CN114544564A - 一种基于aie纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定试剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定试剂及其制备方法与应用。所述测定试剂包括基于AIE纳米微球的联合测定检测卡和样本处理液；所述AIE纳米微球为通过苯乙烯微球包裹AIE分子制备；所述联合测定检测卡利用AIE纳米微球修饰检测抗体作为检测标记物；所述样本处理液用于毛发、唾液及尿液样本的采集和处理。所述测定试剂采用的AIE纳米微球在高强度激发下具有更稳定、更高效的荧光，可提供一种适用于不同场景下的高灵敏、准确的毒品联合测定现场分析技术，应用于法医毒物分析、安检以及可疑人群排查等。

Description

一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定试剂及 其制备方法与应用
技术领域
本发明属于公共安全领域，具体涉及一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合 测定试剂及制备方法与应用。
背景技术
毒品犯罪已成为当今世界社会的一大严重问题。据《2020年世界毒品报告》，截止2020 年，全世界每年大概有2.68亿吸毒者，占据世界总人口的3％。当毒品摄入体内，其毒副作 用会极大地破坏人的消化、呼吸、心血管及免疫系统等，对吸毒者的身体造成直接、严重的 损害。毒品还会严重影响摄入者的心理健康，很多毒品(苯丙胺类、氯胺酮等)具有强烈的 兴奋和致幻作用，会引发偏执、焦虑、被害妄想等，极易成为一系列恶性暴力案件犯罪的导 火索。目前，通过对特定人群进行体内毒品残留监测，实现吸毒人员的及时筛查与控制已成 为一种维持社会公共秩序的手段，毒品快速检测技术作为一种操作简单、便利的快筛手段成 为技术重心。
当前，毒品快检面临的问题是毒品应用场景的复杂化和毒品检测种类复杂化。同时，当 毒品进入人体后，会通过代谢、人体循环等生命活动出现在人体各个部位，出于采样的便利 性，当前毒品普查主要取材于唾液、尿液和毛发样本。通过对样本中毒品含量进行研究和分 析，结果表明：
1)毒品及其代谢物在唾液和尿液等体液留存较多，其含量可到达μg/mL级别，留存时间 为3-7天不等；
2)毛发中的毒品来自于药物沉积，虽然含量较少，通常为ng/mg级别，但可以存留6个月甚至更长时间，反映长时间的吸毒情况。
实际应用中，相关人员往往需要根据不同的检测场景和需求，选择不同的样本类型及其 处理方法，对于多种多样的毒品检测要求，也需要采用不同的检测试剂，因此联检作为一种 可实现两种甚至三种毒品同时检测的分析手段受到欢迎。
现有毒品快检产品主要基于免疫层析技术开发。免疫层析技术是一种基于抗原-抗体特异 性结合和侧向层析技术建立的检测，通过采用特定毒品的抗体即可实现对相应毒品的分析。 目前基于该项技术的毒品快速检测产品主要包括可视化的胶体金和荧光免疫层析技术，后者 通过将免疫荧光和免疫层析技术结合，使用荧光纳米微球取代胶体金去修饰检测抗体，采用 更灵敏、可准确量化的荧光作为检测信号，克服了以胶体金标记为代表的传统免疫层析技术 上的不足，在需要量化分析的人体检材检测中更具有潜力。如专利《检测痕量毒品的试纸条、 装置以及方法》和《用于毒品检测的量子点荧光免疫层析试纸条及其制备方法》中提出利用 时间分辨荧光纳米微球和量子点纳米微球制备检测人体检材中的吗啡痕量毒品，以实现人体 检材中毒品的量化分析，以上技术分别采用市场上主流的量子点纳米微球和时间分辨荧光纳 米微球，时间分辨荧光纳米微球具有较长的斯托克斯位移和长余辉，可在信号检测中提供高 信噪比备受欢迎，但其检测往往需要结合配置有单模光纤和时间控制器实现，对于材料而言， 目前使用的时间分辨纳米微球主要采用高分子材料包裹稀土元素荧光配合物实现，纳米微球 的制备工艺和成本也较高，因此该类检测产品在使用时检测成本较高，往往在灵敏度要求高 的医学诊断中更有发挥余地。量子点和其他纳米微球材料相比虽具有鲜艳多彩的特点，但制 备复杂、粒径控制对工艺要求高，作为标记物也容易脱落，其应用比较有限。
近年来，具有独特性质的发光材料——聚集诱导发光(Aggregation-inducedemission,AIE) 材料崛起，这种材料由于其分子内运动受限导致其AIE分子从单分子态到聚集态转变时呈现 荧光由弱到强的变化，进而导致在聚集、干燥或薄膜状态下其荧光效率会出现显著增长。基 于AIE分子的纳米微球由于其独特的聚集诱导发光特性，可通过包裹更多分子具有更强的荧 光信号提高信噪比，而且在高信号的同时可以保持强光稳定性，在复杂、多样的样本环境下 仍维持稳定且较强的发光，在用于高灵敏度、多场景的检测产品开发时具有优势。AIE分子 的生物相容性更好，更容易进行表面修饰。同时，AIE荧光微球的原料来源广泛、成本较低。
目前，基于AIE纳米微球技术，开发一种灵敏、准确、可应用于毛发、唾液及尿液样本 中多项毒品联合测定的检测试剂已经成为迫切需求。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述不足，本发明目的在于提供一种基于AIE纳米微球的吗啡 (Morphine，MOP)、甲基安非他明(Methamphetamine，MET)联合测定试剂及其制备方法，该方法可制备一种高灵敏、准确、可应用于毛发、唾液及尿液样本中吗啡、甲基安非他明联合测定的检测试剂。
本发明制备的一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定试剂可以应用于尿 液、唾液及毛发样本中至少一种待测样本中吗啡、甲基安非他明的含量测定。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定试剂，所述测定试剂包括基于AIE 纳米微球的联合测定检测卡和样本处理液；所述AIE纳米微球为通过聚苯乙烯包裹，包埋AIE 分子制备而成；所述联合测定试剂可实现毛发、唾液及尿液样本中吗啡和甲基安非他明毒品 的联合测定；所述联合测定检测卡利用AIE纳米微球修饰检测抗体作为检测标记物；所述检 测标记物包含吗啡和甲基安非他明单克隆抗体用于检测不同毒品；所述样本处理液可用于毛 发、唾液及尿液样本的采集、处理。
进一步地，所述联合测定检测卡的结构包括样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和 底板，其中样本垫用于承接待测液，完成待测液的过滤；结合垫用于喷涂AIE纳米微球修饰 的吗啡抗体、AIE纳米微球修饰的甲基安非他明抗体和AIE纳米微球修饰的羊抗兔IgG，完 成检测标记物的承载和释放；硝酸纤维素膜用于分别包被吗啡、甲基安非他明的毒品完全抗 原和兔IgG；吸水纸用于吸收未反应的纳米微球和待测液。各结构以样本垫为始，按层析方 向，依次交叠固定于底板。
进一步地，所述AIE纳米微球的表面由高密度羧基或氨基修饰，粒径为50-400nm，激 发波长为365-500nm，发射波长为400-625nm。
进一步地，所述AIE纳米微球的表面由高密度羧基修饰，其粒径为100-400nm。
进一步地，所述联合测定检测卡的样本垫和结合垫的材料分别选自玻璃纤维素膜或聚酯 纤维膜中的一种，优选为玻璃纤维素膜。
进一步地，所述联合测定检测卡的底板的材料选自聚氯乙烯(Polyvinylchloride，PVC) 材料。
进一步地，所述联合测定检测卡的硝酸纤维素膜从结合垫端至吸水纸一端，依次是检测 线MET、检测线MOP、质控线，其中检测线MOP、检测线MET、质控线的间隔是3-10mm。
进一步地，所述兔IgG和羊抗兔IgG为质控蛋白。
进一步地，所述联合测定检测卡的质控蛋白还可以为一对抗体，或抗原与抗体。
进一步地，所述联合测定检测卡的毒品完全抗原为毒品分子和载体蛋白的偶联复合物， 其中载体蛋白可以选择为牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人 血清白蛋白(HSA)、兔血清白蛋白(RSA)中的一种或多种。
进一步地，所述联合测定检测卡的毒品完全抗原为毒品分子和载体蛋白的偶联复合物， 其中载体蛋白选自牛血清白蛋白(BSA)。
进一步地，所述样本处理液的成分包括缓冲液、表面活性剂、防腐剂、盐，其中表面活 性剂的作用是清洗样本表面油污，使样本成分充分释放和溶解；防腐剂的作用是控制样本处 理液中微生物的生长；盐的作用是维持溶液的离子平衡，盐还用于减少样本中蛋白的非特异 性结合。
进一步地，所述样本处理液的缓冲液为磷酸缓冲液(Phosphate Buffer，PB)、三氢甲基 氨基甲烷盐酸盐(TRIS hydrochloride，Tris-HCl)中的一种。
进一步地，所述样本处理液的表面活性剂为聚二乙醇辛基苯基醚(TritonX-100)、聚二 乙醇(PEG4000)、聚乙烯吡咯烷酮-K30(PVP-K30)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA二钠)、 吐温-20(Tween-20)、Tetronic1307(简称S9)、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、Silwet L7600(简称S16)中的一种或多种。
进一步地，所述样本处理液的防腐剂为Proclin-300。
进一步地，所述样本处理液的盐为氯化镁、氯化钙、氯化钠、磷酸钙等中的一种或多种， 优选为氯化钠。
进一步地，所述样本处理液的pH为7-8，优选为7.4-8.0。
进一步地，所述样本处理液的缓冲液的浓度为20-100mM，优选为20-50mM；
进一步地，所述样本处理液的盐的质量浓度为0.05％-10％，优选为0.05％-5％；
进一步地，所述样本处理液的防腐剂的质量浓度为0.03-3％，优选为0.03-1％；
进一步地，所述样本处理液的表面活性剂——TritonX-100的质量浓度为0.03-3％，优选 为0.03-1％；
进一步地，所述测定试剂不仅可以应用于吗啡、甲基安非他明的检测，还可通过更换所 用抗体和毒品完全抗原，实现苯丙胺类兴奋剂、苯丙胺类衍生物(如MDMA等)、可卡因、氯胺酮、去氧氯胺酮等毒品的检测。
一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定试剂的制备方法，所述测定试剂 中检测卡的制备方法包括以下步骤：
S1、抗体修饰：取固含量为1-4％AIE纳米微球，使用偶联缓冲液进行离心后重悬。加入 EDC和NHS，加入AIE纳米微球与加入EDC、NHS的质量比分别为1:(1.5-6)和1:(3-18)，室温下孵育0.5-1h对微球进行活化。活化完毕，加入抗体进行偶联，加入AIE纳米微球与加入抗体的质量比为100:(1-15)，混匀室温反应2-4h进行偶联后离心，加入封闭缓冲液进行重悬，封闭缓冲液含质量浓度0.05％-2％的BSA，室温封闭1-2h，离心，使用微球保存液重悬并保存，微球保存液含质量浓度0.2-1％BSA和质量浓度0.1-5％海藻糖。
S2、包被膜制备：用包被缓冲液分别对两种毒品完全抗原、兔IgG进行稀释并划线，其 中包被缓冲液含质量浓度0.2-1％BSA、质量浓度0.5-5％海藻糖，两条检测线浓度分别为0.5-2.0mg/mL，划线用量为0.5-1.0μL/cm，质控线的划线浓度为0.5-1.0mg/mL，划线用量为 0.5-1.0μL/cm，完成后将包被膜置于湿度≤35％，温度为30℃-50℃的烘箱中干燥16-24h，干 燥后密封室温储存备用；
S3、结合垫制备：用结合垫处理液对结合垫浸泡2-4h，其中结合垫处理液含质量浓度 0.1％-5％的海藻糖、质量浓度0.2％-1％的牛血清白蛋白，30-50℃烘干16-24h备用。对纳米 微球修饰的检测抗体和羊抗兔IgG进行稀释，其中检测抗体保存液的体积浓度分别为5-20％， 羊抗兔IgG的体积浓度为3％-10％，混匀，以3-7μL/cm进行喷膜，30-50℃干燥16-24h备用；
S4、样本垫制备：用样本垫处理液对样本垫浸泡2-4h，其中样本垫处理液含质量浓度为 0.1％-5％的海藻糖、质量浓度0.2％-1％的BSA、质量浓度0.01％-0.1％Tween-20、质量浓度 0.5％-20％的NaCl，30-50℃烘干16-24h备用；
S5、检测卡组装：将制备的样本垫、结合垫、包被膜和吸水纸搭接粘贴于底板的相应位 置上，并切成4mm宽的试纸条，装入检测卡。置于室温干燥环境下保存。
一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定试剂可以应用于尿液、唾液以及 毛发中至少一种待测样本中吗啡、甲基安非他明是否存在及其含量的测定。
一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定试剂可以应用于尿液、唾液以及 毛发中至少一种待测样本中吗啡、甲基安非他明的含量测定。
本技术方案提供的一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定试剂在用于唾 液样本定性分析时，可通过将样本处理液和样本进行混合制备成待测液；在用于尿液样本定 性分析时，通常直接以待测尿液样本作为待测液；在用于毛发样本定量分析时，则需要将样 本和样本处理液进行混合并研磨处理1-5min，提取其上清液作为待测液。检测时，可通过将 待测液滴在所述试纸条上，将检测卡送入荧光分析仪进行分析，通过将检测线和质控线的信 号比值，与预先输入的标准曲线或阈值进行比较，实现定量或定性分析。
本技术方案可通过改变可识别其他毒品的检测抗体和对应的抗原，实现其他至少两种毒 品的检测。
本发明有益效果在于：
(1)使用便捷，可适用于尿液、唾液及毛发样本中毒品的分析，针对不同种类样本和应 用场景仅需进行简单操作，无需更换试剂和检测卡。
(2)灵敏度和准确度高，在尿液、唾液及毛发多种样本类型中皆可实现吗啡和甲基安非 他明含量的准确分析。
(3)检测迅速，10-15min即可完成检测。
附图说明
图1为本发明所述检测卡的结构示意图。
图2为尿液、唾液中检测卡样品结果判定示意图。
图3为实施例15毛发中吗啡阳性样本的检测结果一致性分析图。
图4为实施例15毛发中甲基安非他明阳性样本的检测结果一致性分析图。
图5为实施例16唾液中甲基安非他明阳性样本的检测结果一致性分析图。
图6为实施例16唾液中吗啡阳性样本的检测结果一致性分析图。
图7为实施例17尿液中吗啡阳性样本的检测结果一致性分析图。
图8为实施例17尿液中甲基安非他明阳性样本的检测结果一致性分析图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和特点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术 方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全 部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所 获得所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
图1为本发明所述检测卡的结构示意图(1是项目信息区，2是质控线，3是吗啡MOP检测线，4是甲基安非他明MET检测线，5是加样孔)。
图2为尿液、唾液中检测卡样品结果判定示意图。
实施例1
一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定检测卡的制备
(1)AIE纳米微球修饰抗体的制备
取100mg，粒径为100nm的羧基修饰的AIE纳米微球溶液(固含量为1％，激发波长为400nm，发射波长为525nm)15000rpm离心10min，1mL偶联缓冲液重悬。分别加入EDC 和NHS，加入AIE纳米微球与EDC、NHS的质量比分别为1:1.5和1:3，涡旋震荡后室温孵 育30min，15000rpm离心10min。加入偶联缓冲液重悬微球，加入吗啡抗体，加入AIE纳 米微球与加入吗啡抗体的质量比为100:6，混匀后室温反应2h，12000rpm离心10min去除 上清，加入1mL封闭缓冲液(含质量浓度0.05％的BSA)，混匀后室温反应1h，用封闭缓 冲液离心洗涤3次后，用pH＝7.4，0.02M的PBS(含质量浓度0.2％的BSA和0.1％的海藻糖) 重悬沉淀，将制备的微球标记抗体溶液于2℃-8℃备用。
AIE纳米微球修饰甲基安非他明抗体的方案同上，其中加入甲基安非他明抗体，加入AIE 纳米微球与加入甲基安非他明抗体的质量比为100:1；
AIE纳米微球修饰羊抗兔IgG的方案同上，其中加入羊抗兔IgG，加入AIE纳米微球与 加入羊抗兔IgG的质量比为100:12；
(2)包被膜制备
用pH＝7.4，0.02M的PBS包被缓冲液(含质量浓度0.2％BSA、质量浓度0.5％海藻糖) 将吗啡完全抗原、甲基安非他明完全抗原、兔IgG分别稀释后进行划线，检测线MOP、检测 线MET分别为吗啡完全抗原和甲基安非他明完全抗原，划线浓度均为0.5mg/mL，划线用量 均为0.5μL/cm；质控线为兔IgG，划线浓度为0.5mg/mL，划线用量为0.5μL/cm。完成后将包被膜置于湿度≤35％，温度为50℃的烘箱中干燥16h，干燥后密封室温(10℃-30℃)储存备用；
(3)结合垫制备
玻璃纤维素膜用pH＝7.4，0.02M的Tris-HCl(含质量浓度0.1％的海藻糖、质量浓度0.2％ 的牛血清白蛋白、质量浓度0.02％的Tween-20)浸泡2h，50℃烘干16h备用。将AIE纳米微 球修饰的吗啡抗体、AIE纳米微球修饰的甲基安非他明抗体和AIE纳米微球修饰的羊抗兔IgG 按照稀释浓度进行稀释，稀释后体积浓度分别为5％、8％、3％。混匀后用划膜喷金仪进行喷 膜，参数为4μL/cm，完成后置于湿度≤35％，温度为50℃的烘箱中干燥16h，干燥后密封室 温(10℃-30℃)储存备用；
(4)样本垫制备
将聚酯纤维膜用pH＝7.4，0.02M的Tris-HCl(含0.1％的海藻糖、0.2％的牛血清白蛋白、 0.02％的Tween-20、5％的NaCl)浸泡2h，37℃烘干24h备用；
(5)检测卡组装
将干燥好的包被膜、结合垫、样本垫和吸水纸粘贴于底板的相应位置上，并压紧。组装 完成后用切条机切成4mm宽的试纸条，把试纸条按样本垫对准加样孔方向固定在装入检测 卡中。将检测卡装入干燥剂的铝箔袋中并封口，置于室温(10℃-30℃)环境下保存备用。
实施例2
一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定检测卡的制备
(1)AIE纳米微球标记抗体的制备
取100mg粒径为400nm羧基修饰的AIE纳米微球溶液(固含量为1％，激发波长为390nm，发射波长为525nm)15000rpm离心10min，1mL偶联缓冲液重悬。加入EDC和NHS， 加入AIE纳米微球与加入EDC、NHS的质量比分别为1:3和1:9，涡旋震荡后室温孵育30min， 15000rpm离心10min。加入偶联缓冲液重悬微球，加入吗啡抗体，加入AIE纳米微球与加 入吗啡抗体的质量比为100:15，混匀后室温反应4h，12000rpm离心10min去除上清，加入 1mL封闭缓冲液(含质量浓度1％的BSA)，混匀后室温反应2h，用封闭缓冲液离心洗涤3 次后，用0.02M pH＝7.4的PBS(含1％BSA和5％海藻糖)重悬沉淀，将制备的微球修饰抗体 溶液于2℃-8℃备用。
AIE纳米微球修饰甲基安非他明抗体的方案同上，其中加入甲基安非他明抗体，加入AIE 纳米微球与加入甲基安非他明抗体的质量比为100:15；
AIE纳米微球修饰羊抗兔IgG的方案同上，其中加入羊抗兔IgG，加入AIE纳米微球与 加入羊抗兔IgG的质量比为100:6；
(2)包被膜制备
用pH＝7.4，0.02M PBS包被缓冲液(含质量浓度1％BSA，质量浓度5％海藻糖)将吗啡 完全抗原、甲基安非他明完全抗原、兔IgG分别稀释后进行划线，检测线MOP、检测线MET分别为吗啡完全抗原和甲基安非他明完全抗原，划线浓度均为2.0mg/mL，划线用量均为1.0μL/cm；质控线为兔IgG，划线浓度为0.8mg/mL，划线用量为1.0μL/cm。完成后将包被膜置 于湿度≤35％，温度为37℃的烘箱中干燥20h，干燥后密封室温(10℃-30℃)储存备用；
(3)结合垫制备
将玻璃纤维素膜用pH＝7.4的0.05M Tris-HCl(含质量浓度5％的海藻糖、质量浓度1％牛 血清白蛋白、质量浓度1％Tween-20)浸泡4h，37℃烘干24h备用。将AIE纳米微球修饰的 吗啡抗体、AIE纳米微球修饰的甲基安非他明抗体和AIE纳米微球修饰的羊抗兔IgG按照稀 释浓度进行稀释，AIE纳米微球修饰的吗啡抗体和AIE纳米微球修饰的甲基安非他明抗体稀 释体积浓度均为20％，AIE纳米微球修饰的羊抗兔IgG稀释体积浓度为10％。混匀后用划膜 喷金仪进行喷膜，参数为3μL/cm，完成后置于湿度≤35％，温度为37℃的烘箱中干燥24h， 干燥后密封室温(10℃-30℃)储存备用；
(4)样本垫制备
将玻璃纤维素膜用pH＝7.4，0.02M的Tris-HCl(含质量浓度5％的海藻糖、质量浓度1％ 的牛血清白蛋白、质量浓度0.1％的Tween-20、质量浓度10％的NaCl)浸泡2h，30℃烘干24h 备用；
(5)检测卡组装
同实施例1中的步骤(5)。
实施例3
一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定检测卡的制备
(1)AIE纳米微球标记抗体的制备
取100mg粒径为200nm羧基修饰的AIE纳米微球溶液(固含量为1％，激发波长为365nm，发射波长为400nm)15000rpm离心10min，1mL偶联缓冲液重悬。加入EDC和NHS， 加入AIE纳米微球与加入EDC、NHS的质量比分别为1:3和1:9，涡旋震荡后室温孵育40min， 15000rpm离心10min。加入偶联缓冲液重悬微球，加入吗啡抗体，加入AIE纳米微球与加 入吗啡抗体的质量比为100:6，混匀后室温反应2h，12000rpm离心10min去除上清，加入 1mL封闭缓冲液(含质量浓度2％的BSA)，混匀后室温反应1h，用封闭缓冲液离心洗涤3 次后，用0.02M pH＝7.4的PBS(含0.5％BSA和2％海藻糖)重悬沉淀，将制备的微球标记抗体 溶液于2℃-8℃备用。
AIE纳米微球修饰甲基安非他明抗体的方案同上，其中加入甲基安非他明抗体，加入AIE 纳米微球与加入甲基安非他明抗体的质量比为100:6；
AIE纳米微球修饰羊抗兔IgG的方案同上，其中加入羊抗兔IgG，加入AIE纳米微球与 加入羊抗兔IgG的质量比为100:1；
(2)包被膜制备
用pH＝7.4，0.02M PBS包被缓冲液(含0.5％BSA，2％海藻糖)将吗啡完全抗原、甲基 安非他明完全抗原、兔IgG分别稀释后进行划线，检测线MOP为吗啡完全抗原，划线浓度为2.0mg/mL，划线用量为1.0μL/cm；检测线MET为甲基安非他明完全抗原，划线浓度为1.5mg/mL，划线用量为1.0μL/cm；质控线为兔IgG，划线浓度为0.8mg/mL，划线用量为0.8 μL/cm。完成后将包被膜置于湿度≤35％，温度为30℃的烘箱中干燥24h，干燥后密封室温(10℃-30℃)储存备用；
(3)结合垫制备
将聚酯纤维膜用pH7.4的0.02M Tris-HCl(含质量浓度2％的海藻糖、质量浓度0.5％牛血 清白蛋白、质量浓度0.05％Tween-20)浸泡2h，30℃烘干24h备用。将AIE纳米微球修饰的 吗啡抗体、AIE纳米微球修饰的甲基安非他明抗体和AIE纳米微球修饰的羊抗兔IgG按照稀 释浓度进行稀释，AIE纳米微球修饰的吗啡抗体稀释体积浓度为10％，AIE纳米微球修饰的 甲基安非他明抗体稀释体积浓度为10％，AIE纳米微球修饰的羊抗兔IgG稀释体积浓度为5％。 混匀后用划膜喷金仪进行喷膜，参数为7μL/cm，完成后置于湿度≤35％，温度为37℃的烘箱 中干燥20h，干燥后密封室温(10℃-30℃)储存备用；
(4)样本垫制备
将聚酯纤维膜用pH＝7.4，0.02M的Tris-HCl(含质量浓度2％的海藻糖、质量浓度0.5％的 牛血清白蛋白、质量浓度0.05％的Tween-20、质量浓度20％的NaCl)浸泡1h,50℃烘干16h 备用；
(5)检测卡组装
同实施例1中的步骤(5)。
实施例4
一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定检测卡的制备
(1)AIE纳米微球标记抗体的制备
取100mg粒径为50nm羧基修饰的AIE纳米微球溶液(固含量为4％，激发波长为425nm，发射波长为625nm)15000rpm离心10min，1mL偶联缓冲液重悬。加入EDC和NHS， 加入AIE纳米微球与加入EDC、NHS的质量比分别为1:6和1:18，涡旋震荡后室温孵育60min，15000rpm离心10min。加入偶联缓冲液重悬微球，加入吗啡抗体，加入AIE纳米微球与加 入吗啡抗体的质量比为100:1,混匀后室温反应3h，12000rpm离心10min去除上清，加入1mL 封闭缓冲液(含质量浓度1％的BSA)，混匀后室温反应1.5h，用封闭缓冲液离心洗涤3次 后，用pH＝7.4的0.02M PBS(含质量浓度0.2％BSA和质量浓度0.1％海藻糖)重悬沉淀，将制 备的微球标记抗体溶液于2℃-8℃备用。
AIE纳米微球修饰甲基安非他明抗体的方案同上，其中加入甲基安非他明抗体，加入AIE 纳米微球与加入甲基安非他明抗体的质量比为100:12；
AIE纳米微球修饰羊抗兔IgG的方案同上，其中加入羊抗兔IgG，加入AIE纳米微球与 加入羊抗兔IgG的质量比为100:12；
(2)包被膜制备
用pH＝7.4的0.02M PBS包被缓冲液(含质量浓度0.2％BSA，质量浓度0.5％海藻糖)将 吗啡完全抗原、甲基安非他明完全抗原、兔IgG分别稀释后进行划线，检测线MOP为吗啡 完全抗原，划线浓度为0.5mg/mL，划线用量为0.5μL/cm；检测线MET为甲基安非他明完全抗原，划线浓度为2.0mg/mL，划线用量为1.0μL/cm；质控线为兔IgG，划线浓度为0.5mg/mL， 划线用量为0.5μL/cm。完成后将包被膜置于湿度≤35％，温度为37℃的烘箱中干燥16h，干 燥后密封室温(10℃-30℃)储存备用；
(3)结合垫制备
将玻璃纤维膜用pH＝7.4的0.02M Tris-HCl(含质量浓度0.1％的海藻糖、质量浓度0.2％牛 血清白蛋白、质量浓度0.02％Tween-20)浸泡2h，37℃烘干16h备用。将AIE纳米微球修饰 的吗啡抗体、AIE纳米微球修饰的甲基安非他明抗体和AIE纳米微球修饰的羊抗兔IgG按照 稀释浓度进行稀释，AIE纳米微球修饰的吗啡抗体、AIE纳米微球修饰的甲基安非他明抗体 稀释体积浓度分别为5％、6％，AIE纳米微球修饰的羊抗兔IgG稀释体积浓度为3％。混匀后 用划膜喷金仪进行喷膜，参数为4μL/cm，完成后置于湿度≤35％，温度为37℃的烘箱中干燥 16h，干燥后密封室温(10℃-30℃)储存备用；
(4)样本垫制备
同实施例3，浸泡4h，40℃烘干20h备用；
(5)检测卡组装
同实施例1中的步骤(5)。
实施例5
一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定检测卡的制备
(1)AIE纳米微球标记抗体的制备
取100mg粒径为200nm羧基修饰的AIE纳米微球溶液(固含量为3％，激发波长为500nm，发射波长为625nm)15000rpm离心10min，1mL偶联缓冲液重悬。加入EDC和NHS， 加入AIE纳米微球与加入EDC、NHS的质量比分别为1:1.5和1:3，涡旋震荡后室温孵育30min，15000rpm离心10min。加入偶联缓冲液重悬微球，加入吗啡抗体，加入AIE纳米微球与加 入吗啡抗体的质量比为100:12，混匀后室温反应2h，12000rpm离心10min去除上清，加入 1mL封闭缓冲液(含质量浓度0.05％的BSA)，混匀后室温反应1h，用封闭缓冲液离心洗 涤3次后，用pH＝7.4的0.02M PBS(含质量浓度0.5％BSA和质量浓度2％海藻糖)重悬沉淀， 将制备的微球标记抗体溶液于2℃-8℃备用。
AIE纳米微球修饰甲基安非他明抗体的方案同上，其中加入甲基安非他明抗体，加入AIE 纳米微球与加入甲基安非他明抗体的质量比为100:6；
AIE纳米微球修饰羊抗兔IgG的方案同上，其中加入羊抗兔IgG，加入AIE纳米微球与 加入羊抗兔IgG的质量比为100:15；
(2)包被膜制备
用pH＝7.4，0.02M的PBS包被缓冲液(含质量浓度0.5％BSA，质量浓度2％海藻糖)将 吗啡完全抗原、甲基安非他明完全抗原、兔IgG分别稀释后进行划线，检测线MOP、检测线MET分别为吗啡完全抗原、甲基安非他明完全抗原，划线浓度均为1.0mg/mL，划线用量均 为0.8μL/cm；质控线为兔IgG，划线浓度为1.0mg/mL，划线用量为1.0μL/cm。完成后将包 被膜置于湿度≤35％，温度为37℃的烘箱中干燥24h，干燥后密封室温(10℃-30℃)储存备 用；
(3)结合垫制备
将玻璃纤维膜用pH＝7.4的0.02M Tris-HCl(含质量浓度2％海藻糖、质量浓度0.5％牛血清 白蛋白、质量浓度0.05％Tween-20)浸泡3h，37℃烘干20h备用。将AIE纳米微球修饰的吗 啡抗体、AIE纳米微球修饰的甲基安非他明抗体和AIE纳米微球修饰的羊抗兔IgG按照稀释 浓度进行稀释，AIE纳米微球修饰的吗啡抗体和AIE纳米微球修饰的甲基安非他明抗体稀释 体积浓度均为10％，AIE纳米微球修饰的羊抗兔IgG稀释体积浓度为5％。混匀后用划膜喷金 仪进行喷膜，参数为3μL/cm，完成后置于湿度≤35％，温度为30℃的烘箱中干燥24h，干燥 后密封室温(10℃-30℃)储存备用；
(4)样本垫制备
将聚酯纤维膜用pH＝7.4的0.02M Tris-HCl(含2％的海藻糖、0.5％牛血清白蛋白、0.05％ Tween-20、10％NaCl)浸泡2h，37℃烘干24h备用；
(5)检测卡组装
同实施例1中的步骤(5)。
实施例6
一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定检测卡的制备
同实施例5，步骤(1)中所采用微球的激发波长为365nm，发射波长为565nm。
实施例7
一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定检测卡的制备
同实施例5，步骤(1)中所采用微球的激发波长为500nm，发射波长为625nm。
实施例8
毛发中吗啡、甲基安非他明联合测定检测卡的标准曲线绘制
(1)分别取相同体积、定值均为1μg/mL的甲基安非他明和吗啡标准品充分混合，使用样本处理液(20mM的PB缓冲液、质量浓度0.85％的NaCl、质量浓度0.05％的Proclin300、质量浓度0.05％Tritonx-100，缓冲体系pH为7.4)稀释成浓度分别为500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、20ng/mL、5ng/mL、1ng/mL的标准浓度溶液；
(2)取约10mg重量的毛发(发根端长度约3cm)，用剪刀剪成约1～2mm小段，加 入500uL(1)中配置的标准浓度溶液，将以上混合物充分混匀、充分物理粉碎并裂解5min， 静置取其上清液作为待测样本；
(3)开启干式免疫荧光分析仪；
(4)取85μL待测样本滴加在实施例1-5制备的检测卡加样孔中，将检测卡插入干式免 疫荧光分析仪中，等待10min，点击快速测试；
(5)对浓度和信号值绘制标准曲线，导入ID卡。
实施例9
唾液中吗啡、甲基安非他明联合测定检测卡的标准曲线绘制
(1)取相同体积、定值均为1μg/mL的甲基安非他明、吗啡标准品充分混合，使用人工唾液稀释成浓度分别为2000ng/mL、1000ng/mL、200ng/mL、50ng/mL、10ng/mL的标准 浓度溶液；使用样本处理液(20mM的PB缓冲液、质量浓度0.85％的NaCl、质量浓度0.05％ 的Proclin300、质量浓度0.05％Tritonx-100，缓冲体系pH＝7.4)按取体积比为1:4(标准浓度溶液：样本处理液)稀释成待测样本备用；
(2)开启干式免疫荧光分析仪；
(3)取85μL待测样本滴加在实施例1-5制备的检测卡加样孔中，将检测卡插入干式免 疫荧光分析仪中，等待10min，点击快速测试；
(4)对浓度和信号值进行绘制、校准，将标曲及阈值导入ID卡。
实施例10
尿液中吗啡、甲基安非他明联合测定检测卡的标准曲线绘制
(1)取相同体积、定值均为1μg/mL的甲基安非他明、吗啡标准品充分混合，用人工尿液稀释成浓度分别为5400ng/mL、1800ng/mL、900ng/mL、300ng/mL、150ng/mL、50ng/mL 的标准浓度溶液；加入样本处理液(20mM的PB缓冲液、质量浓度0.85％的NaCl、质量浓 度0.05％的Proclin300、质量浓度0.05％Tritonx-100，缓冲体系pH＝7.4)按体积比为1:9(标准浓度溶液：样本处理液)稀释成待测样本备用；
(2)开启干式免疫荧光分析仪；
(3)取85μL如(1)中的稀释溶液滴加在实施例1-5制备的检测卡加样孔中，将检测卡插入干式免疫荧光分析仪中，等待10min，点击快速测试；
(4)对浓度和信号值进行绘制、校准，将标曲及阈值导入ID卡。
实施例11
毛发中吗啡、甲基安非他明联合测定检测卡的标准曲线绘制
同实施例8，其样本处理液(20mM的Tris-HCl缓冲液、质量浓度0.05％的NaCl、质量浓度0.05％PEG4000、质量浓度0.05％的CaCl2、质量浓度0.05％的Proclin300、质量浓度0.05％Tritonx-100，缓冲体系pH＝8.0)。
实施例12
毛发中吗啡、甲基安非他明联合测定检测卡的标准曲线绘制
同实施例8，其样本处理液(20mM的Tris-HCl缓冲液、质量浓度2％的NaCl、质量 浓度0.05％的CaCl2、质量浓度0.05％的Proclin300、质量浓度0.05％Tween-20、质量浓度0.05％ Tritonx-100，缓冲体系pH＝8.0)。
实施例13
唾液中吗啡、甲基安非他明联合测定检测卡的标准曲线绘制
同实施例9，其样本处理液(20mM的PB缓冲液、质量浓度5％的NaCl、质量浓度0.05％的Proclin300、质量浓度0.05％EDTA二钠、质量浓度0.05％Tritonx-100，缓冲体系pH＝7.0)。
实施例14
尿液中吗啡、甲基安非他明联合测定检测卡的标准曲线绘制
同实施例10，其样本处理液(20mM的PB缓冲液、质量浓度0.85％的NaCl、质量浓度0.05％PVP-K30、质量浓度0.05％S9、质量浓度0.05％CTAB、质量浓度0.05％S16、质量浓度0.05％的Proclin300，缓冲体系pH＝7.4)
实施例15
毛发中吗啡、甲基安非他明及其代谢物含量测试
实现毛发中吗啡、甲基安非他明含量的快速测定，其步骤如下：
(1)取约10mg重量的毛发(发根端长度约3cm)，用剪刀剪成约1～2mm小段，加入500uL实施例8-13中所制备的样本处理液，充分混匀并裂解5min，静置取其上清液作为待测样本；
(2)开启干式免疫荧光分析仪，插入如实施例8中绘制的相关检测项目的ID卡，导入 标准曲线；
(3)取85μL待测样本滴加在实施例1-5所制备的检测卡加样孔中，将检测卡插入干式 免疫荧光分析仪中，等待10min，点击快速测试；
(4)显示测试结果。
20例吗啡阳性毛发样本的色谱法和检测卡测试结果如下：
Figure BDA0003362781320000141
Figure BDA0003362781320000151
20例甲基安非他明阳性毛发样本的色谱法和检测卡测试结果如下：
Figure BDA0003362781320000152
Figure BDA0003362781320000161
图3为实施例15毛发中吗啡阳性样本的检测结果一致性分析图。
图4为实施例15毛发中甲基安非他明阳性样本的检测结果一致性分析图。
结果表明，将20例吗啡阳性毛发样本的色谱法测试结果和测试结果进行对比，在0-1 ng/mg的低值区，结果相对偏差≦10％，在1-10ng/mg的中值区，相对偏差≦10％，在10-20 ng/mg的高值区，相对偏差≦10％。
将20例甲基安非他明阳性毛发样本的色谱法测试结果和测试结果进行对比，在0-1ng/mg 的低值区，结果相对偏差≦15％，在1-10ng/mg的中值区，相对偏差≦15％，在10-30ng/mg 的高值区，相对偏差≦10％。
综合评价两种方法的检测结果一致性较好，说明本发明提供的一种基于AIE纳米微球的 吗啡、甲基安非他明联合测定试剂检测偏差小，结果准确。
实施例16
唾液中甲基安非他明、吗啡及其代谢物含量测试
(1)取约100uL的唾液，加入400uL实施例9中所制备的样本处理液，充分混匀；
(2)开启干式免疫荧光分析仪，插入如实施例9中绘制的相关检测项目的ID卡，导入 标准曲线及判定阈值；
(3)取85μL待测样本滴加在实施例1-5所制备的检测卡加样孔中，将检测卡插入干式 免疫荧光分析仪中，等待10min，点击快速测试；
(4)显示测试结果。
20例甲基安非他明阳性唾液样本的色谱法和检测卡测试结果如下：
Figure BDA0003362781320000171
20例吗啡阳性唾液样本的色谱法和检测卡测试结果如下：
Figure BDA0003362781320000172
Figure BDA0003362781320000181
图5为实施例16唾液中甲基安非他明样本的检测结果一致性分析图。
图6为实施例16唾液中吗啡样本的检测结果一致性分析图。
结果表明，将20例吗啡阳性唾液样本的色谱法测试结果和测试结果进行对比，在10-500 ng/mL的线性范围内，相对偏差≦15％。
将20例甲基安非他明阳性唾液样本的色谱法测试结果和测试结果进行对比，在≦50ng/mL的范围内，结果相对偏差≦30％。在50-500ng/mL的高值区，相对偏差≦15％。
综合评价两种方法的检测结果一致性较好，说明本发明提供的一种唾液中吗啡、甲基安 非他明联合测定试剂及其制备方法偏差小，结果准确。
实施例17
尿液中甲基安非他明、吗啡及其代谢物含量测试
(1)开启干式免疫荧光分析仪，插入如实施例10中绘制的相关检测项目的ID卡，导入 实施例10标准曲线；
(2)取85μL待测尿液样本直接滴加在实施例1-5所制备的检测卡加样孔中，将检测卡 插入干式免疫荧光分析仪中，等待10min，点击快速测试；
(3)显示测试结果。
20例吗啡阳性尿液样本的色谱法和检测卡测试结果如下：
Figure BDA0003362781320000191
20例甲基安非他明阳性尿液样本的色谱法和检测卡测试结果如下：
Figure BDA0003362781320000192
Figure BDA0003362781320000201
图7为实施例17尿液中吗啡样本的检测结果一致性分析图。
图8为实施例17尿液中甲基安非他明样本的检测结果一致性分析图。
结果表明，将20例吗啡阳性尿液样本的色谱法测试结果和测试结果进行对比，除6号样 本，在50-300ng/mL之间的低浓度区，相对偏差≦30％，在300-1500ng/mL的线性范围内， 相对偏差≦10％。
将20例甲基安非他明阳性尿液样本的色谱法测试结果和测试结果进行对比，在≦1000 ng/mL的范围内，结果相对偏差≦20％。在1000-3000ng/mL的高值区，相对偏差≦10％。
综合评价两种方法的检测结果一致性较好，说明本发明提供的一种尿液中吗啡、甲基安 非他明联合测定试剂及其制备方法偏差小，结果准确。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参 照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以 对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或全部技术特征进行等同替换； 而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定试剂，其特征在于，所述测定试剂包括基于AIE纳米微球的联合测定检测卡和样本处理液；所述AIE纳米微球为通过聚苯乙烯包裹，包埋AIE分子制备而成；所述联合测定试剂可实现毛发、唾液及尿液样本中吗啡和甲基安非他明毒品的联合测定；所述联合测定检测卡利用AIE纳米微球修饰检测抗体作为检测标记物；所述检测标记物包含吗啡和甲基安非他明单克隆抗体用于检测不同毒品；所述样本处理液可用于毛发、唾液及尿液样本的采集、处理。
2.根据权利要求1所述一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定试剂，其特征在于，所述联合测定检测卡的结构包括样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和底板，其中样本垫用于承接待测液，完成待测液的过滤；结合垫用于喷涂AIE纳米微球修饰的不同毒品抗体和AIE纳米微球修饰的羊抗兔IgG，完成检测标记物的承载和释放；硝酸纤维素膜用于分别包被不同的毒品完全抗原和兔IgG；吸水纸用于吸收未反应的纳米微球和待测液。各结构以样本垫为始，按层析方向，依次交叠固定于底板。
3.根据权利要求1所述一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定试剂，其特征在于，所述AIE纳米微球的表面由高密度羧基或氨基修饰，粒径为50-400nm，激发波长为365-500nm，发射波长为400-625nm。
4.根据权利要求1所述一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定试剂，其特征在于，所述联合测定检测卡的样本垫和结合垫的材料均选自玻璃纤维素膜或聚酯纤维膜中的一种；所述联合测定检测卡的底板的材料选自聚氯乙烯材料；所述联合测定检测卡的硝酸纤维素膜从结合垫端至吸水纸一端，依次是检测线MET、检测线MOP、质控线，其中检测线MOP、检测线MET、质控线的间隔是3-10mm。
5.根据权利要求1所述一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定试剂，其特征在于，所述联合测定检测卡的毒品完全抗原为毒品分子和载体蛋白的偶联复合物，其中载体蛋白可以选择为牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定试剂，其特征在于，所述样本处理液的成分包括缓冲液、表面活性剂、防腐剂、盐，其中表面活性剂的作用是清洗样本表面油污，使样本成分充分释放和溶解；防腐剂的作用是控制样本处理液中微生物的生长；盐的作用是维持溶液的离子平衡，盐还用于减少样本中蛋白的非特异性结合。
7.根据权利要求1所述一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定试剂，其特征在于，所述样本处理液的缓冲液为PB、Tris-HCl中的一种；所述样本处理液的表面活性剂为TritonX-100、PEG4000、PVP-K30、EDTA二钠、Tween-20、S9、CTAB、S16中的一种或多种；所述样本处理液的防腐剂为Proclin 300；所述样本处理液的盐为氯化镁、氯化钙、氯化钠、磷酸钙中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定试剂，其特征在于，所述样本处理液的pH为7-8。
9.一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定试剂的制备方法，其特征在于，所述测定试剂中检测卡的制备方法包括以下步骤：
S1、抗体修饰：取固含量为1-4％AIE纳米微球，使用偶联缓冲液进行离心后重悬。加入EDC和NHS，加入AIE纳米微球与加入EDC、NHS的质量比分别为1:(1.5-6)和1:(3-18)，室温下孵育0.5-1h对微球进行活化。活化完毕，加入抗体进行偶联，加入AIE纳米微球与加入抗体的质量比为100:(1-15)，混匀室温反应2-4h进行偶联后离心，加入封闭缓冲液进行重悬，封闭缓冲液含质量浓度0.05％-2％的BSA，室温封闭1-2h，离心，使用微球保存液重悬并保存，微球保存液含质量浓度0.2-1％BSA和质量浓度0.1-5％海藻糖。
S2、包被膜制备：用包被缓冲液分别对两种毒品完全抗原、兔IgG进行稀释并划线，其中包被缓冲液含质量浓度0.2-1％BSA、质量浓度0.5-5％海藻糖，两条检测线浓度分别为0.5-2.0mg/mL，划线用量为0.5-1.0μL/cm，质控线的划线浓度为0.5-1.0mg/mL，划线用量为0.5-1.0μL/cm，完成后将包被膜置于湿度≤35％，温度为30℃-50℃的烘箱中干燥16-24h，干燥后密封室温储存备用；
S3、结合垫制备：用结合垫处理液对结合垫浸泡2-4h，其中结合垫处理液含质量浓度0.1％-5％的海藻糖、质量浓度0.2％-1％的牛血清白蛋白，30-50℃烘干16-24h备用。对AIE纳米微球修饰的检测抗体和AIE纳米微球修饰的羊抗兔IgG进行稀释，其中检测抗体保存液的体积浓度分别为5-20％，羊抗兔IgG的体积浓度为3％-10％，混匀，以3-7μL/cm进行喷膜，30-50℃干燥16-24h备用；
S4、样本垫制备：用样本垫处理液对样本垫浸泡2-4h，其中样本垫处理液含质量浓度为0.1％-5％的海藻糖、质量浓度0.2％-1％的BSA、质量浓度0.01％-0.1％Tween-20、质量浓度0.5％-20％的NaCl，30-50℃烘干16-24h备用；
S5、检测卡组装：将制备的样本垫、结合垫、包被膜和吸水纸搭接粘贴于底板的相应位置上，并切成4mm宽的试纸条，装入检测卡。置于室温干燥环境下保存。
10.一种基于AIE纳米微球的吗啡、甲基安非他明联合测定试剂可以应用于尿液、唾液以及毛发中至少一种待测样本中吗啡、甲基安非他明的含量测定。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN117589546A (zh) * 2024-01-19 2024-02-23 广东省大湾区华南理工大学聚集诱导发光高等研究院 一种毛发裂解液及其应用

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