CN107817352A - 犬细小病毒抗体快速定量检测卡及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种犬细小病毒抗体快速定量检测卡及使用方法，包括检测卡外壳和装配在检测卡外壳内的试纸条，所述试纸条包括带压敏胶的塑料底板，在底板上依次粘贴样品垫、标记物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述标记物垫由载体基层和标记物组成，标记物为载体基层上喷涂镧系荧光检测微球和镧系荧光质控微球形成的一层膜，所述硝酸纤维素膜上包被犬细小病毒重组抗原为检测线，包被兔抗鸡lgY抗体为质控线，标记物为标记有犬细小病毒结构蛋白VP2重组抗原的荧光检测微球和标记鸡lgY抗体的荧光质控微球。本发明可实现犬细小病毒抗体现场快速定量检测，具有较高的实用价值和推广价值。

Description

犬细小病毒抗体快速定量检测卡及使用方法

技术领域

本发明涉及一种检测卡及使用，特别是涉及一种犬细小病毒抗体快速定量检测卡及使用方法。

背景技术

犬细小病毒（Canine Parvovirus，CPV）是一种主要感染犬的传染性病毒。该病传染性强。犬之间通过对于其粪便的直接或间接接触而传播该病。犬细小病毒为无囊膜，单负股的DNA病毒，由3个结构蛋白VP1、VP2和VP3组成。其中 VP2 是其保护性颗粒抗原。有研究结果表明 VP2 可诱导犬产生中和抗体，并能保护犬抵御强毒的攻击。该病毒粒子很小，直径 20～22 nm，呈二十面体对称。CPV 属于细小病毒科细小病毒属成员。犬细小病毒病与猫泛白细胞减少症有密切的抗原组分关系。

犬细小病毒病又称为犬传染性肠炎、犬细小病毒性肠炎或出血性肠炎，是20世纪70年代末发现的一种由犬细小病毒引起的出血性肠道传染病。是犬危害极大疫病之一。该病以剧烈呕吐、腹泻、白细胞显著减少和病死率较高为主要临床特征，可以侵害各种年龄的犬，其中以幼犬发病率最高，常为60～100%，死亡率达70%，若不经治疗则病犬的成活率小于5%。

犬细小病毒的防控主要是疫苗免疫，而疫苗免疫动物与感染动物体内都会产生结构蛋白抗体，因此检测结构蛋白抗体的诊断方法能确定动物对病毒株的抵抗力。同时日常监测疫苗产生抗体是对群体的日常监测选择疫苗、评估免疫程序合理性、掌握猪群健康状态的重要手段，同时也可从侧面反映管理是否合理，也是适时注射疫苗的主要依据。

市场上大量使用检测犬细小病毒抗体酶标试剂盒，ELISA试剂盒需要酶标仪、温育反应条件、洗板条件，操作工作环境和专业技术人员，另外检测样本还需要复杂的前处理，如采集血液，分离血清等；而快速胶体金虽然检测方便，不需专业技术人员和工作环境，但其检测的灵敏度低，且只能定性，检测范围窄。而本发明专利的目的就是克服以上两类试剂盒的各自缺点，通过简单的操作，现场快速、准确、高灵敏地定量（半定量）分析，实现在养猪现场检测。

发明内容

本发明的目的就是提供一种犬细小病毒抗体快速定量检测卡及使用方法，克服胶体金快速检测卡和酶标试剂盒各自缺点，通过简单的操作，实现在现场快速、准确、高灵敏地定量检测，从而完全解决上述现有技术的不足之处。

本发明的目的通过下述技术方案来实现：

一种犬细小病毒抗体快速定量检测卡，包括检测卡外壳和装配在检测卡外壳内的试纸条，所述试纸条包括带压敏胶的塑料底板，在底板上依次粘贴样品垫、标记物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述标记物垫由载体基层和标记物组成，标记物为载体基层上喷涂镧系荧光检测微球和镧系荧光质控微球形成的一层膜，其特征在于：所述硝酸纤维素膜上包被犬细小病毒重组抗原为检测线，包被兔抗鸡lgY抗体为质控线，标记物为标记有犬细小病毒结构蛋白VP2的重组抗原的荧光检测微球和标记鸡lgY抗体的荧光质控微球。

进一步，所述犬细小病毒重组抗原是犬细小病毒结构蛋白VP2蛋白，其为多表位表达的重组蛋白。

进一步，所述硝酸纤维素膜上质控线采用的兔抗鸡lgY抗体为兔抗鸡lgY的lgG。采用生物信息学技术（Bioinformatics）对犬细小病毒不同亚型毒株的VP2基因进行比对，确认犬细小病毒VP2蛋白基因序列，设计一对引物，经PCR扩增出目的VP2基因，将VP2基因连接到真核表达载体pEGFP-C1上，构建出重组质粒pEGFP-VP2。之后进行双酶切鉴定。利用Lipofecta mine 2000 （脂质体2000转染试剂）转染试剂盒将重组质粒转染到猪肾细胞PK-15中，通过 G418 筛选后，在荧光显微镜下仍能观察到部分细胞能够呈现出绿色荧光，这表明重组融合蛋白 pEGFP-VP2在 PK-15 细胞中得到了表达。将能够表达重组融合蛋白的细胞进行克隆，以便进一步大量表达和纯化制备犬细小病毒结构蛋白VP2蛋白。

一种制备上述犬细小病毒结构蛋白的方法，采用生物信息学技术原理，应用计算机对犬细小病毒的结构蛋白VP2抗原基因进行比对分析，及抗原表位预测，筛选和设计犬细小病毒结构蛋白特异性的抗原肽序列，并进行人工化学合成抗原肽。

一种上述检测卡的使用方法，所述检测卡为定量层析检测卡，将含有犬细小病毒抗体的待测液滴入检测卡的加样孔中，层析15分钟，然后使用层析扫描仪对检测卡进行扫描，层析扫描仪将扫描所得数据无线传输给客户端，客户端根据扫描数据计算得出检测卡上质控线和检测线的荧光信号强度值，同时客户端从云平台获得被检测犬细小病毒抗体的标准曲线，客户端根据标准曲线与质控线和检测线的荧光信号强度值的对照关系计算得出待测液中犬细小病毒抗体的含量。

作为优选，所述标准曲线是通过如下方式导入云平台的，首先制备一批检测卡，并配制对应的犬细小病毒抗体标准品，用检测卡层析标准品并用层析扫描仪检测，层析扫描仪将检测得到的数据处理传递给客户端，客户端计算得出标准品对应的检测线和质控线的荧光信号强度值，并根据此数据进行回归从而得到犬细小病毒抗体的标准曲线，客户端将标准曲线传输至云平台储存。

作为优选，所述客户端计算得出的标准曲线形成一个文件，并对应生成条形码，客户端通过扫描条形码可以从云平台提取该标准曲线。

名词解释：

兔抗鸡lgY的lgG：兔抗鸡lgY的免疫球蛋白G

鸡lgY抗体：鸡卵黄抗体

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：灵敏度高，检测的批内差及批间差小，有较好的重复性，性能稳定，既可检测全血样本，也可以检测血清和血浆样本，与RV（狂犬病毒）、CDV（犬瘟热病毒)、CPIV（犬副流感病毒）、CAV（犬腺病毒)、CCV（犬冠状病毒）等抗体没有交叉反应。可实现犬细小病毒抗体现场快速检测，具有较高的实用价值和推广价值，采用多表位表达的重组蛋白可以防止漏检，提高检测在敏感度。

附图说明

图1是本发明的结构示意图；

图2是图1中试纸条的结构示意图；

图3是图2的俯视图；

图4是犬细小病毒抗体检测标准曲线；

图5是本发明检测卡的另一种结构示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。

如图1至图4所示，一种犬细小病毒抗体快速定量检测卡，包括装配在外壳10内的试纸条，所述试纸条包括带压敏胶的塑料底板1，在塑料底板1上从左至右依次粘贴样品垫2、标记物垫3、硝酸纤维素膜4和吸水纸5，且样品垫2的右端搭在标记物垫3的左端上，标记物垫3的右端搭在硝酸纤维素膜4的左端上，吸水纸5左端搭在硝酸纤维素膜4的右端上。所述硝酸纤维素膜4上包被犬细小病毒结构蛋白的重组抗原为检测线6，包被兔抗鸡lgY抗体为质控线7，在外壳10上对应样品垫2开设加样孔11，对应硝酸纤维素膜4上的检测线6和质控线7开设视窗孔12。

所述犬细小病毒重组抗原是犬细小病毒结构蛋白VP2，其为多表位表达的重组蛋白。

所述硝酸纤维素膜4上质控线采用的兔抗鸡lgY抗体为兔抗鸡lgY的lgG。

所述标记物垫3由载体基层和标记物组成，标记物为标记有犬细小病毒结构VP2蛋白的重组抗原的荧光检测微球和标记鸡lgY抗体的荧光质控微球。

血样品中犬细小病毒抗体、犬细小病毒结构蛋白VP2蛋白抗原的标记物和硝酸纤维素膜上包被犬细小病毒结构蛋白抗原是通过双抗原夹心法来检测羊血样本中犬细小病毒抗体。

作为一种优选技术方案，所述检测卡的外壳10表面对应吸水纸5的位置开设有多个通孔13，有利于溶剂挥发出外壳10，确保检测结果准确，解决了现有技术的检测卡外壳采用封闭结构，溶剂无法挥发出去的技术问题，参见图5。

为了保证挥发效果，在外壳10表面与吸水纸5大小相匹配的区域内等间距均匀开设通孔13。

作为另一种优选技术方案，所述检测卡本体倾斜固定在外壳10内，且样品垫2处于低端，吸水纸5处于高端。这种结构使得从加样孔11滴入的待测样品流速减缓，缓慢往上层析，保证足够的层析时间，能有效防止液体样品流动过快而影响检测结果，避免样品过快流入硝酸纤维素膜4导致检测结果失败。因为，如果待测样品流速过快，容易导致层析不充分，进而影响检测结果。检测卡本体倾斜的角度根据待测样品的不同具体进行设计。

作为层析检测卡的另一种优选结构，所述层析检测卡的外壳10内设有容纳槽，且在检测卡本体的两侧对称设有2个容纳槽，在容纳槽内安装有片状干燥剂。这种设计使得干燥剂与检测卡本体保持在一起，使得检测卡本体湿度得到有效控制，从而提高检测精度。

作为层析检测卡的另一种优选结构，还可以在层析检测卡的外壳10表面设置带盖的样品储存槽，可以封存样品。所述样品储存槽的盖顶面与外壳10表面齐平，盖上设有凹坑，方便使用者手指施力向外翻开盖。

实施例一、犬细小病毒结构蛋白VP2蛋白的真核表达

步骤一、引物设计和载体的构建：根据GenBank数据库中公开发表的犬细小病毒ORF基因序列，设计引物扩增VP2序列，设计其上下游引物；上游引物F为5'ACTCGAGCTGAAAATATAACTCAATGGAACCTGAGTGACAACG 3'的5'端含有 Xho1酶切位点，下游引物R为5'AGGTACCGGCATAAGCGCCAAACCAGGTTTT 3'的 5'端含有Kpn1酶切位点。以合成的ORF基因为模板，以F/R为引物，进行PCR扩增VP2基因。

步骤二、 重组质粒的构建：用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用DNA纯化回收试剂盒回收纯化的VP2基因片段，将回收片段进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定条带是否正确。以Xho1和Kpn1 2个限制性内切酶同时对载体pEGFP-C1DNA和VP2片段进行双酶切，酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳电泳并用DNA纯化回收试剂盒回收，用T4连接酶与pEGFP-C1进行连接反应，连接条件为4℃过夜，将连接产物转化到E.coli DH5α(感受态大肠杆菌)感受态细胞中，在含Amp（核糖核苷酸）的LB（细胞基础培养基）培养基平板上挑取阳性单克隆，对质粒分别进行PCR鉴定、双酶切鉴定，并将成功构建的重组质粒命名为pEGFP-VP2。

步骤三、PK-15细胞的转染：用质粒DNA纯化试剂盒纯化pEGFP-VP2质粒后供转染用。将培养的猪肾细胞PK-15细胞重悬以后，进行细胞计数，根据12 孔板底面积大小，每孔铺5×10⁵个，铺4孔，添加DMEM (含10%胎牛血清、链霉素、青霉素的完全培养基)补至3mL，过夜培养至细胞密度90%以上，DMEM不完全培养基冲洗每孔。最后每孔加入2mLDMEM，准备转染液，A液为240μL DMEM﹢10μL脂质体2000，B液为230μL DMEM﹢20μL(4μg)质粒，将A 液混匀后室温放置5min后，再将A液、B液混匀，室温放置20min。将转染液逐滴加入试验孔中，轻摇。

步骤四、 G418筛选：转染6h后观察并记录荧光情况，并将转染培养基更换为完全培养基，转染48h后更换为G418（遗传霉素）筛选培养基，通过预试验确定G418筛选浓度为600μg/mL。每3～5d更换1次筛选培养基，以除去死亡细胞和细胞碎片。由此获得了稳定整合有外源基因的PK-15（猪肾细胞）细胞克隆。以便进一步大量表达并纯化犬细小病毒结构蛋白VP2蛋白。

实施例二、犬细小病毒结构蛋白VP2蛋白采用特异性合成肽制备抗原

一种制备上述犬细小病毒结构蛋白VP2蛋白的方法，包括以下步骤：

步骤一、对犬细小病毒结构蛋白VP2蛋白的序列分析：利用生物信息学MHCⅠ类分子预测：通过相关网站求证或应用计算机软件对CPV-VP2蛋白序列分析，了解其亲水性、疏水性、结构域的可及性、序列的可变性、α螺旋、β转角、抗原性等参数，再综合分析及同源建模的方法预测其三级结构，从中预测出抗原反应表位及氨基酸残基，以多肽合成仪难易程度进行综合分析设计。每条多肽链至少含有一个预测的抗原表位，共设计出4个抗原表位多肽片段。

步骤二、 利用Protein Tec.公司（美国一家公司）的PS3型多肽合成仪，采用FMOC固相合成肽反应原理合成步骤一设计的抗原表位多肽片段，然后把多肽从FMOC树脂上切割下来，通过缩合反应再把多条多肽片段连接起来，最后用裂解液把侧链保护基团裂解下来，纯化就得到所合成的多肽，用Western blot实验确定犬细小病毒结构蛋白的VP2蛋白。

实施例三、制备犬细小病毒抗体的检测卡

制备犬细小病毒抗体检测标准曲线：配置含有犬细小病毒抗体的校准液（含犬细小病毒抗体标准品）6份，浓度分别为0、1/1024、1/256、1/64、1/16、1/4（犬细小病毒抗体标准品倍比稀释）。将上述不同浓度的校准液分别加入装配好的检测卡的加样孔内，层析15分钟后，通过层析扫描仪进行检测，将6次得到的检测结果由客户端处理，客户端计算出标准品对应的检测线和质控线的荧光信号强度值，并根据此数据进行线性回归做出犬细小病毒抗体的标准曲线，客户端计算得出的标准曲线形成一个文件，并对应生成条形码，客户端将以条形码为文件名的文件（包含标准曲线）传输至云平台储存，参见图4。

所述客户端计算得出的标准曲线形成一个文件，并对应生成条形码，客户端通过扫描条形码可以从云平台提取该标准曲线。

该检测卡的使用方法：将待检样品（以血清为例）与样品稀释液按1:50比例稀释，将稀释好的样本80ul加入加样孔11中，在吸水纸5的作用下，样本从样品垫2向吸水纸5方向移动。在避免强光照射的情况下层析15min，然后用层析扫描仪对检测卡进行检测，层析扫描仪获取检测线6和质控线7的荧光信号，层析扫描仪通过蓝牙把检测数据传到客户端，客户端根据检测数据计算出检测线的荧光信号强度值和质控线的荧光信号强度值，客户端通过扫描此批检测卡的条形码从云平台获得被检测犬细小病毒抗体的标准曲线，客户端根据标准曲线与质控线和检测线的荧光信号强度值的对照关系计算得出待测液中犬细小病毒抗体的含量，参见图4的标准曲线。客户端可以为手机或平板电脑。

上述检测卡的制备方法如下：

步骤一，把硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板上，采用点膜喷金专用机器在硝酸纤维素膜上喷涂已稀释至0.5mg/ml的羊抗鸡lgY的lgG形成质控线和已稀释至0.5mg/ml的犬细小病毒结构蛋白VP2的重组蛋白形成检测线，喷量为1μl/cm，然后在37℃的温度下烘制8小时；

步骤二，制备标记有鸡lgY的镧系荧光微球和标记有犬细小病毒结构蛋白VP2蛋白的重组抗原的镧系荧光微球，将1mL的镧系荧光微球加入到50mg的MES（2-（N-吗啡啉）乙磺酸）缓冲液（0.1M，pH7.0）中，再加入10mg碳二亚胺（EDC）和10mg N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐搅拌溶解，室温反应30分钟后进行离心操作，将离心沉淀物用50mM硼酸缓冲液（pH8.2）复溶，加入2mg透析过的鸡lgY，在室温条件下搅拌反应24小时，然后离心、封闭后，再在稀释液中保存（保存环境温度为2～8℃），即得标记有鸡lgY的镧系荧光微球；采用上述同样的方法标记犬细小病毒结构蛋白VP2蛋白的重组抗原的镧系荧光微球；

步骤三，把标记有鸡lgY和标记有犬细小病毒VP2蛋白的重组抗原的镧系荧光微球并分别稀释至浓度0.1μg/ml和3μg/ml，采用点膜喷金机器将其喷涂在载体基层上构成标记垫，喷量为2.5 μl/cm，然后在37℃的温度下烘制8小时；

步骤四，把样品垫、标记垫、吸水纸依次粘在PVC底板上，组装成大卡，再用剪切机切割成5mm宽的试纸条，装配在检测卡外壳内，即得到本犬细小病毒抗体检测卡。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种犬细小病毒抗体快速定量检测卡，包括检测卡外壳和装配在检测卡外壳内的试纸条，所述试纸条包括带压敏胶的塑料底板，在底板上依次粘贴样品垫、标记物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述标记物垫由载体基层和标记物组成，标记物为载体基层上喷涂镧系荧光检测微球和镧系荧光质控微球形成的一层膜，其特征在于：所述硝酸纤维素膜上包被犬细小病毒重组抗原为检测线，包被兔抗鸡lgY抗体为质控线，标记物为标记有犬细小病毒结构蛋白VP2的重组抗原的荧光检测微球和标记鸡lgY抗体的荧光质控微球。

2.根据权利要求1所述的犬细小病毒抗体快速定量检测卡，其特征在于：所述犬细小病毒结构蛋白是犬细小病毒结构蛋白VP2蛋白，其为多表位表达的重组蛋白。

3.根据权利要求1所述的用于快速定量检测血清中犬细小病毒抗体的检测卡，其特征在于：所述硝酸纤维素膜上质控线采用的兔抗鸡lgY抗体为兔抗鸡lgY的lgG。

4.一种制备权利要求2中所述犬细小病毒结构蛋白VP2的方法，其特征在于：采用生物信息学技术（Bioinformatics）对犬细小病毒不同亚型毒株的VP2基因进行比对，确认犬细小病毒VP2蛋白基因序列，设计一对引物，经PCR扩增出目的VP2基因，将VP2基因连接到真核表达载体pEGFP-C1上，构建出重组质粒pEGFP-VP2，之后进行双酶切鉴定，利用 Lipofectamine 2000 （脂质体2000转染试剂）转染试剂盒将重组质粒转染到猪肾细胞PK-15中，通过G418 筛选后，在荧光显微镜下仍能观察到部分细胞能够呈现出绿色荧光，这表明重组融合蛋白 pEGFP-VP2在 PK-15 细胞中得到了表达，将能够表达重组融合蛋白的细胞进行克隆，以便进一步大量表达和纯化制备犬细小病毒结构蛋白VP2蛋白。

5.一种制备权利要求2中所述犬细小病毒结构蛋白VP2的方法，其特征在于：采用生物信息学技术原理，应用计算机对犬细小病毒的结构蛋白VP2抗原基因进行比对分析，及抗原表位预测，筛选和设计犬细小病毒特异性的抗原肽序列，并进行人工化学合成抗原肽。

6.一种权利要求1或2或3或4所述检测卡的使用方法，其特征在于： 所述检测卡为定量层析检测卡，将含有犬细小病毒抗体的待测液滴入检测卡的加样孔中，层析15分钟，然后使用层析扫描仪对检测卡进行扫描，层析扫描仪将扫描所得数据无线传输给客户端，客户端根据扫描数据计算得出检测卡上质控线和检测线的荧光信号强度值，同时客户端从云平台获得被检测犬细小病毒抗体的标准曲线，客户端根据标准曲线与质控线和检测线的荧光信号强度值的对照关系计算得出待测液中犬细小病毒抗体的含量。

7.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于：所述标准曲线是通过如下方式导入云平台的，首先制备一批检测卡，并配制对应的犬细小病毒抗体标准品，用检测卡层析标准品并用层析扫描仪检测，层析扫描仪将检测得到的数据处理传递给客户端，客户端计算得出标准品对应的检测线和质控线的荧光信号强度值，并根据此数据进行回归从而得到犬细小病毒抗体的标准曲线，客户端将标准曲线传输至云平台储存。

8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于：所述客户端计算得出的标准曲线形成一个文件，并对应生成条形码，客户端通过扫描条形码可以从云平台提取该标准曲线。