吸除液体；
(6)取下离心管，加入700μL清洗液，振荡混匀；然后将离心管放置于磁力架静置，磁珠完全吸附后，小心吸除液体；
(7)洗脱：取下离心管，加入100μL水，振荡混匀；放入56℃金属浴孵育10min，期间颠倒混匀3回，每回4-6次；
(8)将离心管放置于磁力架静置，磁珠完全吸附后，分别将DNA溶液转移到新离心管中，即得。
该发明在(1)步骤之后增加如下的(a)和(b)步骤：
a、将菌体置于离心管中，用冷去离子水清洗3遍；然后将菌体移于50mL离心管中使其悬浮于浓度为0.2mol/L、pH值为8.0的25mL磷酸缓冲液中；
b、离心收集到离心管中，加入500μL磷酸缓冲液，再加8g氧化锆珠(直径3mm)及0.3g氧化锆珠(直径0.2mm)，配平后放入鼎昊源组织破壁仪，设置研磨条件为：1800r/min，研磨时间99s，间隔时间10s，6个循环，一键自动研磨；然后将菌液及氧化锆珠等分开，留菌液。
测得两管菌液的OD值如下表所示，可见本发明提取核酸浓度较高，可用于后续的PCR扩增试验。
实施例1 ng/μL 260/230 260/280
烟曲霉样本1 3472.71 1.81 2.05
烟曲霉样本2 2659.31 1.80 2.12
3.PCR扩增
用所提取的真菌DNA作为模板，提前设计好真菌的引物及探针(具体地，烟曲霉菌上游引物为5’-CGAGCGTATGGGGCTTTGT-3’；烟曲霉菌下游引物为5’-TCCCTGTTGGTTTCTTTTCCTCC-3’；烟曲霉菌探针为5’-CGCCAGCCGACACCCAACTTTATT-3’；)，PCR总反应体系25μL。反应设置阴性对照及阳性对照，阴性对照为不含该真菌属DNA的模板，阳性对照为用常用方法提取并检测过该真菌属的基因组DNA。反应条件为95℃10min预变性；然后95℃10s，60℃40s，共进行45个循环；最后冷却37℃10s，进行PCR扩增过程。
将通过本发明的提取方法提取的三种不同浓度的烟曲霉DNA进行PCR扩增，结果见图1，图1中从左至右的浓度分别为265.931ng/μL、26.5931ng/μL、2.65931ng/μL。
实施例2
本实施例选用的真菌为黄曲霉，真菌培养、真菌DNA模板的提取以及PCR扩增操作步骤与实施例1相同，不同之处在于：不包括步骤a和b，以及本实施例中PCR扩增使用的引物和探针为：黄曲霉菌上游引物为5’-CGAGCGTATGGGGCTTTGT-3’；黄曲霉菌下游引物为5’-TCCCGGTTGGTTTCTTTTCCT-3’；黄曲霉菌探针为5’-CCGGCGCTTGCCGAACGCAAATC-3’。
测得两管菌液的OD值如下表所示，可见本发明提取核酸浓度较高，可用于后续的PCR扩增试验。
实施例2 ng/μL 260/230 260/280
黄曲霉样本1 3519.18 1.70 1.99
黄曲霉样本2 2297.06 1.63 2.00
将通过本发明的提取方法提取的三种不同浓度的烟曲霉DNA进行PCR扩增，结果见图2，图2中从左至右的浓度分别为229.706ng/μL、22.9706ng/μL、2.29706ng/μL。
实施例3
本实施例选用的真菌为土曲霉，真菌培养、真菌DNA模板的提取以及PCR扩增操作步骤与实施例相同，不同之处在于：不包括步骤a和b，PCR扩增使用的引物和探针为：土曲霉菌上游引物为5’-CGAGCGTATGGGGCTTCGT-3’；土曲霉菌下游引物为5’-TCCCGGTTGGTTTCTTTTCCT-3’；土曲霉菌探针为5’-CGCCCGCCGACGCATTTATTTG-3’。
测得两管菌液的OD值如下表所示，可见本发明提取核酸浓度较高，可用于后续的PCR扩增试验。
实施例3 ng/μL 260/230 260/280
土曲霉样本1 4669.38 1.63 2.18
土曲霉样本2 3872.68 1.59 2.06
将通过本发明的提取方法提取的三种不同浓度的烟曲霉DNA进行PCR扩增，结果见图3，图3中从左至右的浓度分别为387.268ng/μL、38.7268ng/μL、3.87268ng/μL。
实施例4
本实施例选用的真菌为黑曲霉菌，真菌培养、真菌DNA模板的提取以及PCR扩增操作步骤与实施例相同，不同之处在于：不包括步骤a和b，PCR扩增使用的引物和探针为：黑曲霉菌上游引物为5’-CGAGCGTATGGGGCTTTGT-3’；黑曲霉菌下游引物为5’-TCCCGGTTGGTTTCTTTTCCT-3’；黑曲霉探针为5’-CGCCTGCCGACGTTTTCCAACCATTC-3’。
测得两管菌液的OD值如下表所示，可见本发明提取核酸浓度较高，可用于后续的PCR扩增试验。
实施例4 ng/μL 260/230 260/280
黑曲霉样本1 3680.32 1.97 2.13
黑曲霉样本2 3948.19 1.83 2.21
将通过本发明的提取方法提取的三种不同浓度的烟曲霉DNA进行PCR扩增，结果见图4，图4中从左至右的浓度分别为394.819ng/μL、39.4819ng/μL、3.94819ng/μL。
对比例1：较多菌体(0.833g)+遂真破壁仪+氧化锆珠+Roche核酸提取试剂盒
具体操作步骤如下：
(1)使用液体培养基培养真菌，用时大约36-72小时。取适当菌体于离心管中，然后12000r/min，离心10min，收集菌体；
(2)将菌体用冷去离子水清洗3遍后,移于50ml离心管中使其悬浮于浓度为0.2mol/L、pH值为8.0的25mL磷酸缓冲液中；然后取出菌体沉淀，放于吸水纸吸干表面的水分，放于分析天平精准称量所获菌体沉淀的质量，记数为0.8333g，均分17份；
(3)将17管分为三组，A组8管、B组8管、C组1管；A组均加入等量最小珠径的氧化锆珠、B管内分别加入等量的较大珠径的氧化锆珠，设置不同的处理时间，依次为3min、6min、9min、12min、15min、18min、21min、24min，分别标记为A3、A6、A9、A12、A15、A18、A21、A24；B3、B6、B9、B12、B15、B18、B21、B24；C，转速相同均为6m/s；
(4)将17管菌液分别取200ul到新的1.5ml离心管中，然后3000×g离心5min，然后加入200ul PBS缓冲液；
(5)加入2ul溶壁酶Lyticase(天根)，然后在37℃下孵育30min；
(6)加入200ul Binding Buffer(绿盖)，加入40ul蛋白酶k ProteinK(Roche)，迅速混匀而后70℃孵育10min；加入100ul异丙醇isopropanol，然后混匀；
(7)将High Pure Filter Tube管插入收集管中，将上述液体转移至收集管中，离心8000×g 1min；
(8)丢掉收集管，将High Pure Filter Tube插入新的收集管中，然后加入500ulInhibitor Removal Buffer(黑管)，离心8000×g1min；
(9)丢掉收集管，将High Pure Filter Tube插入新的收集管中，然后加入500ulWash Buffer(蓝管)，离心8000×g1min；重复(9)
(10)丢掉收集管，将High Pure Filter Tube插入新的收集管中，然后空离心8000×g 1min；
(11)丢掉收集管，将High Pure Filter Tube插入新的1.5ml离心管中，加入100ulElution Buffer，离心8000×g1min；1.5ml离心管中得到的液体即为被洗脱的DNA，测定OD值，－20℃冻存备用。
不同处理测得OD值如下表，可以看出使用A、B、C三种方法提取核酸浓度均很低，并不能用于后续的PCR扩增试验。此种方法不可行猜测所加菌体较多，破壁不充分，导致核酸提取效率过低，下一步减少菌体量，再次试验。
Figure BDA0002423403070000111
Figure BDA0002423403070000121
对比例2：较少菌体(0.1945g)+遂真破壁仪+氧化锆珠+Roche核酸提取试剂盒
具体操作步骤如下：
(1)使用液体培养基培养真菌，用时大约36-72小时。取适当菌体于离心管中，然后12000r/min，离心10min，收集菌体；
(2)将菌体用冷去离子水清洗3遍后,移于50ml离心管中使其悬浮于浓度为0.2mol/L、pH值为8.0的25mL磷酸缓冲液中；然后取出菌体沉淀，放于吸水纸吸干表面的水分，放于分析天平精准称量所获菌体沉淀的质量，记数为0.1945g，均分17份；
(3)将17管分为三组，A组8管、B组8管、C组1管；A组均加入等量最小珠径的氧化锆珠、B管内分别加入等量的较大珠径的氧化锆珠，设置不同的处理时间，依次为3min、6min、9min、12min、15min、18min、21min、24min，分别标记为A3、A6、A9、A12、A15、A18、A21、A24；B3、B6、B9、B12、B15、B18、B21、B24；C，转速相同均为6m/s；
(4)将17管菌液分别取200ul到新的1.5ml离心管中，然后3000×g离心5min，然后加入200ul PBS缓冲液；
(5)加入2ul溶壁酶Lyticase(天根)，然后在37℃下孵育30min；
(6)加入200ul Binding Buffer(绿盖)，加入40ul蛋白酶k ProteinK(Roche)，迅速混匀而后70℃孵育10min；加入100ul异丙醇isopropanol，然后混匀；
(7)将High Pure Filter Tube管插入收集管中，将上述液体转移至收集管中，离心8000×g 1min；
(8)丢掉收集管，将High Pure Filter Tube插入新的收集管中，然后加入500ulInhibitor Removal Buffer(黑管)，离心8000×g1min；
(9)丢掉收集管，将High Pure Filter Tube插入新的收集管中，然后加入500ulWash Buffer(蓝管)，离心8000×g1min；重复(9)
(10)丢掉收集管，将High Pure Filter Tube插入新的收集管中，然后空离心8000×g 1min；
(11)丢掉收集管，将High Pure Filter Tube插入新的1.5ml离心管中，加入100ulElution Buffer，离心8000×g1min；1.5ml离心管中得到的液体即为被洗脱的DNA，测定OD值，－20℃冻存备用。
不同处理测得OD值如下表，可以看出A、B、C三种方法提取核酸浓度均很低，仍不能用于后续的PCR扩增试验。此次减少菌体量，提取核酸浓度仍然较低，推测是前期的破壁力度不够，再次破壁失败，需优化方案再次试验。
Figure BDA0002423403070000131
Figure BDA0002423403070000141
对比例3：酶(Ly+Pk)+遂真破壁仪+氧化锆珠+Roche核酸提取试剂盒
具体操作步骤为：
(1)使用液体培养基培养真菌，用时大约36-72小时。取适当菌体于离心管中，然后12000r/min，离心10min，收集菌体；
(2)将菌体用冷去离子水清洗3遍后,移于50ml离心管中使其悬浮于浓度为0.2mol/L、pH值为8.0的25mL磷酸缓冲液中；然后取出菌体沉淀，放于吸水纸吸干表面的水分，放于分析天平精准称量所获菌体沉淀的质量，记数为0.15g，均分3份；
(3)向每管中分别加入溶壁酶(900U/mL)9μL，蛋白酶K(20mg/mL)40μL，在涡旋器上混匀20s，37℃水浴过夜；
(4)将消化过的菌液分别转移至相应的2.0mL硬壁管(管内含有0.5g氧化锆珠，直径为0.5mm)中，在遂真组织破碎仪器上振荡15min，转速为6m/s；
(5)将3管菌液分别取200ul到新的1.5ml离心管中，然后3000×g离心5min，然后加入200ul PBS缓冲液；
(6)加入2ul溶壁酶Lyticase(天根)，然后在37℃下孵育30min；
(7)加入200ul Binding Buffer(绿盖)，加入40ul蛋白酶k ProteinK(Roche)，迅速混匀而后70℃孵育10min；加入100ul异丙醇isopropanol，然后混匀；
(8)将High Pure Filter Tube管插入收集管中，将上述液体转移至收集管中，离心8000×g 1min；
(9)丢掉收集管，将High Pure Filter Tube插入新的收集管中，然后加入500ulInhibitor Removal Buffer(黑管)，离心8000×g1min；
(10)丢掉收集管，将High Pure Filter Tube插入新的收集管中，然后加入500ulWash Buffer(蓝管)，离心8000×g1min；重复(9)；
(11)丢掉收集管，将High Pure Filter Tube插入新的收集管中，然后空离心8000×g 1min；
(12)丢掉收集管，将High Pure Filter Tube插入新的1.5ml离心管中，加入100ulElution Buffer，离心8000×g1min；1.5ml离心管中得到的液体即为被洗脱的DNA，测定OD值，－20℃冻存备用。
测得OD值如下表，本次提取核酸浓度很低，仍不能用于后续的PCR扩增试验。此次在物理方法破壁前加上化学方法破壁，加上两种酶，但最后提取核酸浓度并无提高，推测破壁力度不够，再次破壁失败，需优化方案再次试验。
对比例3 ng/μL A260 260/230 260/280
样本1 1.589 8.0030 0.2900 1.06
样本2 0.997 17.9620 0.1900 0.87
样本3 1.368 28.3820 0.1200 0.62
对比例4酶(Ly+Pk+蜗牛)+遂真破壁仪+氧化锆珠+Roche核酸提取试剂盒
具体操作步骤如下：
(1)使用液体培养基培养真菌，用时大约36-72小时。取适当菌体于离心管中，然后12000r/min，离心10min，收集菌体；
(2)将菌体用冷去离子水清洗3遍后,移于50ml离心管中使其悬浮于浓度为0.2mol/L、pH值为8.0的25mL磷酸缓冲液中；然后取出菌体沉淀，放于吸水纸吸干表面的水分，放于分析天平精准称量所获菌体沉淀的质量，记数为0.15g，均分3份；
(3)向每管中分别加入溶壁酶(900U/mL)9μL，蛋白酶K(20mg/mL)40μL，蜗牛酶(100mg/mL)100μL，在涡旋器上混匀20s，37℃水浴过夜；
(4)将消化过的菌液分别转移至相应的2.0mL硬壁管(管内含有0.5g氧化锆珠，直径为0.5mm)中，在遂真组织破碎仪器上振荡15min，转速为6m/s。
(5)将3管菌液分别取200ul到新的1.5ml离心管中，然后3000×g离心5min，然后加入200ul PBS缓冲液；
(6)加入2ul溶壁酶Lyticase(天根)，然后在37℃下孵育30min；
(7)加入200ul Binding Buffer(绿盖)，加入40ul蛋白酶k ProteinK(Roche)，迅速混匀而后70℃孵育10min；加入100ul异丙醇isopropanol，然后混匀；
(8)将High Pure Filter Tube管插入收集管中，将上述液体转移至收集管中，离心8000×g 1min；
(9)丢掉收集管，将High Pure Filter Tube插入新的收集管中，然后加入500ulInhibitor Removal Buffer(黑管)，离心8000×g1min；
(10)丢掉收集管，将High Pure Filter Tube插入新的收集管中，然后加入500ulWash Buffer(蓝管)，离心8000×g1min；重复(9)
(11)丢掉收集管，将High Pure Filter Tube插入新的收集管中，然后空离心8000×g 1min；
(12)丢掉收集管，将High Pure Filter Tube插入新的1.5ml离心管中，加入100ulElution Buffer，离心8000×g1min；1.5ml离心管中得到的液体即为被洗脱的DNA，测定OD值，－20℃冻存备用。
测得OD值如下表，本次提取核酸浓度很低，仍不能用于后续的PCR扩增试验。此次在物理方法破壁前加上化学方法破壁，加上三种酶，但最后提取核酸浓度并无提高，推测破壁力度不够，再次破壁失败，需优化方案再次试验。
对比例4 ng/μL A260 260/230 260/280
样本1 0.452 0.0090 0.4300 1.21
样本2 0.990 0.0198 0.0900 0.55
样本3 5.128 0.1026 0.1400 0.74
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、培养真菌，离心收集，得到菌体；
S2、向菌体中加入山梨醇buffer及破壁酶，充分混匀后孵育，离心收集得到菌体沉淀；
S3、向菌体沉淀中加入蛋白酶K及裂解液混匀，加入异丙醇及磁珠悬浮液后，再次振荡混匀；
S4、将离心管放入金属浴进行孵育，期间交替进行振荡混匀和静置；
S5、将孵育后离心管放置于磁力架静置，磁珠吸附后，吸除液体；
S6、取下离心管，加入清洗液，振荡混匀，然后将离心管放置于磁力架静置，磁珠完全吸附后，吸除液体；
S7、取下离心管，加水，振荡混匀，放入金属浴孵育，期间颠倒混匀；
S8、将离心管放置于磁力架静置，磁珠完全吸附后，将DNA溶液转移到新离心管中，即得。
2.根据权利要求1所述的适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤S3中裂解液的组成为：5mM乙二胺四乙酸、450mM三羧甲基氨基甲烷、450mM氯化钾、300mM氢氧化钠、8mM二硫苏糖醇、1％曲通、0.03％N-月桂酰肌氨酸钠。
3.根据权利要求1所述的适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤S3中异丙醇的加入量为350μL，磁珠悬浮液的加入量为20μL。
4.根据权利要求1所述的适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤S3中蛋白酶K的加入量为20μL，裂解液的加入量为300μL。
5.根据权利要求1所述的适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤S6中清洗液的组份为：0.3M PH值为4.0的氯化钾溶液。
6.根据权利要求1所述的适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤S1具体包括如下步骤：1a、使用液体培养基培养真菌，用时36-72小时；1b、取菌体于离心管中，然后以12000r/min的转速离心10min，收集菌体。
7.根据权利要求1所述的适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤S2具体包括如下步骤：向菌体中加入600μL山梨醇buffer，然后加入5μL浓度为10U/μL破壁酶Lyticase，破壁酶的活性为50U,充分混匀，30℃孵育30min，以1800r/min的转速离心10min，弃上清，收集沉淀。
8.根据权利要求1所述的适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤S4具体包括如下步骤：将离心管置于金属浴中65℃孵育15min，期间颠倒混匀3回，每回4-6次；室温放置5min；振荡混匀1min，共静置9min，每3min振荡混匀1min。
9.根据权利要求1所述的适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤S7具体包括如下步骤：取下离心管，加入100μL水，振荡混匀；放入56℃金属浴孵育10min，期间颠倒混匀3回，每回4-6次。
10.根据权利要求1所述的适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述真菌为曲霉属真菌，在步骤S1和S2之间还包括如下步骤：
(1)将菌体置于离心管中，用冷去离子水清洗3遍；然后将菌体移于50mL离心管中使其悬浮于浓度为0.2mol/L、pH值为8.0的25mL磷酸缓冲液中；
(2)离心收集到离心管中，加入500μL磷酸缓冲液，再加8g氧化锆珠(直径3mm)及0.3g氧化锆珠(直径0.2mm)，配平后放入组织破壁仪，设置研磨条件为：1800r/min，研磨时间99s，间隔时间10s，6个循环，一键自动研磨；然后将菌液及氧化锆珠等分开，留菌液。
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