CN102768280B - 甲型流感病毒分亚型检测抗原芯片及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及甲型流感病毒分亚型检测抗原芯片及其制备方法和用途。根据亚洲以及中国历史上及近期爆发的流感的特点，选择到几种典型的代表甲型流感病毒不同亚型的蛋白质，作为蛋白质探针。所述的蛋白质探针被点样于芯片上，可实现同时检测多个样本，也可实现高通量检测。

Description

甲型流感病毒分亚型检测抗原芯片及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及甲型流感病毒分亚型检测抗原芯片及其制备方法和用途。

背景技术

甲型流感病毒(Influenza A)是引起人类流行性感冒的主要原因。在20世纪至少发生过四次流感大流行，造成了几千万人丧生的后果。1997年以来不断出现的甲型流感病毒H5N1亚型高致病性禽流感感染人的案例以及2009年甲型H1N1(A/H1N1)流感爆发均起了社会各界广泛的关注，并引发了人类对于新一轮流感大流行的恐慌。

对于甲型流感病毒的检测是防控流感大流行的有效手段之一：流感病毒亚型以及变异的检测，可以指导有针对性的疫苗接种；流感的早期、快速诊断，可以切断流感病毒在人群中的传播。目前对于流感病毒的检测手段主要有以下几种：1.病毒分离与鉴定：是流感病毒检测的金标准，但由于涉及病毒的培养过程，所以耗费时间较长(几天)并且会有生物安全方面的问题。2.血清学检测：包括ELISA，间接免疫荧光测定，血凝抑制实验(HI)，神经氨酸酶抑制实验(NIT)，病毒中和实验，胶体金免疫层析实验等方法。血清学检测技术所利用的原理是抗原与抗体在适宜环境下可以发生特异性结合，其检测的对象是待测血液样本中析出的血清或鼻咽拭子等其他形式的样本，既可以利用已知抗体检测未知抗原，又可以利用已知抗原检测未知抗体。血清学方法是最经典也是最为常用的流感病毒检测技术，能够达到快速诊断的目的。3.病毒核酸检测：主要是RT-PCR等方法。核酸检测的方法具有比较好的特异性和灵敏性，但是对于仪器以及操作的要求比较严格，操作过程中以及实验室条件方面的不可控因素可能造成诊断结果的假阳性率较高。

发明内容

本发明的目的在于提供甲型流感病毒分亚型检测抗原芯片及其制备方法和用途。

在本发明的第一方面，提供一种蛋白质芯片，所述的蛋白质芯片包括：

固相载体；以及

有序固定在所述固相载体上的蛋白质探针；

所述的蛋白质包括：甲型流感病毒H1亚型血凝素(Hemagglutinin)蛋白HA1，甲型流感病毒H2亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H3亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H5亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H7亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H9亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H5亚型核蛋白(Neucleoprotein)NP。

在另一优选例中，所述的甲型流感病毒H1亚型血凝素蛋白HA1来源于A/California/04/2009(H1N1)病毒株；

所述的甲型流感病毒H2亚型血凝素蛋白HA1来源于A/Adachi/2/1957(H2N2)病毒株；

所述的甲型流感病毒H3亚型血凝素蛋白HA1来源于A/Aichi/2/1968(H3N2)病毒株；

所述的甲型流感病毒H5亚型血凝素蛋白HA1来源于A/chicken/Henan/12/2004(H5N1)病毒株；

所述的甲型流感病毒H7亚型血凝素蛋白HA1来源于A/FPV/Rostock/1934(H7N1)病毒株；

所述的甲型流感病毒H9亚型血凝素蛋白HA1来源于A/chicken/Jiangsu/7/2002(H9N2)病毒株；或

所述的甲型流感病毒H5亚型核蛋白NP来源于A/chicken/Henan/12/2004(H5N1)病毒株。

在另一优选例中，所述的固相载体是盖玻片。

在另一优选例中，所述的盖玻片是醛基基片。

在另一优选例中，所述的蛋白质通过共价偶联蛋白修饰方法固定在醛基化的固相载体上。

在另一优选例中，所述的蛋白质芯片上还包括：阳性对照；和/或阴性对照。

在另一优选例中，所述的阳性对照是IgG。较佳地，以不同浓度IgG作为阳性对照，点样在固相载体上，形成阳性标识列。

在另一优选例中，所述的阴性对照是牛血清白蛋白(BSA)。

在另一优选例中，所述的固相载体是载玻片。

在另一优选例中，所述的固相载体上，还包括隔栅，从而分隔形成2-50个(较佳地4-30个；更佳地6-20个)独立的区域，每一区域固定有一组蛋白质探针，每一组蛋白质包括：甲型流感病毒H1亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H2亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H3亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H5亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H7亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H9亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H5亚型核蛋白NP，该蛋白质芯片用于多样本同时检测。

在另一优选例中，所述的固相载体上，每一蛋白质探针的点样量是4±2nl。

在另一优选例中，所述的固相载体上，每一蛋白质探针的点样直径为200±100μm。

在另一优选例中，所述的固相载体上，相邻的蛋白质探针点之间间距是650±200μm。

在另一优选例中，蛋白质探针点样后，以封闭液封闭。

在本发明的另一方面，提供所述的蛋白质芯片的用途，用于制备检测甲型流感病毒的试剂盒。

在另一优选例中，所述的甲型流感病毒选自以下亚型：甲型流感病毒H1亚型，甲型流感病毒H2亚型，甲型流感病毒H3亚型，甲型流感病毒H5亚型，甲型流感病毒H7亚型，甲型流感病毒H9亚型。

在本发明的另一方面，提供一种检测甲型流感病毒的试剂盒，其含有所述的蛋白质芯片。

在另一优选例中，所述的试剂盒中，还包括：抗IgG的第二抗体，其携带有可检测信号(如荧光信号)。

在另一优选例中，所述的可检测信号选自：Cy3、Cy5或FITC。

在另一优选例中，所述的可检测信号选自：Cy3或Cy5。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括(但不限于)：稀释液、洗涤液、预杂交液、杂交液、使用说明书。

在本发明的另一方面，提供一种体外非诊断性地检测甲型流感病毒的方法，所述方法包括：

(1)将待测样品加样于所述的蛋白质芯片上，从而使待测样品中的甲型流感病毒血凝素蛋白HA1抗体或核蛋白NP抗体与固相载体上的蛋白质探针结合，形成带有“甲型流感病毒血凝素蛋白HA1抗体或核蛋白NP抗体-蛋白质探针”二元复合物的固相载体；

(2)将携带有可检测信号的抗IgG第二抗体加样于(1)的带有“甲型流感病毒血凝素蛋白HA1抗体或核蛋白NP抗体-蛋白质探针”二元复合物的固相载体，形成带有“第二抗体-甲型流感病毒血凝素蛋白HA1抗体或核蛋白NP抗体-蛋白质探针”三元复合物的固相载体；

(3)检测三元复合物中的可检测信号，确定待检测样品中甲型流感病毒血凝素蛋白HA1抗体或核蛋白NP抗体的存在与否、存在的量或存在位置，从而确定甲型流感病毒的存在与否、存在的量或存在的亚型。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、抗原芯片原理。

图2、抗原芯片制备以及检测流程图。

图3、蛋白探针亲和纯化SDS-PAGE图。

A.A/H1N1 HA1重组蛋白。其中M：低分子量蛋白Marker；1：纯化前；2：穿透(指纯化时洗脱下来的杂蛋白)；3：纯化后。

B.H2N2 HA1重组蛋白。其中M：低分子量蛋白Marker；1：纯化前；2：穿透；3：纯化后。

C.H3N2 HA1重组蛋白。其中M：低分子量蛋白Marker；1：纯化前；2：穿透；3：纯化后。

D.H5N1 HA1重组蛋白。其中M：低分子量蛋白Marker；1：纯化前；2：穿透；3：纯化后。

E.H7N2 HA1重组蛋白。其中M：低分子量蛋白Marker；1：纯化前；2：穿透；3：纯化后。

F.H9N2 HA1重组蛋白。其中M：低分子量蛋白Marker；1：纯化前；2：穿透；3：纯化后。

G.H5N1 NP重组蛋白。其中M：低分子量蛋白Marker；1：纯化前；2：穿透；3-7：不同浓度咪唑洗脱。

图4、DNA疫苗载体pBudCE4.1图谱(A)以及PCR验证(B)。。

图5、芯片外观示意图。

图6、甲型流感病毒抗原芯片点样模式示意图。

图7、抗原芯片与荧光二抗杂交图像(A)及荧光值(B、C)。其中，A中，各图像由上至下(同一行的，由左至右)依次代表了Cy3鼠二抗稀释度由1∶200到1∶25600。B(横坐标表示芯片的标识列即阳性照为鼠IgG，点样时是以浓度梯度点样)和C是各鼠二抗稀释度下检测信号的线性情况以及柱形图。

图8、抗原芯片的质量控制。

A.anti-His鼠单克隆抗体与偶联于蛋白芯片基片表面带有6×His标签的蛋白探针反应。

B.Cy3鼠二抗与蛋白探针反应情况。

C.Cy3人二抗与H5，H7，H9，H1，H2，H3，NP蛋白探针反应情况。

图9、不同亚型甲型流感病毒DNA疫苗免疫鼠血清与抗原芯片杂交。

A.芯片杂交图像。

B-E.部分抗原芯片杂交反应的荧光强度柱形图。

图10、H9亚型模拟鼠血清与抗原芯片浓度梯度杂交后杂交图像。

图11、A/H1N1流感疫苗免疫人血清与抗原芯片的杂交.

A.杂交图像。

B.荧光强度柱形图。

具体实施方式

本发明人长期研究甲型流感病毒的检测及分型，根据亚洲以及中国历史上及近期爆发的流感的特点，选择到几种典型的代表甲型流感病毒不同亚型的蛋白质，作为蛋白质探针。这些蛋白质探针能够检出人群中典型流行的甲型流感病毒亚型。所述的蛋白质探针被点样于芯片上，可实现同时检测多个样本，也可实现高通量检测。

蛋白质探针

本发明的蛋白质探针中，所述的蛋白质来源于一些经过本发明人选择认为典型的甲型流感病毒。这些甲型流感病毒是在亚洲以及中国典型流行的。本发明人充分考虑到亚洲和中国甲型流感流行区域特异性、历史概况、流行趋势等诸多因素，最终选择了人流感病毒主要亚型、同样也是宿主范围最广的亚型(H1、H3)，曾经造成1957-1958年亚洲流感爆发的H2亚型，能够导致人类感染且死亡率极高的高致病性禽流感亚型(H5、H7)，以及同样能够造成人类感染的中国高发的禽流感亚型(H9)作为检测对象。

血凝素蛋白(Hemagglutinin，HA)是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分，可以诱导保护性抗体的产生，具有亚型特异性。HA主要由HA1和HA2肽链所组成：HA1形成HA纤突的球状部分，携带有受体结合位点，HA主要B细胞抗原表位位于HA1，该位点的突变可以改变宿主的特异性。HA2的C端有一疏水区，它是穿膜部分；而NP蛋白构成病毒核衣壳的主要蛋白成分，具有型特异性(A、B、C三型流感病毒的分型依据)。甲型流感病毒可分为16个HA亚型(H1-H16)和9个NA亚型(N1-N9)。目前为止发现有H1、H2、H3、H5、H7、H9和H10等HA亚型的甲型流感病毒可以造成人类的感染，其中，H5、H7属于高致病性亚型，H1、H3是人流感病毒主要亚型、同样也是宿主范围最广的亚型。因此，对于上述亚型病毒的有效检测对于控制流感的爆发具有重要意义。

对于甲型流感病毒来说，HA是病毒的主要表面糖蛋白。HA1形成HA纤突的球状部分，携带有受体结合位点，集中了主要的抗原表位且亚型之间同源性很低。因此，本发明人选择HA1蛋白作为抗原芯片的探针蛋白，从而有利于对甲型流感病毒进行分型。NP蛋白在所有的甲型流感病毒中比较保守，是A、B型流感分型的主要依据。因此，本发明人选择甲型(A型)流感NP蛋白作为甲型流感型特异(A，B，C三型)的探针蛋白。

较佳地，所述对蛋白质探针中，蛋白质包括：甲型流感病毒H1亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H2亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H3亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H5亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H7亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H9亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H5亚型核蛋白NP。更佳地，所述的甲型流感病毒H1亚型血凝素蛋白HA1来源于A/California/04/2009(H1N1)病毒株；所述的甲型流感病毒H2亚型血凝素蛋白HA1来源于A/Adachi/2/1957(H2N2)病毒株；所述的甲型流感病毒H3亚型血凝素蛋白HA1来源于A/Aichi/2/1968(H3N2)病毒株；所述的甲型流感病毒H5亚型血凝素蛋白HA1来源于A/Chicken/Henan/12/2004(H5N1)病毒株；所述的甲型流感病毒H7亚型血凝素蛋白HA1来源于A/FPV/Rostock/1934(H7N1)病毒株；所述的甲型流感病毒H9亚型血凝素蛋白HA1来源于A/Chicken/Jiangsu/7/2002(H9N2)病毒株；或所述的甲型流感病毒H5亚型核蛋白NP来源于A/Chicken/Henan/12/2004(H5N1)病毒株。

所述的蛋白质可以通过本领域技术人员已知的常规方法来制备，较佳地可通过基因工程重组表达技术来获得这些蛋白质。这通常是将蛋白质的编码基因克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关蛋白序列。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)可被用于获得所述的编码基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

表达或生产重组的蛋白质的方法一般来说有以下步骤：

(1).用编码所述蛋白质的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

蛋白芯片

根据上述提供的蛋白质探针，可设计出适合的探针，固定在芯片上。

蛋白芯片是蛋白质组学研究的重要工具，可以将大规模的微量蛋白质特异捕获分子以一种可寻址的方式固定于芯片片基表面形成微阵列，与生物样品反应后扫描检测从而实现对样品中蛋白质组分进行微量、快速、高通量地平行分析。本发明人发现，蛋白芯片十分适用于甲型流感病毒的分亚型检测，且可实现高通量的检测。

所述固相载体可采用蛋白芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基、异硫晴酸基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。作为本发明的优选方式，所述的固相载体是载玻片。更佳地，所述的载玻片是醛基基片。

本发明的蛋白芯片的制备可采用生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片，可将蛋白探针配制成溶液，然后点样仪将其点在修饰玻片，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的蛋白芯片。其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.Lerisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring the metabolic and geneticcontrol of gene expression on a genomic scale.Science，1997；278：680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。

所述的芯片上，蛋白质可以特异性地捕获待测样本(如血清)中相应的抗体(第一抗体)，可藉由识别第一抗体(一抗)的第二抗体(二抗)来携带可检测信号，从而获自待测样本中第一抗体的存在与否、存在量。该第一抗体的存在与否以及存在量同时也反映了待测样本中甲型流感病毒的存在情况。较佳地，蛋白芯片的设计如图1所示：蛋白质探针点样于固相载体上，检测时可结合样本中的抗体，最后以第二抗体来检测。检测的流程如图2所示。

这里，“特异性”是指抗体能结合于特定的抗原(蛋白质)。

这里，所述的“第二抗体”是可以特异性识别和结合“第一抗体”的。例如，动物(如人，禽类、哺乳动物)血清中，由于甲型流感病毒的存在而诱导产生IgG抗体，因此可以以特异性识别IgG的第二抗体来实现检测。

所述的“第二抗体”上携带可检测信号以便于识别。可以用的可检测信号包括但不限于：荧光分子(如Cy3、Cy5、FITC等)、地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等。这些标记及其标记方法都已是本领域众所周知的常规技术，也可以参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔主编，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002年；马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。

为了便于芯片的检测，通常该可检测信号是荧光信号，较佳地例如Cy3、Cy5、FITC。

本发明人还优化了蛋白质在芯片上的点样条件，以获得较好的检测结果。作为本发明的优选方式，所述的固相载体上，每一蛋白质探针的点样量是4±2nl；作为本发明的另一优选方式，所述的固相载体上，每一蛋白质探针的点样直径为200±100μm；作为本发明的另一优选方式，所述的固相载体上，相邻的蛋白质探针点之间间距是650±200μm。蛋白质探针点样后，以封闭液封闭。

为了获得定量结果，可以在检测过程中设置含已知浓度的多个阳性对照品(标准品)，例如在芯片上规定特殊的列，以该列作为阳性对照标识列。为了排除背景影响，还可以在芯片上设置阴性对照。

本发明扩增产物与蛋白芯片之间的杂交可以按照本领域的经典方法进行，可以优化有关缓冲液、样本浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等至最适条件。

在杂交后，根据可检测信号在蛋白芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。若扩增产物用荧光基团标记，也可直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray3000等)获取待测信息。

检测试剂盒

本发明还提供一种用于测定甲型流感病毒的试剂盒，所述的试剂盒中包括本发明所述的芯片。

更优选的，它还含有选自下组的试剂：抗IgG的第二抗体，其携带有可检测信号(如荧光信号)。

此外，所述的试剂盒中还可包括用于稀释、洗涤、杂交、显色等所需的各种试剂。

此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。所述的芯片图像分析软件比如：BaiO公司的BaiO ArrayDoctor 2.0，Media Cybernetics公司的Arraypro 4.0。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明的蛋白质芯片以不同亚型甲型流感病毒HA1蛋白和NP蛋白为探针，可以平行检测一个血清样本针对6种不同亚型的7种蛋白(H1、H2、H3、H5、H7、H9亚型的HA蛋白以及甲型流感病毒NP蛋白)抗体含量，模拟血清实验以及病人血清(疫苗免疫正常人)实验显示其对各种阳性血清和阴性血清有很好的区分，且具有良好的重复性。

(2)以本发明的蛋白质芯片检测，所需要的样本量大大少于传统的ELISA方法。且可在一个固相载体上设置多个独立的检测区域，可实现同时检测多个样本，也可实现高通量检测。节约了耗用基片数量，节约成本。节约了杂交液的用量，节约成本。

(3)可对多个样本同时杂交，提高了杂交条件的一致性，增加了各组杂交数据之间的平行性和可对比性。多样本同时杂交，节约了操作时间，简化了操作过程，更适于芯片在临床检测和疾病筛选等方面的实际应用。

(4)一次扫描可同时得到多个杂交图像，节约了扫描成本。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、甲型流感病毒HA1蛋白和NP蛋白探针的表达与纯化

1、编码基因的选择和合成

本发明人选用的甲型流感病毒H1，H2，H3，H5，H7，H9亚型HA蛋白的编码基因分别属于以下六种病毒株：A/California/04/2009(H1N1)，A/Adachi/2/1957(H2N2)，A/Aichi/2/1968(H3N2)，A/chicken/Henan/12/2004(H5N1)，A/FPV/Rostock/1934(H7N1)，A/chicken/Jiangsu/7/2002(H9N2)。

选用的H5亚型NP蛋白的编码基因属于以下病毒株：A/chicken/Henan/12/2004(H5N1)。

其中，H1，H2，H3，H5，H7，H9亚型HA蛋白的编码基因的序列依次参见GenBank登录号FJ966082.1，GenBank登录号AB432937.2，GenBank登录号AB295605.1，GenBank登录号AY950232.1，GenBank登录号M24457.1，GenBank登录号FJ384759.1芯片上所使用的是HA1基因，是HA全长基因前975bp。

其中，H5亚型NP蛋白的编码基因的序列参见GenBank登录号AY950253.1。

上述6个亚型的HA1蛋白的编码基因大小约为975bp，NP蛋白的编码基因大小约为1450bp。这些基因进行全基因合成。

2、重组抗原的基因克隆

本发明人在设计引物两端各加入一个限制性内切酶酶切位点(NotI/XhoI位点)，在引物对目的基因进行扩增以后，对扩增序列和载体都进行双酶切，再通过T4DNA酶将目的基因连接进入商业化原核表达载体pET-28a(Novagen公司)的多克隆位点(NotI/XhoI位点内)。随后本发明人将连接产物转化大肠杆菌DH5α，37℃培养12-16h后挑单克隆PCR验证和测序验证，电泳结果显示各亚型流感病毒HA-1蛋白基因在约975bp处有清晰条带，NP蛋白基因在约1450bp处有清晰条带，与目的条带大小一致，且测序完全正确。

3、重组抗原蛋白的表达和纯化

本发明人将经验证为阳性的重组质粒转化表达菌株ROSSETA(购自Merk)，经快速诱导，优化表达条件，大量诱导表达。此处表达条件为：1)克隆有基因的pET-28a表达载体转化ROSSETA。2)将单克隆菌落接种至50ml Amp抗性的LB培养液中，37℃培养过夜。3)过夜培养菌液以1∶100转接到1L Amp抗性的LB培养液中，37℃振荡培养至OD₆₀₀达到0.4-0.6。4)加入1mM IPTG诱导，37℃振荡培养4h。

最后，采用表达载体pET-28a上6×His Tag对应的商业化填料(Ni SepharoseHigh Performance，Amersham Biosciences)对目的蛋白进行亲和纯化。纯化结果SDS-PAGE验证如图3所示。

实施例2、抗甲型流感病毒HA蛋白和NP蛋白鼠模拟血清的制备

本发明人制备抗流感病毒HA蛋白鼠模拟血清(作为一抗)的原因主要有两点：1)确诊病人样本的缺乏；2)几乎所有人有过甲型流感病毒的感染，即便某种亚型的甲型流感病毒的确诊病人血清中也有可能含有其他亚型的甲型流感病毒抗体，从而可能对芯片的评价实验产生干扰。

1、DNA疫苗的构建

根据探针情况选择A/California/04/2009(H1N1)，A/Adachi/2/1957(H2N2)，A/Aichi/2/1968(H3N2)，A/Chicken/Henan/12/2004(H5N1)，A/FPV/Rostock/1934(H7N1)，A/Chicken/Jiangsu/7/2002(H9N2)六种病毒株的HA蛋白以及A/chicken/Henan/12/2004(H5N1)的NP蛋白的编码DNA构建DNA疫苗。

所用疫苗载体为真核表达载体pBudCE4.1(Invitrogen)，该质粒含有CMV和EF-1α两个真核启动子。本发明人在设计对应于HA基因的引物时两端各加入一个限制性内切酶酶切位点，在设计对应于NP基因的引物时两端各加入一个限制性内切酶酶切位点。对目的基因进行扩增，然后对扩增序列和载体都进行双酶切，再通过T4DNA连接酶进行连接。随后将连接产物转化大肠杆菌DH5a细胞，37℃培养12-16h后挑单克隆PCR验证和测序验证，PCR后电泳结果显示各亚型流感病毒HA蛋白基因在1.6KB处有清晰条带，与目的条带大小一致(图4)，且测序完全正确。

本发明人构建的DNA疫苗，分别连有上述种病毒的HA蛋白基因，记为p-H1-HA，p-H2-HA，p-H3-HA，p-H7-HA，p-H9-HA(HA分别连接入载体的NotI/KpnI，BamHI/HindIII，NotI/XhoI，NotI/KpnI，NotI/KpnI位点)。所构建的H5N1DNA疫苗同时连有HA和NP基因(HA连接入载体的NotI/XhoI，NP连接入载体的BamHI/HindIII位点)，记为p-H5-HA+NP。

2、小鼠免疫DNA疫苗

4-6周龄BALB/c雌性小鼠，于小鼠两后腿肱四头肌进行肌肉注射，每只小鼠注射100μl DNA疫苗混合溶液(50μg DNA疫苗加20μg佐剂CpG ODN 1860，溶于100μl PBS)。注射前用酒精擦拭小鼠注射部位，可以看清楚注射区域的皮肤；或者剃掉注射区域的毛，使得皮肤表面暴露，利于注射。注射时，保持针孔的平面部分朝外，缓缓推入疫苗，旋转90度然后慢慢拔出，防止疫苗泄漏到外面，每只后腿注射50μl疫苗混合溶液。注射后，马上使用5mm距离的电极，在针孔两侧插入注射区域的肌肉进行电击，电压为100v，时长为50ms，共进行5个脉冲。电击仪器为Electro Square Porator T830 M(BTX，San Diego，CA)。每隔三周免疫一次，共免疫三次。第三次免疫后十天眼眶取血，血液在37℃放置1小时后在转移至4℃放置24小时后离心，取上层无色或淡黄色血清，储存于-20℃备用。

3、ELISA检测模拟鼠血清特异抗体

将构建好的DNA疫苗免疫小鼠，各不同亚型小鼠血清分别记为：H1-HA，H2-HA，H3-HA，H5-HA+NP，H7-HA，H9-HA。以表达的相应原核蛋白包被做间接ELISA，结果显示，多数亚型抗体的滴度在1∶6400以上。

实施例3、甲型流感病毒分亚型检测抗原芯片的制备

1、蛋白芯片载体的选择

蛋白芯片的载体基片包括塑料、金属膜以及以聚偏氟乙烯膜、醋酸纤维膜，玻片和硅片等。经过反复研究以及比较，结合玻片廉价、表面光滑不渗透以及低背景等优点，本发明人选用玻片作为蛋白芯片的载体。除此之外，蛋白芯片表面首先需进行修饰方能与蛋白探针结合，并且还要最大程度的保持蛋白质的活性和稳定性。蛋白质分子在玻片表面的固定通常包括非共价的物理吸附，特异的化学共价偶联和特异性的亲和作用偶联等方式。同样，经过反复研究以及比较，本发明人选择可以共价偶联蛋白的醛基化修饰方法。最终，本发明人选择了商业化醛基基片(CEL Associates，Inc)。

另外，为了最大限度的利用蛋白芯片片基以及扩大蛋白芯片的通量，本发明人利用格栅将蛋白芯片基片分为十个反应区域，可以互不干扰地同时进行十个样本的反应，示意图如图5。

本发明涉及到的血清样本包括模拟鼠血清和免疫过甲型H1N1流感疫苗的人血清，所以在此研制了两种甲型流感病毒抗原芯片，二者唯一的区别是阳性对照标识列所阵列的IgG类型。

2、蛋白芯片的点制

将上述表达的探针蛋白、阳性对照标识列(鼠IgG或人IgG)和阴性对照(BSA)按照图6点样模式进行点样。其中，探针蛋白的浓度皆为1mg/ml，阳性对照标识列为IgG浓度梯度(50μg/ml倍比稀释，点样液成分：PBS+50％甘油+0.1％SDS)，阴性对照浓度为1mg/ml。其中，阳性对照标识列的点样浓度是根据预实验以及文献报道确定的。根据点样模式设置参数。使用PixsyS7500芯片点样仪(Cartesian Technologies)接触式点样。每点的蛋白量约为4nl，点直径为200μm，点间距650μm。点样后的玻片于室温过夜，以使蛋白探针与蛋白芯片基片表面活化基团充分反应。

2、蛋白芯片的封闭

点制完毕并且室温过夜后的芯片，于每个反应区滴加10μl封闭液(PBS+25％FBS+4％蔗糖)。将芯片置湿盒中，37℃应2小时。芯片洗涤液滴加于反应区，轻轻晃动芯片约30秒，重复三遍。ddH₂O轻轻冲洗一遍后于洁净处晾干。经上述处理的芯片置于4℃备用。

实施例4、抗原芯片杂交条件的确定以及质量控制

1、二抗浓度的确定以及血清稀释度的初步确定

荧光标记二抗的浓度是抗原芯片实验需要首先确定的参数：荧光标记二抗浓度过高，可能会出现荧光信号溢出(超出检测范围)、背景过高以及非特异性信号等问题；荧光标记二抗浓度过低，则有可能检测不到弱阳性样本的信号，使芯片实验的可信度下降。另外，血清样本的稀释度也是需要考虑的问题之一：稀释度过高，有可能检测不到阳性信号；稀释度过低，可能造成背景过高。

所以，本发明人设计实验：将点制好的标识列为鼠IgG的抗原芯片与H1-HA模拟鼠血清(一抗，1∶200稀释)孵育，经洗涤后与Cy3鼠二抗(Cy3 Goat anti-mouseIgG，Abcam公司)孵育，二抗稀释度由1∶200开始倍比稀释，共做8个梯度。具体操作如下：1)将样本血清以一定稀释度稀释于样品稀释液。2)于芯片反应区滴加10μl经过稀释的样本。3)将芯片置湿盒中，37℃反应30分钟。4)芯片洗涤液滴加于反应区，轻轻晃动芯片约30秒，重复三遍。5)将荧光标记的二抗以合适稀释度稀释于样品稀释液，滴加10μl于芯片反应区。注意避光。6)将芯片置湿盒中，37℃反应30分钟。注意避光。7)洗涤，注意避光。经过上述步骤处理的芯片可以使用芯片扫描仪进行结果的读取。

结果显示，Cy3鼠二抗稀释度在1∶800之间时，阳性对照标识列有信号溢出现象并且线性不佳(图7A、B)，同时无关探针点上的信号值过高(图7C)。Cy3鼠二抗稀释度为1∶1600以及1∶3200时，阳性对照标识列有比较好的线性且信号值适中(图6.A.B)，同时无关探针点上的信号值出下降到很低的水平(图7C)。Cy3鼠二抗稀释度高于1∶3200的情况下，阳性对照标识列的信号值有大幅度衰减(图7B)。另外，值得注意的是，探针为A/H1N1 HA1的信号点在Cy3鼠二抗浓度为1∶1600以及1∶3200时仍能够检测到比较强的信号值，但是更高的二抗稀释度则造成荧光信号值的急剧下降。

从上述实验结果本发明人可以得到以下三个信息：

a)Cy3鼠二抗(Cy3 Goat anti-mouse IgG)的工作浓度应该介于1∶1600至1∶3200之间。在此，从节省抗体以及简化实验的角度出发，本发明人选择1∶2000作为Cy3鼠二抗稀释度。

b)H1模拟鼠血清(1∶200稀释)与芯片的杂交实验说明，该血清样本稀释度对于模拟鼠血清来说是合适的的。其他亚型模拟鼠血清样本也可以参照此稀释度进行芯片杂交实验。

c)H1模拟鼠血清与其他亚型的探针蛋白交叉反应是比较弱的。

同样，Cy3人二抗(山羊抗人多克隆IgG-H&L Cy3；购自Abcam)的工作浓度也利用上述实验手段确定。结果确定最佳的Cy3人二抗稀释度为1∶3000。

2、抗原芯片质量控制

为了实验严谨，对于抗原芯片，本发明人引入了一组实验对其进行质量控制：Anti-His鼠单抗(购自中科英沐公司)与芯片杂交，加入稀释度为1∶1000的Cy3鼠二抗进行检测；荧光标记二抗(Cy3鼠二抗、Cy3人二抗，稀释度分别为1∶2000和1∶3000)与芯片直接杂交试验。其目的分别是为了确定蛋白探针与蛋白芯片片基的偶联情况以及荧光标记二抗与蛋白探针是否会有交叉反应。结果发现：

a)anti-His鼠单克隆抗体能够与偶联于蛋白芯片基片表面带有6×His标签的蛋白探针反应。由于不同蛋白之间的性质差异，虽然点样时探针蛋白浓度相同，但是每种蛋白探针的荧光信号强度却不相同。即便如此，各点仍然维持比较高的荧光信号强度，说明本发明人表达的蛋白探针与蛋白芯片片基的偶联情况是比较理想的(图8A)。

b)Cy3鼠二抗与蛋白探针几乎没有交叉反应(图8B)。

c)Cy3人二抗与H5，H7，H9蛋白探针有很小的交叉反应，和H1，H2，H3，NP蛋白探针几乎没有交叉反应(图8C)。

实施例5、鼠模拟血清与抗原芯片的杂交实验

1、不同亚型甲型流感病毒DNA疫苗免疫鼠血清与抗原芯片杂交

本组实验的目的是初步验证是否每一个蛋白探针都是可用的。根据实施例4“1”中所确定的杂交条件，以制备的鼠模拟血清样本与抗原芯片杂交。本组实验的预实验中，每只鼠血清的稀释度皆为1∶200，Cy3鼠二抗的稀释度为1∶2000。经过一系列的鼠血清稀释度优化的预实验，发现对于H1，H2，H5-HA+NP和H9的HA蛋白DNA疫苗鼠血清，1∶200的稀释度即可得到较强的特异性荧光信号；对于H7亚型，稀释度1∶20时出现较强的特异性信号。

图9为不同亚型甲型流感病毒DNA疫苗免疫鼠血清与抗原芯片杂交荧光信号图。其中，H1-HA，H2-HA，H5-HA+NP和H9-HA组的模拟鼠血清稀释度皆为1∶200；H3-HA和H7-HA组的模拟鼠血清稀释度为1∶20。其中，各组模拟鼠血清的杂交结果都显示比较好的特异性，相应蛋白探针都有较强的荧光信号值，而与无关探针反应的信号值都低至可忽略。本组实验的结论：

阵列于芯片表面的蛋白探针具有好的特异性，阳性信号有高的荧光值。

2、模拟鼠血清与抗原芯片浓度梯度杂交

为了确定芯片的品质以及片内的稳定性，本发明人做了鼠模拟血清的浓度梯度杂交实验。以H9亚型模拟血清为例，结果见图10。

由1∶800倍比稀释四个梯度的H9-HA血清与芯片杂交，得到的荧光信号值依然有很好的线性。

说明本发明人所制备的抗原芯片具有良好的片内稳定性。

实施例6、A/H1N1流感疫苗免疫人血清与抗原芯片的杂交

鼠模拟血清的实验结果显示本发明人研制的A型流感分亚型检测抗原芯片对于抗体成分较单一的血清样本具有较好的特异性，较高的灵敏度。为了进一步验证所研制的芯片在临床诊断上的应用前景，本发明人还做了模拟人血清的杂交试验。

本发明人所使用的样本为8份人免疫15μgA/H1N1流感病毒灭活疫苗后14天所采集的血清，提供者为华兰生物公司。人血清样本已经过HI实验的验证，编号a-i滴度依次为2560，2560，1280，1280，1280，640，640，10(单位：HI滴度)。本发明人所使用的人模拟血清经过了一次近期的疫苗免疫，可以模拟A/H1N1流感病毒感染急性恢复期的病人血清抗体水平的真实状况。以非免疫(non-immune)的人模拟血清为阴性对照，“0”表示不加血清，直接以二抗与芯片反应。

杂交时，人血清样本稀释倍数都是1∶200。杂交结果如图11所示，本发明人将阴性对照组信号品均值的二倍作为阳性信号的cut off值。所有8例样本(a-h)中，A/H1N1-HA1以及H5N1-NP蛋白探针点均有很强的阳性荧光信号，但是，HA探针点荧光信号强度与前期所测得的HI滴度之间并无相关性。而其他蛋白探针点则为阴性信号值或是较弱的阳性值，提示该样本的提供者前期有过相应亚型的甲型流感病毒的感染。其中，H2，H3，H9探针组均有三例血清出现阳性信号，提示该样本的提供者前期感染过相应亚型的甲型流感病毒。这与历史上我国A型流感流行吻合：H2亚型造成1957-1958亚洲流感；H3亚型为季节性流感的优势株；H9亚型的禽流感在中国禽类有较广泛流行并且有感染人的案例报道。未免疫疫苗对照样本A/H1N1-HA1、H3-HA1以及NP蛋白探针点相对于阴性对照可以判断为阳性信号，提示该样本的提供者前期感染过H1，H3亚型的甲型流感病毒。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种蛋白质芯片，其特征在于，所述的蛋白质芯片包括：

固相载体；以及

有序固定在所述固相载体上的蛋白质探针；

所述的蛋白质包括：甲型流感病毒H1亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H2亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H3亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H5亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H7亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H9亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H5亚型核蛋白NP；

其中，所述的甲型流感病毒H1亚型血凝素蛋白HA1来源于A/California/04/2009病毒株；

所述的甲型流感病毒H2亚型血凝素蛋白HA1来源于A/Adachi/2/1957病毒株；

所述的甲型流感病毒H3亚型血凝素蛋白HA1来源于A/Aichi/2/1968病毒株；

所述的甲型流感病毒H5亚型血凝素蛋白HA1来源于A/chicken/Henan/12/2004病毒株；

所述的甲型流感病毒H7亚型血凝素蛋白HA1来源于A/FPV/Rostock/1934病毒株；

所述的甲型流感病毒H9亚型血凝素蛋白HA1来源于A/chicken/Jiangsu/7/2002病毒株；和

所述的甲型流感病毒H5亚型核蛋白NP来源于A/chicken/Henan/12/2004病毒株。

2.如权利要求1所述的蛋白质芯片，其特征在于，所述的固相载体是盖玻片。

3.如权利要求1所述的蛋白质芯片，其特征在于，所述的蛋白质通过共价偶联蛋白修饰方法固定在醛基化的固相载体上。

4.如权利要求1所述的蛋白质芯片，其特征在于，所述的蛋白质芯片上还包括：阳性对照；和/或阴性对照。

5.如权利要求1所述的蛋白质芯片，其特征在于，所述的固相载体上，还包括隔栅，从而分隔形成2-50个独立的区域，每一区域固定有一组蛋白质探针，每一组蛋白质包括：甲型流感病毒H1亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H2亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H3亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H5亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H7亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H9亚型血凝素蛋白HA1，甲型流感病毒H5亚型核蛋白NP。

6.权利要求1-5任一所述的蛋白质芯片的用途，用于制备检测甲型流感病毒的试剂盒。

7.一种检测甲型流感病毒的试剂盒，其含有权利要求1-5任一所述的蛋白质芯片。

8.如权利要求7所述的检测甲型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中，还包括：抗IgG的第二抗体，其携带有可检测信号。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的可检测信号选自：Cy3、Cy5或FITC。

10.一种体外非诊断性地检测甲型流感病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)将待测样品加样于权利要求1-4任一所述的蛋白质芯片上，从而使待测样品中的甲型流感病毒血凝素蛋白HA1抗体或核蛋白NP抗体与固相载体上的蛋白质探针结合，形成带有“甲型流感病毒血凝素蛋白HA1抗体或核蛋白NP抗体-蛋白质探针”二元复合物的固相载体；

(2)将携带有可检测信号的抗IgG第二抗体加样于(1)的带有“甲型流感病毒血凝素蛋白HA1抗体或核蛋白NP抗体-蛋白质探针”二元复合物的固相载体，形成带有“第二抗体-甲型流感病毒血凝素蛋白HA1抗体或核蛋白NP抗体-蛋白质探针”三元复合物的固相载体；

(3)检测三元复合物中的可检测信号，确定待检测样品中甲型流感病毒血凝素蛋白HA1抗体或核蛋白NP抗体的存在与否、存在的量或存在位置，从而确定甲型流感病毒的存在与否、存在的量或存在的亚型。