CN107870236A - 用于快速定量检测羊血清中小反刍兽疫病毒抗体的检测卡 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于快速定量检测羊血清中小反刍兽疫病毒抗体的检测卡，包括检测卡外壳和装配在检测卡外壳内的试纸条，所述试纸条包括带压敏胶的塑料底板，在底板上依次粘贴样品垫、标记物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述标记物垫由载体基层和标记物组成，标记物为载体基层上喷涂镧系荧光检测微球和镧系荧光质控微球形成的一层膜，其特征在于：所述硝酸纤维素膜上包被小反刍兽疫病毒抗原为检测线，包被兔抗鸡lgY抗体为质控线，标记物为标记有小反刍兽疫病毒结构NH融合蛋白的重组抗原的荧光检测微球和标记鸡lgY抗体的荧光质控微球。本发明可实现小反刍兽疫病毒抗体现场快速定量检测，具有较高的实用价值和推广价值。

Description

用于快速定量检测羊血清中小反刍兽疫病毒抗体的检测卡
技术领域
本发明涉及一种检测卡及使用，特别是涉及一种用于快速定量检测羊血清中小反刍兽疫病毒抗体的检测卡。
背景技术
小反刍疫（Peste des Petits Ruminants，PPR），也称羊瘟、小反刍兽伪牛瘟、卡他肺炎、肺肠炎以及肺肠炎综合症，是由小反刍兽疫病毒（Peste des Peties RuminantsVirus, PPRV）引起的一种严重危害山羊、绵羊等小反刍类动物的传染病，山羊高度易感，且发病率和病死率均较高。PPR在世界上被认为是十分重要的烈性传染病之一，在我国也被列为一类动物传染病。
1942年，小反刍疫首次在西非的科特迪瓦报导，随后几年，尼日利亚、塞拉利昂和加纳等国均发生过此类病，近几年中非、东非、西亚以及南亚的许多国家均发现此种病传染。我国农业部2007年7月26日也发布在西藏自治区日土县发生小反刍疫情。对我国养羊业构成严重威胁。
小反刍兽疫病毒的基因组是单股负链、无节段RNA，其RNA链从3’端至5’端依次分布着N-P-M-F-H-L6个基因，编码6种结构蛋白（核蛋白（N）、磷蛋白（P）、多聚酶大蛋白（L）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）和血凝蛋白（H））和2种非结构蛋白（C和V）。
目前,尚无有效方法治疗小反刍兽疫,只能釆取疫苗接种,疫情发生后扑杀及加强定期血清抗体监测的方法控制该病。国内外最常见的报道是以纯化后的PPRV N、H蛋白(全长)或包含N蛋白主要抗原表位的部分重组片段作为包被抗原,也有以浓缩的PPRV全病毒作为包被抗原建立间接ELISA方法检测PPR血清抗体(邱文英,2011; Balamurugan et al.,2007),但尚未见到以N蛋白与N-H串联融合蛋白为抗原建立的双抗原夹心检测抗体方法的报道。
市面上小反刍兽疫病毒抗体胶体金快速检测卡，通过对样品的检测，即可粗略判断羊体内是小反刍疫病抗体含量，兽医根据检测结果判断是否需要注射小反刍疫病疫苗。
同样市场上也使用检测小反刍疫病抗体酶标试剂盒，但ELISA试剂盒需要酶标仪、温育反应条件、洗板条件，操作工作环境和专业技术人员，另外检测样本还需要复杂的前处理，如采集血液，分离血清等；而快速胶体金虽然检测方便，不需专业技术人员和工作环境，但其检测的灵敏度低，且只能定性，检测范围窄。
发明内容
本发明的目的就是提供一种用于快速定量检测羊血清中小反刍兽疫病毒抗体的检测卡，克服胶体金快速检测卡和酶标试剂盒各自缺点，通过简单的操作，实现在羊牧场现场快速、准确、高灵敏地定量检测，从而完全解决上述现有技术的不足之处。
本发明的目的通过下述技术方案来实现：
一种用于快速定量检测羊血清中小反刍兽疫病毒抗体的检测卡，包括检测卡外壳和装配在检测卡外壳内的试纸条，所述试纸条包括带压敏胶的塑料底板，在底板上依次粘贴样品垫、标记物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述标记物垫由载体基层和标记物组成，标记物为载体基层上喷涂镧系荧光检测微球和镧系荧光质控微球形成的一层膜，其特征在于：所述硝酸纤维素膜上包被小反刍兽疫病毒重组抗原为检测线，包被兔抗鸡lgY抗体为质控线，标记物为标记有小反刍兽疫病毒结构NH蛋白的重组抗原的荧光检测微球和标记鸡lgY抗体的荧光质控微球。
进一步，所述小反刍兽疫病毒重组抗原是小反刍兽疫病毒结构蛋白，其为多表位表达的重组蛋白。
进一步，所述小反刍兽疫病毒结构蛋白包含有小反刍兽疫病毒结构N蛋白的重组抗原以及小反刍兽疫病毒N和H融合蛋白的重组抗原。
进一步，所述硝酸纤维素膜上质控线采用的兔抗鸡lgY抗体为兔抗鸡lgY的lgG。
一种制备上述小反刍兽疫病毒结构蛋白的方法，采用生物信息学技术对小反刍兽疫病毒不同谱系毒株N和H抗原基因进行比对分析，设计合成小反刍兽疫病毒特异性N和N与H融合抗原基因，并将其连接入原核表达质粒pET-30a中。目的基因片段插入pET30a（+）的Nde I和XhoI识别位点间的片段（包括BamH I识别位点和Xho I识别位点在内的小片段），保持pET30a（+）的其它序列不变，得到的pET-30a-(N)和pET-30a-(NH)基因重组表达载体。构建小反刍兽疫病毒抗原基因重组表达质粒pET-30a-(N)和pET-30a-(NH)，然后将其转化大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）筛选重组表达菌，重组表达菌经IPTG诱导表达小反刍兽疫病毒N、H及N和H融合重组可溶性抗原。
一种制备上述小反刍兽疫病毒结构蛋白的方法，采用生物信息学技术原理，应用计算机对小反刍兽疫病毒的结构蛋白N、N与H抗原基因进行比对分析，及抗原表位预测，筛选和设计小反刍兽疫病毒特异性的抗原肽序列，并进行人工化学合成抗原肽。
一种上述检测卡的使用方法，所述检测卡为定量层析检测卡，将含有小反刍兽疫病毒抗体的待测液滴入检测卡的加样孔中，层析15分钟，然后使用层析扫描仪对检测卡进行扫描，层析扫描仪将扫描所得数据无线传输给客户端，客户端根据扫描数据计算得出检测卡上质控线和检测线的荧光信号强度值，同时客户端从云平台获得被检测小反刍兽疫病毒抗体的标准曲线，客户端根据标准曲线与质控线和检测线的荧光信号强度值的对照关系计算得出待测液中小反刍兽疫病毒抗体的含量。
作为优选，所述标准曲线是通过如下方式导入云平台的，首先制备一批检测卡，并配制对应的小反刍兽疫病毒抗体标准品，用检测卡层析标准品并用层析扫描仪检测，层析扫描仪将检测得到的数据处理传递给客户端，客户端计算得出标准品对应的检测线和质控线的荧光信号强度值，并根据此数据进行回归从而得到小反刍兽疫病毒抗体的标准曲线，客户端将标准曲线传输至云平台储存。
作为优选，所述客户端计算得出的标准曲线形成一个文件，并对应生成条形码，客户端通过扫描条形码可以从云平台提取该标准曲线。
名词解释：
兔抗鸡lgY的lgG：兔抗鸡lgY的免疫球蛋白G
鸡lgY抗体：鸡卵黄抗体
大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）：大肠杆菌表达系统最常用的宿主菌株,
IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：可实现小反刍兽疫病毒抗体现场快速定量检测，具有较高的实用价值和推广价值，采用多表位表达的重组蛋白可以防止漏检，提高检测在敏感度。
附图说明
图1是本发明的结构示意图；
图2是图1中试纸条的结构示意图；
图3是图2的俯视图；
图4是小反刍兽疫病毒抗体检测标准曲线；
图5是本发明检测卡的另一种结构示意图；
图6 是PCR扩增N与NH 基因的示意图，图中M为DNA Marker；1为N基因的PCR扩增结果；2为NH基因的PCR扩增结果；
图7是酶切鉴定pET-30a-(N)与pET-30a-(NH)质粒的示意图，图中M为DNA Marker；1为pET-30a-(N)的酶切鉴定结果；2为pET-30a-(NH)的酶切鉴定结果；
图8是 pET-30a-(N)-BL21(DE3)、pET-30a-(NH)-BL21(DE3)株菌种裂解液的示意图，图中M为蛋白Marker；1为阴性对照；2为pET-30a-(N)-BL21(DE3)株菌种裂解液；3为pET-30a-(NH)-BL21(DE3)株菌种裂解液。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。
如图1至图8所示，一种用于快速定量检测羊血清中小反刍兽疫病毒抗体的检测卡，包括装配在外壳10内的试纸条，所述试纸条包括带压敏胶的塑料底板1，在塑料底板1上从左至右依次粘贴样品垫2、标记物垫3、硝酸纤维素膜4和吸水纸5，且样品垫2的右端搭在标记物垫3的左端上，标记物垫3的右端搭在硝酸纤维素膜4的左端上，吸水纸5左端搭在硝酸纤维素膜4的右端上。所述硝酸纤维素膜4上包被小反刍兽疫病毒重组抗原为检测线6，包被兔抗鸡lgY抗体为质控线7，在外壳10上对应样品垫2开设加样孔11，对应硝酸纤维素膜4上的检测线6和质控线7开设视窗孔12。
所述小反刍兽疫病毒重组抗原是小反刍兽疫病毒结构蛋白，其为多表位表达的重组蛋白。所述小反刍兽疫病毒结构蛋白包含有小反刍兽疫病毒结构N蛋白的重组抗原，小反刍兽疫病毒结构H蛋白的重组抗原和小反刍兽疫病毒N和H融合蛋白的重组抗原。
所述硝酸纤维素膜4上质控线采用的兔抗鸡lgY抗体为兔抗鸡lgY的lgG。
所述标记物垫3由载体基层和标记物组成，标记物为标记有小反刍兽疫病毒结构N蛋白的重组抗原的荧光检测微球和标记鸡lgY抗体的荧光质控微球。
羊血样品中小反刍兽疫病毒抗体、小反刍疫N-H融合蛋白抗原的标记物和硝酸纤维素膜上包被小反刍兽疫病毒结构蛋白抗原是通过双抗原夹心法来检测羊血样本中小反刍兽疫病毒抗体。
作为一种优选技术方案，所述检测卡的外壳10表面对应吸水纸5的位置开设有多个通孔13，有利于溶剂挥发出外壳10，确保检测结果准确，解决了现有技术的检测卡外壳采用封闭结构，溶剂无法挥发出去的技术问题，参见图5。
为了保证挥发效果，在外壳10表面与吸水纸5大小相匹配的区域内等间距均匀开设通孔13。
作为另一种优选技术方案，所述检测卡本体倾斜固定在外壳10内，且样品垫2处于低端，吸水纸5处于高端。这种结构使得从加样孔11滴入的待测样品流速减缓，缓慢往上层析，保证足够的层析时间，能有效防止液体样品流动过快而影响检测结果，避免样品过快流入硝酸纤维素膜4导致检测结果失败。因为，如果待测样品流速过快，容易导致层析不充分，进而影响检测结果。检测卡本体倾斜的角度根据待测样品的不同具体进行设计。
作为层析检测卡的另一种优选结构，所述层析检测卡的外壳10内设有容纳槽，且在检测卡本体的两侧对称设有2个容纳槽，在容纳槽内安装有片状干燥剂。这种设计使得干燥剂与检测卡本体保持在一起，使得检测卡本体湿度得到有效控制，从而提高检测精度。
作为层析检测卡的另一种优选结构，还可以在层析检测卡的外壳10表面设置带盖的样品储存槽，可以封存样品。所述样品储存槽的盖顶面与外壳10表面齐平，盖上设有凹坑，方便使用者手指施力向外翻开盖。
实施例一、小反刍兽疫病毒N蛋白和NH融合蛋白的原核表达
步聚一、小反刍兽疫病毒抗原基因重组表达质粒pET-30a-(N)和pET-30a-(NH)的构建
根据NCBI网站小反刍兽疫病毒N基因（登录号为：ADX95989.1）与H基因（登录号为：ADX95995.1)，将N与H基因的目的序列优化为大肠杆菌偏爱密码子序列，并使用化学合成的方法分别合成了小反刍兽疫病毒的N与NH串联融合表达目的基因序列。将pET30a载体进行BamH I和Xho I双酶切，酶切体系为40μL：10×酶切缓冲液4μl，Ned I和Xho I各1μL，载体24μL，去离子水8μL，酶切产物经过1%的琼脂糖电泳后胶回收试剂盒回收。然后分别将酶切好的载体与扩增后的N或者NH编码基因序列进行连接，构建10μL的连接体系。其中，N或NH编码基因片段5.5μL，pET30a载体1.5μL，T4 DNA连接酶1μL，T4 DNA连接缓冲液2μL。轻敲管壁，上下颠倒混匀之后瞬离，放22℃连接仪中连接4 h。将重组质粒进行双酶切鉴定及目的片段序列测序分析，将测序鉴定为阳性的质粒命名为pET30a-N和pET30a-NH。
步骤二、重组大肠埃希氏菌pET-30a-(N)-BL21(DE3)株与pET-30a-(NH)-BL21(DE3)株的构建与N和NH重组蛋白的诱导表达
将pET30a-N与pET30a-NH连接产物分别转化进BL21(DE3)细胞中。无菌条件下，取适量BL21菌液加到LB（Kan+）固体培养基平板上，将菌液涂布均匀，待菌液完全吸收后，做好标记，倒置于37℃恒温培养箱中，静置培养16 h。挑取单克隆菌落分别进行菌液鉴定、酶切鉴定、菌液测序，确定N片段与NH片段分别转化进了pET30a载体中。取1ml重组大肠埃希氏菌pET-30a-(N)-BL21(DE3)株或者pET-30a-(NH)-BL21(DE3)株接种于100ml Kan+LB培养基中，同时用含有空质粒的pET-30a-BL21（DE3）株做为对照组，置37℃、以220r/min培养约150分钟，至OD600nm值达0.4～0.6。分别向试验组和对照组中加入终浓度为0.75mmol/ml量的IPTG，置16℃、以220r/min培养13小时。
步骤三、重组蛋白N与NH的纯化
取诱导后菌液60ml，以8000r/min离心10分钟，弃上清，收集菌体沉淀，用PBS（0.01mol/L，pH值7.4）洗菌体沉淀三次，以8000r/min离心10分钟，用6ml PBS（0.01mol/L，pH值7.4）重悬菌体沉淀，在150W功率的超声波的作用下冰浴裂解，有效时间为10分钟，工作时间为5秒，间隔5秒。将超声裂解物在2~8℃、以12000r/min离心15分钟，保留上清。使用Ni SepharoseTM 6 Fast Flow树脂对重组抗原进行纯化，用含有20mM咪唑的PBS缓冲液进行洗涤杂质，然后用含有500mM咪唑的PBS缓冲液进行洗脱纯化，并将镍柱纯化的目的蛋白样品通过GE公司生产的Superdex200凝胶柱分子筛进行进一步精细纯化，收集分子筛精细纯化后的收集液进行SDS凝胶电泳分析和纯度分析，其N与NH抗原纯度均可达95%以上。Western blot（免疫印迹试验）结果显示，重组蛋白N与NH能分别与小反刍兽疫病毒阳性血清发生特异性免疫反应。以此重组抗原作为检测用抗原。
实施例二、小反刍兽疫病毒结构蛋白N蛋白（PPRV-N）采用特异性合成肽制备抗原
一种制备上述小反刍兽疫病毒结构蛋白N蛋白的方法，包括以下步骤：
步骤一、对小反刍兽疫病毒结构蛋白N蛋白的序列分析：利用生物信息学MHC Ⅰ类分子预测：通过相关网站求证或应用计算机软件对PPRV-N蛋白序列分析，了解其亲水性、疏水性、结构域的可及性、序列的可变性、α螺旋、β转角、抗原性等参数，再综合分析及同源建模的方法预测其三级结构，从中预测出抗原反应表位及氨基酸残基，以多肽合成仪难易程度进行综合分析设计。每条多肽链至少含有一个预测的抗原表位，共设计出8个抗原表位多肽片段。
步骤二、 利用Protein Tec.公司（美国一家公司）的PS3型多肽合成仪，采用FMOC固相合成肽反应原理合成步骤一设计的抗原表位多肽片段，然后把多肽从FMOC树脂上切割下来，通过缩合反应再把多条多肽片段连接起来，最后用裂解液把侧链保护基团裂解下来，纯化就得到所合成的多肽，用Western blot实验确定小反刍兽疫病毒N蛋白。
用同样方法制备出小反刍兽疫病毒HN融合蛋白的多肽。
实施例五、制备小反刍兽疫病毒抗体的检测卡
制备小反刍兽疫病毒抗体检测标准曲线：配置含有小反刍兽疫病毒抗体的校准液（含小反刍兽疫病毒抗体标准品）6份，浓度分别为0、1/1024、1/256、1/64、1/16、1/4（小反刍兽疫病毒抗体标准品倍比稀释）。将上述不同浓度的校准液分别加入装配好的检测卡的加样孔内，层析15分钟后，通过层析扫描仪进行检测，将6次得到的检测结果由客户端处理，客户端计算出标准品对应的检测线和质控线的荧光信号强度值，并根据此数据进行线性回归做出小反刍兽疫病毒抗体的标准曲线，客户端将标准曲线传输至云平台储存，参见图4。
所述客户端计算得出的标准曲线形成一个文件，并对应生成条形码，客户端通过扫描条形码可以从云平台提取该标准曲线。
该检测卡的使用方法：将待检样品（以血清为例）与样品稀释液按1:50比例稀释，将稀释好的样本80ul加入加样孔11中，在吸水纸5的作用下，样本从样品垫2向吸水纸5方向移动。在避免强光照射的情况下层析15min，然后用层析扫描仪对检测卡进行检测，层析扫描仪获取检测线6和质控线7的荧光信号，层析扫描仪通过蓝牙把检测数据传到客户端，客户端根据检测数据计算出检测线的荧光信号强度值和质控线的荧光信号强度值，客户端通过扫描此批检测卡的条形码从云平台获得被检测小反刍兽疫病毒抗体的标准曲线，客户端根据标准曲线与质控线和检测线的荧光信号强度值的对照关系计算得出待测液中小反刍兽疫病毒抗体的含量，参见图4的标准曲线。客户端可以为手机或平板电脑。
上述检测卡的制备方法如下：
步骤一，把硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板上，采用点膜喷金专用机器在硝酸纤维素膜上喷涂已稀释至0.5mg/ml的羊抗鸡lgY的lgG形成质控线和已稀释至0.5mg/ml的小反刍兽疫病毒结构蛋白N和H的重组蛋白形成检测线，喷量为1μl/cm，然后在37℃的温度下烘制8小时；
步骤二，制备标记有鸡lgY的镧系荧光微球和标记有小反刍兽疫病毒N-H融合蛋白的重组抗原的镧系荧光微球，将1mL的镧系荧光微球加入到50mg的MES（2-（N-吗啡啉）乙磺酸）缓冲液（0.1M，pH7.0）中，再加入10mg碳二亚胺（EDC）和10mg N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐搅拌溶解，室温反应30分钟后进行离心操作，将离心沉淀物用50mM硼酸缓冲液（pH8.2）复溶，加入2mg透析过的鸡lgY，在室温条件下搅拌反应24小时，然后离心、封闭后，再在稀释液中保存（保存环境温度为2～8℃），即得标记有鸡lgY的镧系荧光微球；采用上述同样的方法标记小反刍兽疫病毒NH融合蛋白的重组抗原的镧系荧光微球；
步骤三，把标记有鸡lgY和标记有小反刍兽疫病毒NH融合蛋白的重组抗原的镧系荧光微球并分别稀释至浓度0.1μg/ml和3μg/ml，采用点膜喷金机器将其喷涂在载体基层上构成标记垫，喷量为2.5 μl/cm，然后在37℃的温度下烘制8小时；
步骤四，把样品垫、标记垫、吸水纸依次粘在PVC底板上，组装成大卡，再用剪切机切割成5mm宽的试纸条，装配在检测卡外壳内，即得到本小反刍兽疫病毒抗体检测卡。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于快速定量检测羊血清中小反刍兽疫病毒抗体的检测卡，包括检测卡外壳和装配在检测卡外壳内的试纸条，所述试纸条包括带压敏胶的塑料底板，在底板上依次粘贴样品垫、标记物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述标记物垫由载体基层和标记物组成，标记物为载体基层上喷涂镧系荧光检测微球和镧系荧光质控微球形成的一层膜，其特征在于：所述硝酸纤维素膜上包被小反刍兽疫病毒重组抗原为检测线，包被兔抗鸡lgY抗体为质控线，标记物为标记有小反刍兽疫病毒结构NH融合蛋白的重组抗原的荧光检测微球和标记鸡lgY抗体的荧光质控微球。
2.根据权利要求1所述的用于快速定量检测羊血清中小反刍兽疫病毒抗体的检测卡，其特征在于：所述小反刍兽疫病毒重组抗原是小反刍兽疫病毒结构蛋白，其为多表位表达的重组蛋白。
3.根据权利要求2所述的用于快速定量检测羊血清中小反刍兽疫病毒抗体的检测卡，其特征在于：所述小反刍兽疫病毒结构蛋白包含有小反刍兽疫病毒结构N蛋白的重组抗原以及小反刍兽疫病毒N和H融合蛋白的重组抗原。
4.根据权利要求1所述的用于快速定量检测羊血清中小反刍兽疫病毒抗体的检测卡，其特征在于：所述硝酸纤维素膜上质控线采用的兔抗鸡lgY抗体为兔抗鸡lgY的lgG。
5.一种制备权利要求2或3或4中所述制备小反刍兽疫病毒结构蛋白的方法，其特征在于：采用生物信息学技术对小反刍兽疫病毒不同谱系毒株N和H抗原基因进行比对分析，设计合成小反刍兽疫病毒特异性N、和N与H融合抗原基因，并将其连接入原核表达质粒pET-30a中，构建小反刍兽疫病毒抗原基因重组表达质粒pET-30a-(N)和pET-30a-(NH)，然后将其转化大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）筛选重组表达菌，重组表达菌经IPTG诱导表达小反刍兽疫病毒N及N和H融合重组的可溶性抗原。
6.一种制备权利要求2或3或4中所述制备小反刍兽疫病毒结构蛋白的方法，其特征在于：采用生物信息学技术原理，应用计算机对小反刍兽疫病毒的结构蛋白N和N与H抗原基因进行比对分析，及抗原表位预测，筛选和设计小反刍兽疫病毒特异性的抗原肽序列，并进行人工化学合成抗原肽。
7.一种权利要求1或2或3或4所述检测卡的使用方法，其特征在于： 所述检测卡为定量层析检测卡，将含有小反刍兽疫病毒抗体的待测液滴入检测卡的加样孔中，层析15分钟，然后使用层析扫描仪对检测卡进行扫描，层析扫描仪将扫描所得数据无线传输给客户端，客户端根据扫描数据计算得出检测卡上质控线和检测线的荧光信号强度值，同时客户端从云平台获得被检测小反刍兽疫病毒抗体的标准曲线，客户端根据标准曲线与质控线和检测线的荧光信号强度值的对照关系计算得出待测液中小反刍兽疫病毒抗体的含量。
8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于：所述标准曲线是通过如下方式导入云平台的，首先制备一批检测卡，并配制对应的小反刍兽疫病毒抗体标准品，用检测卡层析标准品并用层析扫描仪检测，层析扫描仪将检测得到的数据处理传递给客户端，客户端计算得出标准品对应的检测线和质控线的荧光信号强度值，并根据此数据进行回归从而得到小反刍兽疫病毒抗体的标准曲线，客户端将标准曲线传输至云平台储存。
9.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于：所述客户端计算得出的标准曲线形成一个文件，并对应生成条形码，客户端通过扫描条形码可以从云平台提取该标准曲线。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110501505A (zh) * 2018-05-18 2019-11-26 中国兽医药品监察所 小反刍兽疫诊断试剂盒
CN110894215A (zh) * 2019-12-16 2020-03-20 中国农业大学 一种小反刍兽疫病毒抗原以及检测小反刍兽疫病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡
CN111505289A (zh) * 2020-06-08 2020-08-07 北京中海生物科技有限公司 小反刍兽疫检测试剂盒
CN111751553A (zh) * 2020-06-19 2020-10-09 中国农业科学院兰州兽医研究所 小反刍兽疫病毒H蛋白抗体iELISA检测方法及应用
CN115926002A (zh) * 2022-12-29 2023-04-07 北京亿森宝生物科技有限公司 一种检测小反刍兽疫病毒的试剂盒及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104341490A (zh) * 2014-10-10 2015-02-11 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 小反刍兽疫病毒重组蛋白抗原及其抗体快速检测试纸条
CN205374469U (zh) * 2016-01-21 2016-07-06 成都微瑞生物科技有限公司 猪蓝耳病毒抗体检测卡
CN107238702A (zh) * 2017-06-22 2017-10-10 中国动物疫病预防控制中心 检测小反刍兽疫病毒抗体的酶联免疫试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104341490A (zh) * 2014-10-10 2015-02-11 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 小反刍兽疫病毒重组蛋白抗原及其抗体快速检测试纸条
CN205374469U (zh) * 2016-01-21 2016-07-06 成都微瑞生物科技有限公司 猪蓝耳病毒抗体检测卡
CN107238702A (zh) * 2017-06-22 2017-10-10 中国动物疫病预防控制中心 检测小反刍兽疫病毒抗体的酶联免疫试剂盒

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110501505A (zh) * 2018-05-18 2019-11-26 中国兽医药品监察所 小反刍兽疫诊断试剂盒
CN110501505B (zh) * 2018-05-18 2022-06-10 中国兽医药品监察所 小反刍兽疫诊断试剂盒
CN110894215A (zh) * 2019-12-16 2020-03-20 中国农业大学 一种小反刍兽疫病毒抗原以及检测小反刍兽疫病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡
CN111505289A (zh) * 2020-06-08 2020-08-07 北京中海生物科技有限公司 小反刍兽疫检测试剂盒
CN111751553A (zh) * 2020-06-19 2020-10-09 中国农业科学院兰州兽医研究所 小反刍兽疫病毒H蛋白抗体iELISA检测方法及应用
CN115926002A (zh) * 2022-12-29 2023-04-07 北京亿森宝生物科技有限公司 一种检测小反刍兽疫病毒的试剂盒及其应用
CN115926002B (zh) * 2022-12-29 2023-12-12 北京亿森宝生物科技有限公司 一种检测小反刍兽疫病毒的试剂盒及其应用

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